第三章 材料與方法
3.8 免疫組織化學染色(Immunohistochemistry stain)步驟：
3.8.1 PCNA 免疫組織化學染色步驟：
6. 於檢體上滴”Endogenous enzyme block, Dako”數滴，靜置 12 分鐘 後，再以Wash solution 沖洗玻片 2 次、各 2 分鐘。
7. 於檢體上滴”PCNA Primary antibody, Abcam” (以 Dako primary antibody diluent 稀釋 1300 倍)數滴，靜置 30 分鐘後，再以 wash solution 沖洗玻片 2 次、各 2 分鐘。
8. 於檢體上滴“Peroxidase labelled polymer, Dako”數滴，靜置 30 分鐘 後，再以wash solution 沖洗玻片 2 次、各 2 分鐘。
8.5)中和 2 次、各 5 分鐘。
5. 以 Wash solution 沖洗並覆蓋檢體 2 分鐘，此步驟重複兩次。
6. 於檢體上滴”Endogenous enzyme block, Dako”數滴，靜置 12 分鐘 後，再以Wash solution 沖洗玻片 2 次、各 2 分鐘。
7. 於檢體上滴”BrdU Primary antibody, Zymed” (以 Dako primary antibody diluent 稀釋 50 倍)數滴，靜置 60 分鐘後，再以 wash solution 沖洗玻片2 次、各 2 分鐘。
8. 於檢體上滴“Peroxidase labelled polymer, Dako”數滴，靜置 30 分鐘 後，再以wash solution 沖洗玻片 2 次、各 2 分鐘。
9. 於檢體上滴“DAB+, Dako”(以 Dako DAB+ substrate 稀釋 500 倍)數 滴，避光靜置約5 分鐘後，再以 DDW 沖洗玻片。
10. 檢體上滴 Hematoxylin 數滴，靜置約 5 分鐘後再以清水沖洗玻片。
11. 待檢體完全乾燥後再置入 xylene 中脫水。
12. 隨後以阿拉伯膠進行封片[62,64]。 3.9 血清生化值檢測：
經頸靜脈取得之血液於 4 ℃離心機中離心兩次，取得上清液後以 COBAS MIRA PLUS 自動生化分析儀搭配 ROCHE 試劑進行分析。
3.10 肝質量評估方法：
動物稱重、麻醉、採血與犧牲後，打開腹腔，摘取肝臟。肝臟取出 後，清除多餘組織，經生理食鹽水沖洗，擦乾後稱取肝重。殘餘肝重 比率以下列公式計算：
肝重/體重比率(liver/body weight ratio) = 殘餘肝重 / 體重 3.11 細胞計數規則：
經PCNA 或 BrdU 染色之檢體皆於 400 倍顯微鏡下觀察。隨機選取
相近之視野，並以肉眼觀察計數。BrdU 陽性細胞呈現出暗褐色細胞 核，而PCNA 陽性細胞依染色程度不同的分期標準如下：
G0期細胞之細胞核與細胞質無染色；G1 期細胞之細胞核為片狀至 均勻的淡褐色染色，細胞質則無染色；S 期細胞之細胞核為均勻的暗 褐色染色，細胞質亦無染色；G2 期細胞有瀰漫且斑點狀之細胞核與 細胞質染色；M 期細胞有瀰漫之細胞質染色[17]。
3.11.1 PCNA LI 計數：
PCNA LI(labeling index)：是專注於 S 期肝細胞數目的計數方式，
即以染有暗褐至黑色細胞核且無細胞質染色的肝細胞數量除以總肝 細胞數目 (每一檢體至少計數 1000 顆肝細胞) [17]。
3.11.2 PCNA GF 計數：
PCNA GF(growth fraction)：用於評估正處於細胞週期中的肝細胞 數，即以所有染上顏色細胞核的肝細胞(G1+S+G2+M 期)數目除以總 肝細胞數目 (每一檢體至少計數 1000 顆肝細胞) [17]。
3.11.3 BrdU LI 計數：
BrdU LI(labeling index)：即以所有染上暗褐色細胞核的肝細胞(S 期) 數目除以總肝細胞數目(每一檢體至少計數 1000 顆肝細胞)。
3.12 統計方法：
實驗數據以 SAS 軟體執行統計，以 ANOVA 進行變異數分析，以 Bonferroni (Dunn) t Tests 進行事後檢定。結果以雙尾 P<0.05 設為具統 計意義。其中於肝重/體重比、PCNA GF、PCNA LI 與 BrdU LI 中比 較各組間的差異，而於血清學檢查中僅比較各組與對照組間的差異。
第四章 結果
4.1 存活率：
實驗動物存活率 80.0 %，手術死亡數與各組死亡數列於下表(表 4.1)(表 4.2)，其中術後死亡 2 例皆於手術後一天之內。
4.2 肝重/體重比結果：
肝重/體重比是最直接也最普遍被使用來評估肝再生的方法。大鼠 經過 2/3 部分肝切除之後，約在 7~10 天時便能以代償式再生的方式 來恢復大部份的肝質量。
從本次實驗結果看來，部分肝切除 3 小時後，對照組、Silymarin 組與四物湯組的肝重/體重比基本相同，無顯著差異。但四君子湯組 則較對照組略低，且達統計意義(表 4.3)(圖 4.1)。
部分肝切除72 小時後，Silymarin 組與四君子湯組之肝重/體重比明 顯較對照組、四物湯組為高，但各組間的差異尚未達統計意義(表 4.3)(圖 4.2)。
部分肝切除 168 小時後，四君子湯組肝重/體重比最高，與對照組 間雖無顯著差異，但與 Silymarin 組和四物湯組間的差異則具有統計 意義(表 4.3)(圖 4.3)。餘肝檢體圖列於(圖 4.4)。
表4.1 手術死亡數
3 小時 72 小時 168 小時
術前死亡數 0 1 1
術中死亡數 5 8 7
術後死亡數 0 1 1
總計 5/40 10/40 9/40
表4.2 各組死亡數
3 小時 72 小時 168 小時
偽實驗組 0 0 0
對照組 0 2 2
Silymarin 組 1 3 2
四君子實驗組 2 1 3
四物湯組 2 4 2
表4.3 肝重/體重比
3 小時 72 小時 168 小時**
僞實驗組 4.3769 ± 0.00 * 3.9148 ± 0.38 3.1447 ± 0.33 ** # 對照組 1.3832 ± 0.00 * 2.6516 ± 0.54 3.1512 ± 0.39 ** # Silymarin 組 1.1831 ± 0.00 * 3.2979 ± 0.70 2.9025 ± 0.24 ** # 四君子湯組 1.0974 ± 0.00 * 3.1783 ± 0.32 3.5777 ± 0.55 ** # 四物湯組 1.2387 ± 0.00 * 2.7086 ± 0.40 2.9151 ± 0.27 #
**
肝重/體重比之數值表示為平均值±標準差；*：四君子湯組與對照組相較 p <
0.05；**：四君子湯組與 Silymarin 相較 p < 0.05；#：四君子湯組與四物湯組相 較p < 0.05
3小時
Shame Control Silymarin 四君子湯 四物湯
liver/body wt (%)
圖4.1 部分肝切除後 3 小時之肝重/體重比
Shame Control Silymarin 四君子湯 四物湯
liver/body wt (%)
圖4.2 部分肝切除後 72 小時之肝重/體重比
Shame Control Silymarin 四君子湯 四物湯
liver/body wt (%)
圖4.3 部分肝切除後 168 小時之肝重/體重比
*
** #
(A) (B)
(C) (D)
(E) (F)
(G) (H)
圖 4.4 餘肝葉檢體。3 小時：(A)對照組；(B)Silymarin 組；(C)四君子湯組；
(D)四物湯組。72 小時：(E)對照組；(F)Silymarin 組；(G)四君子湯組；(H)四物 湯組。168 小時：(I)對照組；(J)Silymarin 組；(K)四君子湯組；(L)四物湯組。
(I) (J)
(K) (L)
圖4.4 (續)
4.3 PCNA 增殖標誌結果：
實驗的結果發現，部分肝切除後 3 小時，四君子組之 PCNA GF 亦 較對照組與其他各組為低，但各組間皆未達統計意義(表 4.4)(圖 4.5)。
部分肝切除後 72 小時，四君子組之 PCNA GF 最高，但與對照組和 Silymarin 間並無統計意義。相對地，四物湯組於部分肝切除後 72 小 時之PCNA GF 較低，但僅與四君子湯組相較有達統計意義(表 4.4)(圖 4.6)。部分肝切除後 168 小時，四君子組之 PCNA GF 最高，而四物 湯組與 Silymarin 組較對照組為低，但皆未達統計之意義(表 4.4)(圖 4.7)。
PCNA LI (labeling index) 用於評估處於 S 期肝細胞數目的計數方 式。即在400 倍顯微放大下觀察，並以染有暗褐至黑色細胞核且無細 胞質染色的肝細胞數量除以總肝細胞數目(每一檢體之總肝細胞數至 少1000 顆肝細胞)。
實驗的結果發現，部分肝切除後 3 小時，對照組、Silymarin 組、
四君子組與四物湯組之 PCNA LI 相近，四君子組雖略低，但各組間 的差異尚未達統計意義(表 4.5)(圖 4.8)。部分肝切除後 72 小時，四君 子組、四物湯組與 Silymarin 組之 PCNA LI 皆較對照組為高，其中又 以四君子湯組最高，但各組間之差異依然未達統計之意義(表 4.5)(圖 4.9)。部分肝切除後 168 小時，四君子組之 PCNA LI 最高，Silymarin 組次之，對照組第三，而四物湯組則較對照組為低，但皆未達統計之 意義(表 4.5)(圖 4.10)。部分肝切除後之 PCNA IHC 染色列於後(圖 4.11)。
表4.4 PCNA GF (Groth Fraction)
3 小時 72 小時 168 小時 僞實驗組 54.90% ± 19.26% 61.66% ± 9.33% # 29.23% ± 15.30%
對照組 20.53% ± 14.87% 59.68% ± 7.32% # 32.68% ± 26.86%
Silymarin 組 20.18% ± 18.05% 61.09% ± 6.44% # 24.60% ± 20.52%
四君子湯組
05.51% ± 03.43%
70.35% ± 8.61% # 50.07% ± 19.26%四物湯組 19.09% ± 14.75% 49.31% ± 7.91% # 21.00% ± 18.40%
PCNA GF 之數值表示為平均值±標準差；#：四君子與四物湯組相較 p < 0.05
表4.5 PCNA LI (Labeling Index)
3 小時 72 小時 168 小時 僞實驗組 3.07% ± 1.83% 3.23% ± 3.84% 1.31% ± 1.74%
對照組 0.73% ± 1.49% 1.95% ± 0.67% 0.87% ± 0.92%
Silymarin 組 0.36% ± 0.54% 3.13% ± 1.45% 0.99% ± 1.71%
四君子湯組 0.20% ± 0.32% 3.87% ± 2.62% 1.76% ± 1.04%
四物湯組 0.47% ± 0.69% 2.65% ± 1.98% 0.21% ± 0.16%
PCNA LI 之數值表示為平均值±標準差
3小時
3小時
0%
2%
4%
6%
8%
Sham 對照組 Silymarin 四君子湯 四物湯
PCNA LI
圖4.8 部分肝切除後 3 小時之 PCNA LI 值
72小時
0%
2%
4%
6%
8%
Sham 對照組 Silymarin 四君子湯 四物湯
PCNA LI
圖4.9 部分肝切除後 72 小時之 PCNA LI 值
168小時
0%
2%
4%
6%
8%
Sham 對照組 Silymarin 四君子湯 四物湯
PCNA LI
圖4.10 部分肝切除後 168 小時之 PCNA LI 值
(A) (B)
(C) (D)
(E) (F)
(G) (H)
圖4.11 部分肝切除後之 PCNA IHC 染色。3 小時：(A)對照組；(B)Silymarin 組；(C)四君子組；(D)四物湯組。72 小時之 PCNA IHC 染色：(E)對照組；
(F)Silymarin 組；(G)四君子組；(H)四物湯組。168 小時之 PCNA IHC 染色：(I) 對照組；(J)Silymarin 組；(K)四君子組；(L)四物湯組。(200X)
S
M S
G0
G1 G2
S
G2
G0 G0
M
G1
(I) (J)
(K) (L)
圖4.11 (續)
4.4 BrdU 增殖標誌結果：
BrdU LI(labeling index) 與 PCNA LI (labeling index)類似，皆用於評 估處於S 期肝細胞數目的計數方式。即在 400 倍顯微放大下觀察，並 以染有暗褐至黑色細胞核的肝細胞數量除以總肝細胞數目(每一檢體 之總肝細胞數至少 1000 顆肝細胞)。
實驗的結果發現，部分肝切除後 3 小時，對照組、Silymarin 組、
四君子湯組與四物湯組之 BrdU LI 相近，差異並未達統計意義(表 4.6)(圖 4.12)。部分肝切除後 72 小時，四君子組、四物湯組與 Silymarin 組之BrdU LI 皆較對照組為高，其中四君子組最高，但各組間之差異 尚未達統計之意義(表 4.6)(圖 4.13)。部分肝切除後 168 小時，四君子 組之BrdU LI 最高，四物湯組次之，對照組最低，但各組相較仍未達 統計意義(表 4.6)(圖 4.14)。部分肝切除後之 BrdU IHC 染色列於後(圖 4.15)。
表4.6 BrdU LI (Labeling Index)
3 小時 72 小時 168 小時 僞實驗組 0.02% ± 0.03% 0.10% ± 0.14% 0.02% ± 0.03%
對照組 0.01% ± 0.02% 0.30% ± 0.30% 0.02% ± 0.03%
Silymarin 組 0.01% ± 0.01% 0.56% ± 0.36% 0.05% ± 0.05%
四君子湯組 0.00% ± 0.00% 1.04% ± 0.76% 0.10% ± 0.08%
四物湯組 0.01% ± 0.01% 0.87% ± 0.86% 0.09% ± 0.07%
BrdU LI 之數值表示為平均值±標準差
3小時
0 0.4 0.8 1.2
Sham 對照組 Silymarin 四君子湯 四物湯
BrdU LI (%)
圖4.12 部分肝切除後 3 小時之 BrdU LI 值
72小時
0 0.4 0.8 1.2 1.6
Sham 對照組 Silymarin 四君子湯 四物湯
BrdU LI (%)
圖4.13 部分肝切除後 72 小時之 BrdU LI 值
168小時
0 0.4 0.8 1.2
Sham 對照組 Silymarin 四君子湯 四物湯
BrdU LI (%)
圖4.14 部分肝切除後 168 小時之 BrdU LI 值
(A) (B)
(C) (D)
圖 4.15 部分肝切除後之 BrdU IHC 染色。3 小時：(A)對照組；(B)Silymarin 組；(C)四君子組；(D)四物湯組。72 小時之 BrdU IHC 染色：(E)對照組；
(F)Silymarin 組；(G)四君子組；(H)四物湯組。168 小時之 BrdU IHC 染色：(I) 對照組；(J)Silymarin 組；(K)四君子組；(L)四物湯組。(200X)
(E) (F)
(G) (H)
(I) (J)
(K) (L)
圖4.15 (續)
4.5 血清生化值檢測結果：
4.5.1 GOT 與 GPT：
GOT 與 GPT 是血液中的兩種轉氨酶。GOT 可存在於肝臟以外的組 織，而 GPT 的專一性較高，主要存在於肝細胞之中。因此，如肝炎、
心肌梗塞、肌肉發炎或溶血等都可能導致 GOT 的上升，而 GPT 上升 便可能是肝臟疾病所導致。
由實驗結果發現，部分肝切除後 3 小時時，四君子組與對照組相 近，而四物湯組與 Silymarin 組之 GOT 較對照組為低，但各組與對照 組間並未達統計意義。部分肝切除後 72 小時，四君子組、四物湯組 與Silymarin 組之 GOT 均較對照組為高，且各組與對照組間亦無統計 意義。於部分肝切除168 小時，各組與對照組相近，且無顯著的差異 (表 4.7)(圖 4.16)。
相似的，部分肝切除後 3 小時，Silymarin 組、四君子組與四物湯 組之GPT 較對照組為低，但未達統計意義。而於部分肝切除後 72 小 時與肝再生末期之 168 小時時，各組與對照組間的 GPT 相近，亦無 顯著差異(表 4.8)(圖 4.17)。
4.5.2 白蛋白(Albumin)和球蛋白(Globulin)：
血中蛋白濃度可顯示出肝臟疾病和身體的營養狀態，而在血液中的 主要蛋白為白蛋白(albumin)和球蛋白(globulin)。白蛋白主要功能是維 持血液的滲透壓，而球蛋白則與身體的免疫和物質運送有關。一般來 說，白蛋白的含量會高於球蛋白，但若因肝功能不佳而無法製造足夠 的白蛋白，或因發炎而使免疫球蛋白增加時，將使得白蛋白的含量低 於球蛋白的含量。
由實驗結果可知，除了 3 小時時各組的差異較大之外，於 72 小時 與168 小時時各組間的差異基本上不大。其中四君子湯組與四物湯組 於部分肝切除後3 小時時白蛋白較對照組為低，其中四君子湯組具統
計意義。而於72 小時與 168 小時時，各組與對照組間之白蛋白含量 已無顯著差異(表 4.9)(圖 4.18)。
在球蛋白方面，部分肝切除後 3 小時與 72 小時時，各組間之差異 並不大，其中四君子湯與四物湯組均較對照組為低，但未達統計意 義。而於部分肝切除後 168 小時，Silymarin 組、四君子湯與四物湯 組之球蛋白均較對照組稍高，其中四君子湯與對照組間之差異有達統 計意義(表 4.10)(圖 4.19)。
總蛋白質方面，3 小時時各組的差異較大，四君子湯組與四物湯 組均較對照組間為低，其中四君子湯組與對照組之差異達統計意
總蛋白質方面，3 小時時各組的差異較大，四君子湯組與四物湯 組均較對照組間為低，其中四君子湯組與對照組之差異達統計意