第二章 文獻探討
2.4 再生標誌
2.4.1 肝重
對於肝再生實驗，測量殘餘肝重可說是最直接的評估方法。常見的 評估公式有：
1. 殘餘肝重體重百分比 = 殘餘肝重 / 體重[3]
2. 佔最初肝重百分比 = A / E[15]
A= 犧牲時的殘餘肝重
E= 部分肝切除前的全肝重 = 部分肝切除時切除的肝重/0.636 然而，實際上肝臟的重量會受到許多內在及外在因素所影響，因此 僅僅由肝重改變率來評估肝細胞的再生程度往往是不足的[16]。 2.4.2 PCNA 增殖標記
如前述的原因，為了更精確地標定出肝臟中處於增殖階段的細胞，
科學界最初便利用 3H-thymidine 來評估肝細胞的再生能力，但因其可 能 具 有 肝 內 與 肝 外 分 流(shunting) 作用 ，以 及 接觸 放 射性 同 位素 (radioisotopes)的不便等因素，使得 3H-thymidine 在使用上有所限制
[11]。
而增殖細胞核抗原(PCNA, Proliferating cell nuclear antigen)是一種 內源性核蛋白(endogenous nuclear protein)，常被用來確認人類和鼠類 組織的複製細胞(replicating cells)[17]。PCNA 的氨基酸序列在老鼠和人 類之間僅有四個殘基(residues)的不同，這顯示出其高度保守的分子特 性(highly conserved molecule)[17]。PCNA 蛋白的命名起因於它在高度 分裂活性細胞的細胞核中被發現，而其最初被視為系統性紅斑性狼瘡
(systemic lupus erythematosis)患者血清中的一種自體抗原[18]。
在具有增殖細胞的組織中可辨認出 PCNA 陽性細胞，例如淋巴結 的生發中心、腸上皮細胞、基底細胞、皮膚的鱗狀上皮細胞和精原細 胞(spermatogonia)等[19]。並經由免疫組織化學染色法染色之 PCNA 陽 性 細 胞 亦 可 顯 示 出 細 胞 核 與 一 部 分 細 胞 質 的 免 疫 反 應 活 性 (immunoreactivity)[20]，而其不同染色強度亦具有細胞週期的特異性。
因此，偵測 PCNA 表現用於定量肝細胞增殖是個可靠的(reliable)辦 法，並能藉以進行細胞動力學的研究[21]。 不需任何預處理步驟，且避免致畸胎劑(teratogenic agent)的使用[22]。 另外，不僅可由新鮮的檢體快速地獲得實驗結果，PCNA 的免疫染色 技術亦可用於檔案材料(archival material)的研究，從而用於回顧性研 究(retrospective studies)的執行[14,17]。由於可由 各個細 胞週期 獲得 Growth fraction 的結果，因此可獲得更多的增殖資訊[17]。
然而其缺點則包括染色強度的變異性、長達 20 小時的半衰期[14]， 以及不適用於緩慢變化的組織(slow turnover tissue)[17]。對於增殖活性 高的組織與型態較小的細胞而言，要利用 PCNA 來明確區分出 S 期 與非S 期之增殖細胞亦是困難的以及不準確的[20]。另外，PCNA 也參 與DNA 之修復，因此 PCNA 表現細胞並不一定處於細胞週期之狀態
下[20]。
2.4.3 BrdU 增殖標記
雖然測量分裂中細胞(mitotic figures)數目來評估細胞增殖是最傳統 也最簡單的方法，然而要精確測量出有絲分裂指數(mitotic index)卻不 是那麼容易[23]。並且在細胞週期中，屬於 DNA 合成的 S 期佔了較長 的時間，理論上以此作為標記指數(labeling index, LI)應能更精確地測 量，因此利用嘧啶的修飾類似物於體內試驗中(in vivo)標記 DNA 一 直以來就是黃金標準[20]。然而，雖然tritiated thymidine 最早曾廣泛地 被做為這個指數的測量方法，但現已多被BrdU 所取代[23]。
與PCNA 屬於內源性(endogenous)細胞複製標記相較，BrdU 屬於一 種外源性(exogenous)之細胞複製標記[24]，結構上則為一種 thymidine 的鹵化衍生物(halogenated derivative)[20]。因為是外源性的標記，因此 BrdU 須經腹腔注射(IP)的脈衝式方式(pulse-label)或經滲透泵(osmotic pumps)的連續標記方式(continuous-label)運用於實驗動物之上[20]。由 於 BrdU 為 thymidine 類似物，因此其可於 DNA 合成期間(S 期)併入 不適合存檔之材料(archival material)。另外，BrdU 也參與了 DNA 的 修復步驟。而由於 BrdU 為一致突變劑(mutagen)，因此並不適於基因 毒理學(genetic toxicology)試驗。
此外，客觀計數是困難的，並容易造成結果上的誤差[20,23,25]。有鑒 於此，以自動化影像分析系統評估 BrdU 陽性細胞數早在 1977 年就 已被提出，至今也已逐漸發展出穩定且能精確計數與區分細胞型態的 分析能力。而如何提升自動化分析系統計算增殖細胞的精確度，區分 增值與炎症細胞，並利用自動化分析來取代枯燥及傷眼(eye-strain)的
計數過程則是未來努力的目標[26]。另外，利用墨點法(Dot blot)偵測 BrdU 來取代傳統 IHC 之 BrdU LI 法評估細胞增殖力，亦具有快速、
效率高與可靠的結果[25]。 2.5 四君子湯與四物湯
在中醫的理論中，氣者，屬陽，主生氣蓬勃與溫煦也；血者，屬陰，
主物質增長與潤澤也。因此，氣與血和個體的生存發育可說是息息相 關的。其中，四君子湯為臨床常用的補氣中醫藥方劑，一般用於治療 陽虛氣弱、飲食少思、體瘦面黃等方面[27]。而四物湯則為臨床常用的 補血中醫藥方劑，為補血調經的基礎方劑[28]。
2.5.1 四君子湯
四君子湯出自《和劑局方》，其組成為甘草、白朮、茯苓與人參。《醫 方集解》稱其主治一切脈來細軟、陽虛氣弱、脾衰肺損、飲食少思、
體瘦面黃、皮聚毛落[27]。張璐曰：甘溫益胃，有健運之功，具沖和之 德，故為君子。人生以胃氣為本，胃旺則五臟受蔭，而胃氣傷則百病 叢生。故凡病久虛不癒，諸藥不效者，用四君子湯隨證加減，先培中 土，使藥氣四達，機運流通，水穀精微敷布，則何患其藥之不效哉[29]！ 因此四君子湯臨床常運用於因脾胃氣虛引起的營養不良、浮腫、腸 炎、出血等疾病，並為氣血虛弱的基礎方劑。例如久病氣虛體弱，可 用本方加桂枝、附子；而脾虛濕盛，可用本方加澤瀉、牡蠣、桂枝；
脾虛浮腫，可用本方加苡仁、澤瀉、桂枝；脾虛失統之出血，可用本 方加黃耆、阿膠、牡蠣[30]。
現代研究指出，四君子湯有良好擷抗自由基損傷作用，並能提高 d-Gal 衰老模型小鼠心、腦組織中端粒酶活性[31]。亦可促使衰老小鼠 臟器組織 SOD 的活性增強，抑制 MDA 形成而具有抗小鼠衰老的作 用[32]。四君子湯也可改善老齡家兔的下丘腦調控機能，延緩甲狀腺軸 機能的老年性變化[33]。對大鼠胃及十二指腸四君子湯均具有抑制收縮
的作用[34]，並具有明顯早期保護嚴重燒傷後腸黏膜的屏障功能[35]。 現[38]。四君子湯並可促使IL-2、IL-4、IL-5、TNF-α、IgE 低下，且淋 巴細胞 IL-4、IL-5、CD2 mRNA 表現較弱患者之各項指標恢復正常
[39]。也能夠促進腸粘膜損傷修復，並恢復因抗生素或輻射等抑制的正
固醇含量和降低LDL 膽固醇含量[50]。
生殖方面，四物湯對正常小鼠子宮的平滑肌有興奮作用，而對收 縮、妊娠小鼠子宮的平滑肌則顯示出抑制作用[51]。護肝方面，四物湯 能降低CCl4所致肝損後的GPT 升高，也能降低撲熱息痛(paracetamol) 所致的ALP 活性和 TG 含量[52]。
抗癌方面的研究指出，四物湯具有抗癌細胞轉移[53]以及良好的抗突 變作用[54]，亦具有抑制經COX-2、c-fos、IL-1α 和 TNF-α 表現之雌激 素相關內膜致癌作用[55,56]。
而免疫方面，四物湯能促進小鼠脾臟細胞分泌 IL-6 及提高 IL-6 mRNA 的表現[57]，且隨著四物湯劑量的增加，其促進脾臟與胸腺增 重的作用會更加明顯[58]。四物湯能增強 T 細胞功能，亦可促進 LPS 刺激巨噬細胞進而產生 IL-1 的活性[59]。另外，四物湯可顯著促進脾 臟淋巴細胞分泌IL-3 和 IL-2，並能明顯促進 IL-3 mRNA 的表現[60]。
第三章 材料與方法
3.1 實驗動物
動物品系：Wistar 品系雄性大白鼠(Wistar Albino Rats)，共 120 隻 動物來源：樂斯科實驗動物公司
動物週齡：4~6 週，體重約在 180~220 g 間
飼養方式：空調房間，溫度維持 22±5 ℃，半日照環境，分籠飼養，
自由飲水及餵養標準飼料 3.2 中藥材與配製
四君子湯[27]：
組成 基源植物 藥用部位 比例
人參
Panax ginseng C. A. Mey
乾燥根 2茯苓
Poria cocos (Schw.) Wolf
菌核 2白朮
Atractylodes macrocephala Koidz.
乾燥根莖 2甘草
Clycyrrhiza uralensis Fisch.
乾燥根及根莖 1四物湯[28]：
組成 基源植物 藥用部位 比例
當歸
Angelica sinensis (Oliv.) Diels,
乾燥根 6芎藭
Ligusticum chuanxiong Hort.
乾燥根莖 1赤芍
Paeonia lactiflora Pall.
根 4地黃
Rehmannia glutinosa Libosch.
根莖 6水抽出物之製備：秤重，各藥加水煮沸1 小時，趁熱過濾(兩次)，得
濾液，真空減壓濃縮，得濃縮液。濃縮液進行冷凍乾燥 得乾燥粉末，秤重並計算產率。
基源鑑定：藥材部分委託中國醫藥大學附設醫院中藥局收集並鑑定 基源。所有生藥、抽出物、冷凍乾燥得乾燥粉末都會保 留樣品於本校中國醫學研究所樣品保存室。
四君子：生藥材總重5.2 kg，水煎取液重 21.5 kg，冷凍乾燥粉末重 1.36 kg。產率=26.15%
四物湯：生藥材總重4.8 kg，水煎取液重 20.0 kg，冷凍乾燥粉末重 1.63 kg。產率=33.96%
3.3 實驗動物組數分配
實驗動物分為3、72 與 168 小時三大組，每大組再分為偽實驗組、
肝切除對照組、Silymarin 組、四君子實驗組與四物湯組。(表 3.1)
表3.1 實驗動物組數分配
3 小時 72 小時 168 小時
偽實驗組(sham) 5 5 8
肝切除對照組 8 8 5
Silymarin 組 9 9 9
四君子實驗組 9 9 9
四物湯組 9 9 9
總數 40 40 40
3.4 實驗步驟
實驗動物適應七天後，依上表將實驗動物分為(a)(b)(c)(d)(e)五組：
組(a)為偽實驗組
組(b)為肝切除對照組
組(c)為水飛薊素(Silymarin)組 組(d)為四君子組
組(e)為四物湯組 其中，
(c)組以胃管投與水飛薊素，連續給予七天。(0.025 g/kg)
(d)組以胃管投與四君子湯，連續給予七天。(冷凍乾燥粉末 1.0 g/kg) (e)組以胃管投與四物湯，連續給予七天。(冷凍乾燥粉末 1.0 g/kg) (a)、(b)組則給予同體積之生理食鹽水(normal saline)，連續給予七天。
(b)(c)(d)(e)組於第八天進行部份肝切除手術。
(a)組切開肚皮後即縫合肚皮。
各組大鼠分別於部份肝切除手術完成後 3 小時、72 小時與 168 小 時後犧牲，並於犧牲前30 分鐘以腹腔注射 BrdU(20 mg/kg)。
3.5 2/3 部分肝切除手術步驟
1. 實驗動物以酚巴比妥(Phenobarbital)麻醉後將腹部細毛剔除，並使 其平躺於手術台上。
2. 以酒精局部消毒後，以手術刀延腹部中線處下刀。
3. 毛皮層開口由劍突軟骨至大約腹部中點。
4. 肌肉層開口則由劍突軟骨至大約肝臟下方。
開始適應七天 開始投藥七天 進行部分肝切除手術 三小時組犧牲 (n=40) 七十二小時組犧牲 (n=40) 一百六十八小時組犧牲 (n=40)
5. 稍微撐開切口並切斷 suspensory ligament 使肝臟得以下垂。
6. 以手於切口附近靈活按壓以鬆動肝臟。
7. 另一手於肝臟下方之腹部往前上方按壓，兩手靈活使力而使肝臟之 median 葉與 left lateral 葉露出切口之外。
8. 以手輕輕地取出 median 與 left lateral 葉於紗布之上。
9. 於靠近血管處剪斷另外兩條韌帶。
10. 將露出的肝葉抬起，然後以縫線於其根部血管處打上兩個死結。
11. 於紗布之上對露出的肝葉切數刀以排除血液。
12. 以紗布包裹 median 與 left lateral 葉並給予適當的拉力。
13. 從打結處前方取下肝葉。
14. 縫合肌肉層與毛皮層。
15. 隨後將實驗動物送入恢復室中恢復[61]。 3.6 實驗動物犧牲：
1. 動物犧牲 30 分鐘前由腹腔注入 20 mg/kg 的 BrdU。
2. 動物以乙醚麻醉後由頸動脈採血，並取下剩餘的肝臟秤量以計算肝 重改變率。
3. 採得的血液以 4℃離心機離心後取得血清以供生化檢測。
3.7 石蠟組織切片製作步驟：
將摘取的肝臟浸於10%中性福馬林液中固定，一星期內粗修，厚度 2-3 mm，裝入塑膠包埋盒內，經組織自動脫水機(Processor 2LE)脫 水，脫水後組織塊以石蠟包埋機(Leica, German)固定製成蠟塊，將蠟
將摘取的肝臟浸於10%中性福馬林液中固定，一星期內粗修，厚度 2-3 mm，裝入塑膠包埋盒內，經組織自動脫水機(Processor 2LE)脫 水，脫水後組織塊以石蠟包埋機(Leica, German)固定製成蠟塊，將蠟