PCR 技術是一個普遍的不可缺少的技術，目前廣泛運用於醫學和生物學(78)。是由 1983 年科學家 Kary Mullis 發明，其做法是在欲擴增的 DNA 片段兩端分別設計一個前置 引子(forward primer)和反置引子(reverse primer)透過高溫使雙股 DNA 打開雙股，再透過 降溫讓單股 DNA 和設計的單股 primer 黏合配對(annealing)後，利用 DNA 聚合酵素(DNA polymerase)，以目標 DNA 的兩股分別做為模板(template)來合成新的 DNA 股。經由變 性反應(denaturation)，使 DNA 的兩股分離。緩冷配對反應(annealing)，使引子與目標 DNA 配對。延長反應(extension)，合成新的 DNA 股。
在這裡我們以 PCR 的方式放大目標基因後，然後和表現載體 pET30a EAM 進行黏 合，在將黏合後基因送入大腸桿菌 BL21 DE3 宿主細胞後，透過 PCR 以及定序做最後基 因確認(圖 8)。
圖 8 基因構築實驗流程圖
2-1-1 ybeA wild type 基因構築
YbeA 本身為 E coli 中的蛋白質。我們選擇使用 E. coli strain K-12 substn DH10B (GI code,169887498)的染色體作為模版，該基因序列如
表 1所示，灰底部分為 ybeA 基因序列。在這裡我們以引子 ybeA 4 fp 及 ybeA 4 rp 擴大 ybeA 基因，再透過 ybeA start fp 以及 ybeA 4 進行 nest PCR，其中在 nest PCR 時使 用 pro-taq DNA polymerase(PROTECH® ; Miao-Li, TW)，利用 dATP 在 ybeA 的 3’端接上 A，然後將 PCR 產物 clean up 後接進載體 pET30a EAM 內，送入大腸桿菌 BL21 DE3 宿
YbeA 4 fp 5’-GGATTGTCGTGGATTTGG-3’ 42.9°C 18 YbeA 4 rp 5’-CTCTGCCGTATAGTCGC-3’ 44.3°C 19 YbeA start fp
(1~24) 5’- GTGAAGCTGCAACTTGTCGC -3’ 60.7°C 20 PCR 條件
Buffer Volume(μl) Temperature Time Cycle
dd H2O 40.5 94°C 2 mins 1
2-1-2 ybeA△73-75 基因構築
ybeA△73-75 突變株基因構築是以先前構築好的 ybeA 基因為模板，其中 ybeA 的基 因序列如表 2 所示，灰底的部分為 fusion 片段，ATG 為起始密碼子，TGA 為終止密碼 子。在這裡我們利用 megaprimer 方式將 ybeA 的 73~75 號(DIP)胺基酸所對應的 DNA 序 列去除掉，其實驗流程如圖 9 所示。其中 megaprimer PCR 擴增可分為兩部分，先以 asymmetry PCR 方式擴增包含突變位置的 megaprimer (220~468)，以作為下一步 PCR 的 primer，其中 megaprimer 的 5’端至 3’端的單股 DNA 必須較多，以作為第二次 PCR 的 reverse primer。
因此 asymmetry PCR 的步驟時，我們將 ybeA DIP forward primer (220~240 bp)濃度 增加，讓 forward primer 的濃度高於 reverse primer(444~468 bp)20 倍，第一次 PCR 完後，
須先 cleanup 後去除多餘的 oligonucleotide，再進行第二次 PCR，利用 TA clony 方式將 ybeA DIP del gene 接進 pET30a EAM 載體然後利用 PCR 進行篩選，所選用之 primer 為 ybeA DIP del fp(220~248)及 T7 rp。我們之所以選擇 ybeA DIP del fp(220~248)作為 forward primer，是因為該 primer 可以鍵結在 ybeA DIP del gene 上卻無法鍵結在 ybeA wt gene 上，
故可以利用此點來區別 ybeA DIP del gene 與 wt gene 之間的區別。
圖 9 ybeA△73-75 基因 megaprimer PCR 流程圖
圖中 fp(220-265)為第一次 PCR 的 forward primer，rp444-468 為第一次 PCR 的 reverse primer，而第二次 PCR 的 forward primer 為第一次 PCR 產物 megaprimer 而 reverse primer 和第一次 PCR 的 reverse primer 相 同。
PCR 實驗條件：
Primer Sequence Tm bp
YbeA DIP fp
(220~248) 5’-ACCCTCGGCAAGCCCTGGGAT-3’ 60°C 21 YbeA DIP rp
(440~468) 5’-TCACTCACGGTGATAAGGATGGTTG-3’ 57°C 25 YbeA start fp
(1~24) 5’- GTGAAGCTGCAACTTGTCGC -3’ 60.7°C 20
第一次 PCR 條件
Buffer Volume(μl) Temperature Time Cycle
d.d H2O 40.5 94°C 1 min 1
Buffer Volume(μl) Temperature Time Cycle
d.d H2O 23 94°C 1 min 94℃ 241atgcc c ttcg ag ctga ttga aattcc ggc c ggaaaa cgc g gc aagaatg c gga catcaag 301cgcata c tcg a caaagag g g tga gcaga tg ttg gcg g c cg c aggcaaaaa c cgca ttg tc
2-1-3 ybeA△1-8 基因構築
ybeA△1-8 突變株構築是以先前構築好的 YbeA 基因為模板，透過引子 ybeA(175) fp 及 ybeA (627) rp 進行 TA cloning 來擴增 ybeAΔ1-8 基因，然後將 PCR 產物 clean up 與 pET 30a EAM 做黏合，再利用 primer T7 fp 及 ybeA (627) rp 進行 PCR 篩選。
PCR 實驗條件：
Primer Sequence Tm bp
ybeA (175)fp 5’-GGAACTAAAATGCCTGACTGG-’ 52.3oC 21 ybea (627)rp 5’-GCTCCCTTATCACTCACGG-3’ 53.2oC 19
PCR 條件
Buffer Volume(μl) Temperature Time Cycle
dd H2O 20 94°C 1 min 1
Template(pET 30a- ybeA) 1 Total volume 25 2-1-4 ybeA△1-70 基因構築
以先前實驗室建構好的 ybeA 基因為模板，透過 ybeA(361)fp 及 ybeA(627)rp primer 近進行 TA cloning 擴增 ybeA Δ1-70 基因，然後將 PCR 產物經過 clean up 與 pET30a EAM 進行黏合，再利用 primer 為 T7 fp 及 ybeA (627)rp 利用進行 PCR 篩選。
PCR 實驗條件：
Primer Sequence Tm bp
ybeA (361)fp 5’-ACACTAGATATTCCAGGCAAGC-3’ 53oC 22 ybea (627)rp 5’-GCTCCCTTATCACTCACGG-3’ 53.2oC 19
PCR 條件
Buffer Volume(μl) Temperature Time Cycle
dd H2O 20 94℃ 1 min 1
2-1-5 ybeA△118-155 基因構築
以先前實驗室建構好的 ybeA 基因為模板，透過 ybeA(151)fp 及 ybeA(501)rp 進行 TA cloning，將 PCR 產物經過 clean up 與載體 pET30a EAM 進行黏合再利用 T7 fp 與 ybeA (627) rp 進行篩選。
PCR 實驗條件：
Primer Sequence Tm bp
ybeA (151)fp 5'-GTGAAACTGCAACTTGTAGCC-3' 52.4oC 21 ybea (504)rp 5’-CGACAAGTTGCAGCTTCAC-3’ 54.5oC 19
PCR 條件
Buffer Volume(μl) Temperature Time Cycle
dd H2O 20 94℃ 1 min 1
1 mM dNTP 0.5 94℃ 30 secs
30 ybeA (151)fp 0.5 53℃ 30 secs
ybea (501)rp 0.5 72℃ 30 secs
10x buffer 2.5 72℃ 5mins 1
Pro-taq 0.5 Template
(ybeA pET 30a EAM)
1 Total volume 25
2-2 蛋白的製備
將所需的基因接合在 pET30a EAM 載體後，送入大腸桿菌 BL21 DE3 中以乳糖異構物 IPTG 誘導 16 小時以求獲得大量表現的蛋白質內含體。其中 IPTG 可以誘導乳糖對照組 (lac peron)活化表現下游基因。其表現原理在於在大腸桿菌 BL21 DE3 的乳糖對照組可以 產生大量的 T7 RNA polymerase 表現，然後 T7 RNA polymerase 再去活化 pET30a 上的 T7 promoter，使得我們建構的基因得以大量表現，而誘導物-乳糖會被乳糖對照組所產 生的β-galatosidase 會分解終止反應；然而 IPTG 卻不會被分解，因此可以不斷的產生大 量的蛋白。
(2)取活化菌液 3μl 加入 3 mL LB 培養液(含抗生素 Kanamycin 20 ng/mL)，37℃，200rpm 震盪培養至 OD 0.6-0.8 後加入 IPTG，使 IPTG 最終濃度為 1 mM，持續震盪培養 12-16 小時。
(3)抽取 1 ml 菌液,以 12000 rpm 離心 1 分鐘,將沉澱的菌體以 100μl 的 sample buffer(10 mM Tris-HCl，pH6.8，4 % SDS，0.2 % Bromophenol Blue，20 %Glycerol，200 mM DTT)回 溶。以超音波震盪器(UP200s，Hielsher,Teltow,Germany)打破細胞壁，透過 15 % SDS-PAGE 確認是否有目標蛋白大量表現。
在這裡我們透過實驗室建構的準靜態摺疊法(Quasi-static-like thermal equilibrium dialysis)將蛋白質摺疊回自然態。
實驗步驟:
(1)將內含體 (Inclusion body)透過 denature buffer 回溶，再將回溶的蛋白透過離心移除沉 澱物，再將離心後蛋白溶液，透過孔徑為 0.22μm PVDF 濾膜進行過濾。然後將過濾好 的蛋白溶液置入孔徑為 3.5 kDa 的透析膜後，置入 R1緩衝液做透析，此時摺疊中間物稱 為 M1。
(2)將摺疊中間物 M1置入 R2緩衝液透析，此時摺疊中間物稱為 M2。 (3)將摺疊中間物 M2置入 R3 緩衝液透析， 此時摺疊中間物稱為 M3。
(4)將摺疊中間物 M3置入 R4 緩衝液透析，此時摺疊中間物稱為 M4。
(5)將摺疊中間物 M4置入 R5 緩衝液透析，此時摺疊中間物稱為 M5或摺疊態。
2-3 圓二色光譜(Circular Dichroism Spectroscopy)
圓二色光譜是一種特殊的吸收光譜，它對手相分子的構型相當敏感，其中手相分子 具有光學活性，當單色左旋光及右旋光偏振光通過樣品時，對左旋光及右旋光偏振光有 不同吸收就叫做圓二色性。圓二色光譜技術(Circular Dichroism)，早在 1969 年就由 Greenfield 利用來估計蛋白質的二級結構，是一種快速簡單且相當準確的方法。圓二色 光譜可以用來分析生物樣品的結構像是蛋白質以及核酸分子，在遠紫外線旋光光譜波段 (180-250 nm)主要用於偵測蛋白質二級結構，而在近紫外線旋光光譜波段(250-350 nm) 主要偵測蛋白質胺基酸的殘基，蛋白質二級結構特徵鋒如表 3 所示。
表 3 蛋白質二級結構特徵鋒
-band(nm) +band(nm)
α 螺旋 222 192
208
β sheet 216 195
220(week)
203(strong ) 205
Polypro II 螺旋 190 210-230
Random coil 200 212
實驗步驟:
(1)調整蛋白質濃度為 0.5 mg/ml。
(2)打開氮氣持續吹 20 分鐘以上，設定水浴槽溫度為 20 oC，開啟 Xe LAMP power 以及 CPU/INST power
(3)打開 AVIV 程式，設定實驗參數
(3)取體積 250 μl 的樣品加入光徑為 1 mm 的石英樣品槽(quarz cell)
實驗參數:掃描波長為 200~260 nm，band width 是 0.5 nm，interval time 是 10 秒。
2-4 螢光光譜儀(Fluorescence Spectroscopy) 2-4-1 螢光原理
螢光分子吸收外界光原能量 hvEX 使其能量跳至 S1'後，受激螢光分子產生一些變 化，並與外在環境產生許多化學反應，使能量從 S1'掉到 S1 再掉到 S0，放出能量 hvEM，
其中 hvEX 的能量相較於 hvEM 其能量較低且波長也較激發光源長(圖 10)。
圖 10 螢光原理
2-4-2 蛋白質螢光原理
蛋白質內部主要由疏水性胺基酸所構成，在這些胺基酸中的芳香族類胺基酸 Trp、
Tye、Phe 有著特殊的光學性質可以吸收波長為 280 nm 的光，其中 Trp 更可以吸收 295 nm 的光，屬於蛋白質分子內的螢光基團。當這些螢光基團分子受到光激發後會造成內部電 子躍遷釋放出螢光；倘若這些螢光基團處於疏水性環境底下，其分子內部共振結構相當 穩定，在受到光激發後能量不容易以熱能型式發散；然而當處於親水性環境底下，其螢 光基團結構相當不穩定，在受到光激發之後，分子內部共振相當明顯，造成釋放出的螢 光相當微弱。根據這些螢光基團的螢光強度可以用來分析其所處的蛋白質的摺疊狀態，
當蛋白質內部核心於疏水性環境底下環境底下，這些螢光基團受光激發後仍相當穩定；
然而若是受到一些變性因子如高溫、酸鹼等外在因素影響，造成螢光基團暴露在水溶性 環境，則會導致讓螢光能量下降，以及波峰發生紅位移現象。
實驗步驟:
(1)調整蛋白質濃度為 0.1 mg/ml。
(2)水浴槽溫度為 25 oC。
(3) 打開程式連結電腦與儀器(Hitachi F-4000, Scientific Equipment Source Inc , Canada)，
設定實驗參數。
(4)取體積 700-800 μl 的樣品加入光徑為 1 cm 的石英樣品槽(quarz cell)
實驗參數:掃描波長為 310~450 nm，延遲時間(delay time)為 10 秒，EX Slit:5.0 nm，EM Slit:
5.0 nm，波長間隔為 0.2 nm，掃瞄速度是 1200 nm/min。
2-5 恆溫滴定微卡計(Isothermal Titration Calorimetry)
透過恆溫滴定微卡計可以得知生化反應或分子間交互作用力的大小，如酵素以及受 質間的交互作用力以及核酸分子間的交互作用力。恆溫滴定微卡計其原理是在恆溫環境 下觀察生化反應或分子間交互作用，將欲觀察的反應物透過滴定的方式滴入另一欲觀察 反應的反應系統中，分析在恆溫環境底下反應熱的變化。在這裡我們利用 ITC 偵測 YbeA 蛋白與其受質 S-Adenosyl methionine(AdoMet)之間的交互作用力。
實驗步驟:
(1)樣品偵測前要先用孔徑為 0.22μm 過濾膜過濾樣品，並透過抽真空幫浦以及超音波震 盪器去除氣泡。
(2)在樣品端加入 2.8 ml 的樣品溶液，而參考端的反應槽加入 3 ml 和樣品端相同的緩衝 液，緩慢將參考端以及樣品端放進反應槽內。
(3)在外部注射器加入約為 300 μl 的反應物，將前端細管插入反應槽內，打開攪拌器, 等待平衡穩定後開始做測定。
(4)設定實驗參數(注射器以每個十分鐘滴入 10 μl 的樣品，共二十次，最終滴入 200 μl，
最後樣品槽的體積達 3ml 和參考端相同)
2-6 介質輔助雷射脫附游離飛行式質譜儀 (MALDI-TOF-MS)
基質輔助雷射脫附-飛行時間質譜法(MALDI-time of flight, TOF)，即為結合基質輔助 雷射脫附離子化技術與飛行時間質譜分析的應用。
(α-cyano-4-hydroxycinnamicacid)、2,5-二羥基苯甲酸 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB)與 芥子酸 sinapinic acid (SA)。
在這裡我們透過胰蛋白酶分別對 YbeA 摺疊態以及未摺疊態進行水解作用，然後將
2-7 螢光共振能量轉移(Förster resonance energy transfer)
螢光共振能量轉移可以用來比較分子距離以及分子內直徑的有效工具，廣泛的應用
其中 AMCA 的激發波長在 340-350 nm 而發射波長在 440-460 nm。而 Trp 的激發光 波長在 295 nm，而發射光波長為 345-350 nm 左右。
實驗步驟:
(1)取適量 YbeA 樣品溶於 10mM Tris–HCl (pH 8.8)置於 1.5 ml eppendorf 中，後加入 AMCA-HPDH 使之莫耳比例為 10:1，於室溫底下避光靜置 1 個半鐘頭，待其反應完全。
將 YbeA 及 AMCA-HPDH 混和物置入 3.5 kDa 的透析膜，置入 10mM Tris -HCl (pH 8.8) 做透析，去除多餘未接合的 AMCA-HPDH 分子。
(2)藉由紫外光可見光譜儀來計算 YbeA 以及 AMCA-HPDH 的濃度來計算接和率。
(3)利用波長 295 nm 的光源激發 Trp 分子，分析 Trp 以及 AMCA 之螢光能量轉移效率來
(3)利用波長 295 nm 的光源激發 Trp 分子，分析 Trp 以及 AMCA 之螢光能量轉移效率來