PCR 利用兩對引子進行 PCR，一開始以第一對引子(primer)先進行 PCR，然後用第二對 引子對第一對引子的 PCR 產物進行第二次 PCR，這樣的做法可以避免只用一對引子和
在構築 ybeA△73-75 時，我們選擇 mega-primer 方式擴增該基因，一般而言，在構 築中間片端缺損的基因時，常用的方法是將片段缺損前後兩段基因設計酵素切位，透過 導插入基因(insert gene)表現，然後分別收集水溶性以及非水溶型式蛋白，透過 SDS PAGE 分析表現結果，結果顯示 YbeA 能同時存於水溶以及非水溶部份。然而非水溶部分相較
4-2-2 摺疊產物結構及功能分析 Framework model 的說法，指出蛋白質在摺疊初期會因為氫鍵的交互作用力先形成二級 結構，根據這一點我們可以運用圓二色光譜儀分析蛋白質摺疊過程的二級結構變化(79)。
180 200 220 240 260 280 300
R E (X 10 3 d eg c m 2 d m o le -1 )
Wavelength (nm)
透過 ITC 來分析 YbeA 蛋白與其受質 S-Adenosyl methionine 之間的交互作用力。根據我 們 ITC 的實驗結果，摺疊完的 YbeA 與 S-Adenosyl methionine 以二比一方式做接合，其 Ka值為 1.35×105 M-1 而△H 為-3.24 Kcal/mol。此外我們將實驗數據與與 2010 年 Sophie E 果證明透過本實驗室的過臨界點摺疊反應(over-critical reaction ,on-path)，確實能將的 YbeA 蛋白摺疊回具有功能蛋白。圖 76 ITC 實驗結果比較
表 15 ITC 實驗數據表
Kd Ratio
Jackson 2.5 μM 0.5
mine 7.46μM 0.37
此外根據 YbeA 以及其他突變株蛋白摺疊中間產物的二級結構可以得知，這些蛋白 在摺疊過程初期其二級結構幾乎已經達穩定與摺疊態之間的位能差很小，其二級結構以 相當緩慢的速度抵達摺疊態，此一結果與我們動態反應速率分析相符。
此外為了得知這些突變株與 YbeA 的二級結構差異(表 10)，我們比較這些蛋白質的 圓二色光譜圖譜以及二級結構比例，發現在這些突變株中 YbeAΔ73-75 與 YbeA 摺疊態 的二級結構幾乎完全相同，表示在扭結環前移除 73-75 胺基酸幾乎對其二級結構沒有影 響，然而其他突變株部分其二級結構與 YbeA 的差異更大，完全是另外的蛋白構型。
4-2-3 熱穩定性分析
蛋白質的構型會受到周圍環境(pH 值、溫度、鹽濃度……)的影響產生變化，可以透 過掃描式熱差分儀以及光學儀器如圓二色光譜儀以及螢光光譜儀來分析結構熱穩定 性。當加溫時會破壞分子間氫鍵、靜電作用力以及疏水性作用力，導致其內部核心疏水 性胺基酸暴露到水溶性環境底下，造成螢光強度下降以及波峯位置紅位移的現象。透過
分析螢光強度以及波峯位置可以用來分析蛋白變性狀況。在這裡我們分析λmax 隨著溫
度變化的螢光值來分析蛋白質受熱後的疏水性核心變化趨勢，來作為判斷蛋白熱穩定性 的方法。
我們預計扭結可能有穩定結構的作用。在受到熱變性時內部扭結的核心可以穩定結 構的功能。從實驗結果我們看到具有扭結 YbeA 的 Tm值在 317.0 K，而 YbeA△73-75 的 Tm值在 323.5 K，在 YbeA△1-8 的 Tm值為 319.5 K 而 YbeA△1-70 的部分，受熱後其螢 光強度呈現現性變化，無法透過 Boltzmann equation 進行微分，此外 YbeA△118-155，
的熱相變溫度為 305.8 K。此外我們透過圓二色光譜來分析蛋白相變過程的二級結構變
化，在這裡我們分別觀察二級結構 α 螺旋以及 β 平板的特徵鋒位置，從實驗結果顯示
YbeA 以及 Δ(73-75)、Δ (1-8)、Δ(1-70)部分其二級結構在加熱到 95 度時都還一直在變化
而未達完全飽和變性，而在 YbeAΔ118-155 部份，蛋白質約在 70 度左右二級結構即達
衝液條件為 pH 值為 8.8 的 10 mM Tris，而他們所使用的緩衝液條件為 pH 值為 7.5，50 mM 解反應結合 MALDI-TOF 分析水解片段序列。根據我們酵素水解分析結果，YbeA 的扭 結部分不論是在摺疊態以及未摺疊態，其結構中最穩定的部分均在(97-113)號胺基酸，