3-1-1 pET30a-ybeA 質體構築
此基因由本實驗驗室所構築，圖 12 為質體 pET30a-ybeA 的建構圖，在這裡我們選 用大腸桿菌 K-12 DH10B 的染色體為模板來擴增 ybeA 基因，DH10B 染色體本身有 4686137 bp，而 ybeA 基因則位在 DH10B 染色體基因 607270 bp 之間，我們透過 nest PCR 方式來擴增 ybeA 基因，圖 13(A)為 DH10B 染色體為模板，透過引子 ybeA 4 fp 及 ybeA 4 rp 擴增含 ybeA 基因的結果，在 lane1 部分 600~700bp 位置有單一片段，其大小與 ybeA 4 fp 及 ybeA 4 rp PCR 擴增預計長度 592bp 符合；圖 13(B)為 ybeA start fp 以及 ybeA rp 進行 PCR 結果，lane1 在 400-500bp 位置有單一片段其大小與預期片段大小 461 bp 吻合。
再將我們擴增好的 ybeA 基因與 pET30a EAM 載體進行黏合，送入大腸桿菌 BL21 DE3 菌株，圖 13(C) 為透過 T7 fp 以及 ybeA 4 rp PCR 篩選挑選出來的菌株凝膠電泳結 果，在 lane 3 部分 800~900 bp 位置有單一片段，其大小與預計片段 811 bp 吻合，因此 菌落 3 可能有 ybeA 基因，於是我們將菌落 3 送定序，而圖 14 為定序結果與 NCBI 上 公布的 ybeA 基因比對，其序列相符，我們確定菌落 3 確實含 pET30a-ybeA 基因。
圖 12 質體 pET30a-ybeA 的建構圖
圖 13 pET30a-ybeA 質體構築結果
圖中以菌株 DH10B 的染色體作為模版，利用引子 ybeA 4 fp 及 ybeA 4 rp 來擴增 ybeA 基因結果，lane M 為 DNA ladder，lane N 為負對照組，lane 1 為 DH10B 的染色體，利用引子 ybeA 4 fp 及 ybeA 4 rp 擴增結 果，箭頭所指為預期片段位置。圖(b)是以 start fp 以及 ybeA 4 rp 擴增結果，箭頭所指為預期片段位置。
圖(c)為透過 T7 fp 及 ybeA 4 rp 引子來 PCR 檢測挑出來的菌落是否有 ybeA 基因，lane M 為 DNA ladder，
lane N 為 nagative control ，lane1-3 是挑出來菌落, 箭頭所指為預期片段位置，DNA 電泳使用 1.5% Agarose gel 及 0.5x TBE buffer。
圖 14 重組 ybeA 基因與 NCBI 公布之 ybeA 基因的比較結果。
圖中 NCBI -ybeA 為 NCBI 上所登錄的 ybeA DNA 序列，而 r-ybeA 為我們所構築的 ybeA 基因定序結果，
其中星號部份為有對應到的基因序列，我們所擴增的 ybeA 除了前面多了載體的 his-taq 融和片段外，其 餘序列完全符合 NCBI 所登錄的資料。
3-1-2 pET30a-ybeA△73-75 質體構築
此基因由本實驗室所構築，圖 15 為質體 pET30a-ybeA△(73-75)的建構圖，我們以 pET30a-ybeA 為模板，透過 megaprimer PCR 方式來去除 DIP 胺基酸對應核甘酸，其中 ybeA△73-75 的 PCR 主要分成兩部分，第一個部份我們先以 ybeA DIP del fp (220~248) 以及 ybeA DIP del rp (440~468)為引子，擴增含突變位置的 megaprimer (220~468)以作為 下一步 PCR 的 reverse primer。而第二次 PCR 時以 pET30a-ybeA 為模板以 ybeA start fp(1~24)做為 forward primer 而第一次 PCR 的 megaprimer (220~468)做為 reverse primer，
擴增 ybeA △(73-75)基因。
圖 16(a)為 ybeA △(73-75)基因擴增結果，lane1 在 400~500bp 位置有單一片段其大 小與預計長度 492bp 符合，將我們擴增好的 ybeA△(73-75)基因與 pET30a EAM 載體進 行黏合，再送入大腸桿菌 BL21 DE3 菌株，圖 16(b)為利用 ybeA DIP del fp (220~248)及 T7 rp 塞選挑出來菌落，菌落 7、8、17 在 400-500bp 位置有單一片段其大小與預期片段 大小 485 bp 吻合，因此菌落 7、8、17 可能有 ybeA△(73-75)基因，於是我們將菌落送定 序，而圖 17 為重組 YbeA 與重組 ybeA△(73-75) 基因序列比較結果，綜合以上結果，
我們確定菌落確實含 pET30a-ybeA△(73-75)基因。
圖 15 質體 pET30a-ybeA△(73-75)的建構圖
圖 16 pET30a-ybeA△(73-75)基因建構結果
(a)圖為利用 megaprimer 方式擴增 ybeA 去除胺基酸 DIP 相對基因結果，lane M 為 DNA ladder，lane 1 為 ybeA △(73-75)，lane P 為正對照組，lane N 為負對照組，箭頭所指處為預計片段大小位置，在這裡 DNA 電泳使用 1.5 % 瓊脂膠體及 0.5 x TBE buffer；圖(b)為透過引子 ybeA DIP del fp(220~248)以及 T7 rp PCR 篩選挑選出來的 17 個菌落，lane M 為 DNA ladder，lane 1-17 為挑選出來的挑選 17 顆菌落，lane P 為正 對照組，而 lane N 為負對照組，箭頭所指處為預計片段大小位置，在這裡 DNA 電泳使用 1.5 % 瓊脂膠 體及 0.5 x TBE buffer。
圖 17 重組 ybeA 與重組 ybeA△(73-75)基因序列比較結果。
星號部份為有對應到的基因序列，方塊圈選位置為基因序列上不同處，在第一個方塊中的密碼子 CTT 靜 默突變為 CTA，此突變不影響轉譯結果，而在第二個方塊部分，ybeA△(73-75)相較於 ybeA 少了 3 個密 碼子，其相對應的胺基酸分別為 D.I.P，綜合以上結果，得知獲得 ybeA△(73-75)基因。
3-1-3 pET30a -ybeA△1-8 質體構築
圖 18 為質體 pET30 -ybeA△1-8 的建構圖，我們以 pET30a-ybeA 為模板，ybeA(175) fp 以及 ybeA (627) rp 做為引子擴增 ybeA△1-8 基因，圖 19(a)為 ybeA△1-8 基因擴增的 凝膠電泳結果，lane1 在 400~500 bp 位置有單一片段，其大小與 ybeA (175)fp 以及 ybea (627)rp 預計擴增長度 477 bp 符合，將我們擴增 ybeA△1-8 基因與 pET30a EAM 載體進 行黏合，再送入大腸桿菌 BL21 DE3 菌株。圖 19(b)為利用引子為 T7 Fp 以及 ybeA (627) rp PCR 篩選挑出來的菌落，其中預計擴增片段大小為 811 bp，而我們挑選出來的菌落 1、
2、4、5、6、7、8、9 在 700~800 bp 位置都有單一片段，其大小與 T7 fp 及 ybeA (627)rp 預計擴增片段大小吻合，綜合以上結果，菌落 1、2、4、5、6、7、8、9 可能有 ybeA△(1-8) 基因。於是我們將菌落送定序。圖 20 為重組 ybeA 與重組 ybeA△(1-8)基因序列比較結 果，綜合以上結果，我們確定挑出來的菌落確實含 pET30a -ybeA△1-8 基因。
圖 18 質體 pET30-ybeA△1-8 的建構
圖 19 ybeA△1-8 基因建構結果。
圖(a)為利用引子 ybeA (175) fp 以及 ybeA(627) rp 擴增 ybeAΔ1-8 結果，lane M 為 DNA ladder，lane1 為 以 pET30a-ybeA 質體為模板 PCR 擴增結果，而箭頭所指處為預計片段位置，在這裡 DNA 電泳使用 1.5 % 瓊脂膠體及 0.5 x TBE buffer；圖(b)為利用引子以 T7 fp 及 ybeA (501) rp 引子來 PCR 檢測挑出來的 10 顆 菌落，laneM:DNA ladder，lane1-10 是挑出來的 10 顆菌落，lane P 為正對照組，lane N 為負對照組。箭頭 所指處為預計片段大小位置，在這裡 DNA 電泳使用 1.5 % 瓊脂膠體及 0.5 x TBE buffer。
圖 20 重組 ybeA 與重組 ybeA△(1-8)基因序列比較結果。
其中星號部份為有對應到的基因序列，方塊部分為靜默突變不影響轉譯結果，此外重組 ybeA△(1-8)除了 最前端少 8 個密碼子以外其他序列和 ybeA 完全相同，而不見的基因的對應胺基酸分別為 V.K.L.Q.L.V.A.V.
這八個胺基酸，這與我們預期要去除的胺基酸相同，綜合以上結果，得知我們得到所需的 ybeA△(1-8)基 因。
3-1-4 pET30a-ybeA△1-70 質體構築
圖 21 為質體 pET30 -ybeA△1-70 的建構圖，ybeA (361) fp 以及 ybeA (627) rp 做為 引子擴增 ybeA△1-70 基因，圖 22(a)為 ybeA△1-70 基因擴增的凝膠電泳結果，lane1 在 200-300 bp 位置有單一片段，其大小與 ybeA(361) fp 以及 ybeA(627) rp 擴增預計長度 267 bp 符合，再將我們所擴增 ybeA△1-70 基因與 pET30a EAM 載體進行黏合，再送入大腸 桿菌 BL21 DE3 菌株。圖 22(b)為利用引子為 T7 fp 以及 ybeA (627) rp PCR 篩選挑出來 的菌落，利用 PCR 篩選挑出來的菌落，菌落 2、3、4、6。7、8、9 在 500~600 bp 位置 有單一片段，其大小與 T7 fp 及 ybeA (627) rp 預計擴增片段 514 bp 吻合，菌落 2、3、4、
6。7、8、9 可能有 ybeA△(1-70)基因，所選用之 primer 為 T7 fp 以及 ybeA (627) rp，預 計擴增片段大小為 514 bp，而我們的 PCR 擴增結果的片段大小與預期大小符合，於是 我們將菌落送定序，而圖 23 重組 ybeA△1-70 與重組 ybeA 基因序列比較結果，綜合以 上結果，我們確定挑出來的菌落確實含 ybeA△1-70 基因。
圖 21 質體 pET30-ybeA△1-70 的建構圖
圖 22 ybeA△1-70 基因建構結果。
圖(a) lane M 為 DNA ladder，lane1 為以 pET30a-ybeA 質體為模板，利用引子 ybeA (361) fp 及 ybeA (501) rp 擴增結果，箭頭所標示位置為預計片段大小位置，lane N 為負對照組；圖(b)利用引子以 T7 fp 及 ybeA (627) rp 引子來 PCR 篩選挑出來的菌落是否含有 ybeA△(1-70)基因，lane M 為 DNA ladder，lane1-9 是挑出來的 菌落，lane P 為正對照組，lane N 為負對照組，箭頭所指處為預計片段大小位置，在這裡 DNA 電泳使用 1.5 % 瓊脂膠體及 0.5 x TBE buffer。
圖 23 重組 ybeA△1-70 與重組 ybeA 基因序列比較結果
星號部份為有對應到的基因序列，方塊部分為靜默突變密碼子，其不影響轉譯結果，而重組 ybeA△1-70 除了最前端少 70 個密碼子以外，其他序列和重組 ybeA 完全相同，綜合以上結果，得知我們得到所需的 ybeA△1-70 基因。
3-1-5 pET30a-ybeA△118-155 質體構築
圖 24 為質體 pET30 -ybeA△118-155 的建構圖，我們以 pET30a-ybeA 為模板，ybeA (151) fp 及 ybeA (501) rp 做為引子擴增 ybeA△118-155 基因，圖 25(a)為 ybeA△118-155 基因擴增的凝膠電泳結果，lane1 在 300-400 bp 位置有單一片段，其大小與 ybeA(151) fp 及 ybeA (501) rp 擴增預計 351 bp 符合，再將我們所擴增 ybeA△118-155 基因與 pET30a EAM 載體進行黏合，再送入大腸桿菌 BL21 DE3 菌株。
圖 25(b)為利用引子為 T7 fp 以及 ybea (501) rp PCR 篩選挑出來的菌落，菌落 1、2、
3、4、5、6、10、12 在 500~600 bp 位置有單一片段，其大小與 T7 fp 及 ybeA (627) rp 預計擴增片段 592 bp 吻合，因此這些菌落可能有 ybeAΔ118-155 基因，於是我們將菌落 送定序，而圖 26 為重組 ybeAΔ118-155 與重組 ybeA 基因序列比較結果，綜合以上結果，
我們確定挑出來的菌落確實含 pET30a-ybeA△118-155 基因。
圖 24 質體 pET30-ybeA△118-155 的建構圖
圖 25 ybeA△118-155 基因建構結果。
圖(a) laneM 為 DNA ladder，lane1 為以含 ybeA 基因的 pET30a-ybeA 為模板，利用引子 ybeA (151) fp 及 ybeA (501) rp 擴增的結果，箭頭所指方向為預期片段大小位置；圖(b)利用引子 T7 fp 及 ybeA (501) rp PCR 篩選挑出來的菌落是否含有 ybeA Δ118-155 基因，laneM 為 DNA ladder，lane1-9 是挑出來的 9 顆菌落，lane P 為正對照組，lane N 為負對照組，箭頭所標示位置為預計片段大小位置，在這裡 DNA 電泳使用 1.5 % 瓊 脂膠體及 0.5 x TBE buffer。
圖 26 重組 ybeA 與重組 ybeA△118-155 基因序列比較結果。
其中星號部份為有對應到的基因序列，方塊位置表示無意義突變（nonsense mutation）位置，除了胺基酸 的密碼變成轉譯的終止密碼提前終止以外，前面序列完全相同，其序列與我們預期構築的基因序列相同, 於是得知我們所需的 ybeA△118-155 基因。
3-2 蛋白質表現結果
透 過 基 因 構 築 獲 得 含 有 YbeA 、 YbeA△73-75 、 YbeA△1-8 、 YbeA△1-70 、 YbeA△118-155 基因的菌株後，為了確定我們建構的基因確實可以透過 IPTG 的誘導大 量表現，此外我們以不含插入基因的 BL21 pET30a 為對照組，以相同條件誘導蛋白表 現，在這裡的誘導條件為 37 度 16 個小時。
誘導完後透過離心沉澱菌體，以二次水覆溶菌體後，透過超音波破菌機打破細胞 壁，再以 SDS PAGE 分析目標蛋白在上清液以及沉澱物的分布情形，YbeA 的分子量為 23.17kDa，YbeA△73-75 的分子量為 22.52 kDa，YbeA△1-8 的分子量為 21.99 kDa，
YbeA△1-70 的分子量 14.93 kDa，YbeA△118-155 蛋白的分子量為 18.43 kDa，圖 27(a) 為 15 % SDS 蛋白質電泳膠片分析破菌後離心上清液，其順序如圖所示，可以看到除了 蛋白質 YbeA 在上清液部分有表現，而其他突變株在上清液部分並無表現；圖 27(b)為 15 % SDS 蛋白質電泳膠分析破菌後離心沉澱體結果，其順序如圖所示。
目標蛋白 YbeA、YbeA△73-75、YbeA△1-8、YbeA△1-70 以及 YbeA△118-155，
在沉澱體部分不論在純度上或是表現量上都是很高的，在純度方面約為 90~95 %，而在 產量方面 YbeA、YbeA△73-75 以及 YbeA △1-8 的產量約為 100-150 mg/L 而 YbeA△1-70 的產量約為 50-60 mg/L，YbeA△118-155 的產量約為 80 mg/L。
圖 27 YbeA 以及其突變株 IPTG 誘導後 SDS PAGE 分析結果
(a)為打破細胞壁的菌體上清液，圖(b)為打破細胞壁的菌體沉澱物，樣品的順序如圖所示，圖中箭頭所示 為 YbeA 蛋白以及其他突變蛋白的位置，本實驗的膠體染色是用 Coomassile blue 染色法。
3-3 螢光分析摺疊中間產物的疏水性核心變化
蛋白質在摺疊的過程中受到疏水性作用力的影響，可以逐漸形成穩定的疏水性核 心，造成螢光強度增強且波鋒位置往短波長處位移。
3-3-1 YbeA 摺疊中間產物疏水性核心分析
圖 28 為 YbeA 蛋白摺疊中間物螢光圖譜，其中 U 的 λmax 為 350.4 nm，螢光強度
圖 28 為 YbeA 蛋白摺疊中間物螢光圖譜，其中 U 的 λmax 為 350.4 nm，螢光強度