3-1 聚合酶連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction，PCR)
聚合酶連鎖反應是一種分子生物技術，係在生物體外以 DNA 聚合酶（DNA polymerase）增加特定目標的 DNA 片段數量。此技術傴能夠將非常微量的 DNA 片段快速地複製增加至所需的數量，故被廣泛地應用於各種生物相關領域，例如 遺傳疾病檢查、物種鑑定、親子鑑定等等。PCR 技術是由美國科學家 Kary Mullis 於 1983 發明[55]，並在七年後以此發明獲得諾貝爾化學獎。此技術發展至今已有 許多的變體，例如遞減聚合酶連鎖反應（Touchdown PCR）、反轉錄聚合酶連鎖反 應（Reverse Transcription PCR）、熱啟動聚合酶連鎖反應（Hot Start PCR）、即時 聚合酶連鎖反應（Real-time PCR）等等。
PCR 技術的基本原理是利用一種存在於水生嗜熱菌（Thermus aquaticus）的 DNA 聚合酶（Taq polymerase）在高溫環境下（～96°C）將高熱解旋成單股的 DNA 片段，藉由單股的 DNA 引子（primer）的標定而將特定的 DNA 片段複製增加[56]。
這基本原理可簡單地分成三個步驟〆（ 1）變性反應（Denaturation），以高溫分離 DNA 的雙股形成單股的模板々（2）緩冷配對反應（Annealing），溫度降低至略低 於引子熔點溫度（指 50%的兩互補單股 DNA 相結合的最高溫度）而使引子與 DNA 模板配對々（3）引子延展反應（Elongation/Extension）〆引子由 5′端往 3′端延長形 成新的雙股 DNA。此三步驟為一循環，一般 PCR 反應由 20～30 個循環完成，當 完成 20 個循環，目標 DNA 將數量便達到原有的 2 的二十次方倍。
另外，引子的設計好壞會影響整個 PCR 反應的效果。一般 PCR 反應會由兩 段引子標定出欲複製增加的 DNA 片段，分別為前置引子（Forward primer）和反 置引子（Reverse primer）。引子係由人工合成的短片段 DNA，通常為 18～25 個 鹼基。引子太短便可能造成有多個能與模板 DNA 結合的位置而形成非特異性複 製々若太長會導致過高的熔點而使酵素活性降低。以下列出一般引子設計的原則〆
(1) 引子長度通常為 18～22 個鹼基。
(2) GC 比例為 40%～60%。
(3) 兩個引子的熔點相差不超過 5°C。
(4) 兩引子不可互補以免自相黏合。
(5) 注意模板 DNA 中所有可能與引子互補的區域並避開這些區域。
(6) 3′端的互補尤其重要。
實驗步驟〆
此實驗為利用 2-3 基因合成策略所提到的兩組 primer 合成兩個 PGB1 基因片 段 ， 在 近 一 步 接 合 形 成 完 整 的 PGB1 基 因 DNA， 最 後 接 入 pET 200/D-TOPO vector。
成分 最後濃度
dNTP 10 M
10 M 1-36 fp/78-117 fp 0.2 M 10 M 33-85 rp/117-174 rp 0.2 M 10X reaction buffer 1X
Klenow 1 (0.5 unit)
Total Volume 30 l
10X reaction buffer〆500 mM Tris-HCl (pH 7.2), 100 mM MgSO4 and 1 mM DTT.
如上表標示成分及其比例加入混合。兩組 primer 先於先加熱至 94℃、2min。
再降溫至室溫（25°C）30 分鐘，再加入 Klenow（invitrogen, Carlsbad, CA）於溫 度 30℃下反應 15 min。反應完後，加熱至 75°C 約 10 分鐘，執行電泳並做 gel extract
（Biokit, Taiwan）。加入相同於樣品體積的 binding buffer 充分混勻，加熱至 60°C，
10 分鐘。將 kit 中的 column 與收集管結合，接著在將混勻溶液加入 column，並 離心一分鐘，接著加入 washing buffer（含酒精）600 l，並以離心機 (Beckman Coulter Avanti® J-E Centrifuge, Fullerton, CA ) 14,000g 離心一分鐘。離心完後，捨 去收集管內的液體，再將新的 washing buffer 加入 column，並再以 14,000g 離心 一分鐘。將收集管內的液體移除，並再次離心 14,000g 離心三分鐘以去除剩餘之 酒精。最後，將 column 置入新的 eppendorf tube，並加入適量無菌水，離心沉澱，
即可獲得純化後產物。
純化後的基因片段以 Pst I 酵素於 37℃下反應 overnight 後，反應完後加熱至
60°C 以去除酵素活性，並進行 lean up 純化已被 digest 的基因片段。加入 ligase 將兩段基因片段接合，於 4℃下反應 overnight。最後，將接合產物（ligation product）
與 pET 200/D-TOPO vector（Invitrogen, Carlsbad, CA）於室溫下反應混合 30 min。
3-2 IPTG 誘導蛋白質表現 (Protein Expression)
Isopropyl-β-D-thio-galactoside （IPTG）誘 導的蛋白質 表現機 制是利用 IPTG 這種乳糖相似物誘導乳糖操縱子（lac operon），啟動表現下游的 T7 RNA 聚合酶
（ T7 RNA polymerase）， 接 著 T7 RNA 聚 合 酶 活 化 載 體 上的 T7 促 進 子 （T7 promoter），使得目標蛋白質被大量表現。由於 T7 RNA 聚合酶的活性遠高於 E. coli 原有的 RNA 聚合酶， E. coli 自身基因轉錄圖敵不過 T7 表現系統而使整個細胞 的資源被用在表現目標蛋白質上。以上由 lac operon 調控 T7 表現系統機制的 E.
coli，是與噬菌體 DE3 熔源化的菌株（例如 E. coli BL21(DE3)），帶有 lacI 抑制基 因和位於 lacUV5 啟動子下的 T7 RNA 聚合酶基因。另外，IPTG 雖能被 E. coli 所利用，但並不會被代謝，所以可以使得蛋白質穩定地表現。
Isopropyl-β-D-thio-galactoside （IPTG）
實驗步驟〆
將 序 列 確 定 的 菌 株 放 入 1ml LB 培 養 液 （ 以 下 LB 培 養 液 皆 含 有 0.02%
Kanamycin） 中 培 養 四小 時 。待 四 小 時培 養 後， 將 菌 液分 為 兩管 ， 並各 加 入 新 鮮 的 2.5 ml LB 培養液，其中一管加入 IPTG 至總濃度為 1 mM，兩管皆於 37°C 隔 夜培養（12～16 小時）。隔夜培養後，抽取 1ml LB 菌液，以 12,000 g 離心一分鐘 分離細菌。分離後的細菌以 100 l sample buffer（4% SDS，0.2% Bromophenol Blue，
20% Glycerol，200 mM DTT，100 mM Tris-HCl，pH6.8）回溶，再以超音波震盪 器（UP200S，Hielscher，German）以功率 70%，單次震盪 0.5 秒，震盪細菌一分
鐘共五個週期，使細菌破碎。再將破碎的細菌以 15% SDS-PAGE 確認蛋白質的表 現。
將小量表現成功的菌株取出 60 l 加入 3ml LB 培養液隔夜培養活化。隔夜培 養後，將飽和菌液取出 60 l 再次加入 3ml LB 培養液培養四小時，此為第二次活 化。第二次活化後，取出 300 l 菌液加入 300 ml LB 培養液，先培養四小時後再 加入 1 mM IPTG 隔夜培養。隔夜培養後，將菌液以 9,000 g 離心 20 分鐘以沉澱細 菌，移除 LB 培養液後加入 15 ml His-tag binding buffer （20 mM Imidazole，50 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，pH 7.2）回溶細菌。利用細胞破碎機（One Shot Model，
Constant Systems Ltd，UK）將細菌打碎，再以 12,000 g 離心 30 分鐘分離目標蛋 白質々此蛋白質 PGB1 為水溶性，故分離後是存在於上清液中。取出上清液再以 His-tag Column 純化。
3-3 聚丙烯醯胺膠體電泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）
電泳（Electrophoresis）係指帶電粒子在電場作用下，向著該粒子自身相反電 性方向的電極移動的現象々由於各粒子的帶電量可能不同而使遷移速率不同，故 能使不同的粒子分離。此現象早於 1808 年就被發現，但一直到 1937 年才第一次 被當作粒子分離方法並且該科學家（瑞典科學家 Tiselius）以此貢獻在 1948 年獲 得諾貝爾獎。但由於該電泳所使用的介質分辨率不佳且整體儀器造價昂貴，促使 在五零年代開始有許多科學家尋找更佳的電泳介質。直到六零年代 Davis 等科學 家發展出以聚丙烯醯胺（Polyacrylamide）作為電泳介質的電泳儀器[57]，使得此 技術變得更簡單方便，並擁有更佳的分辨率。
聚 丙 烯 醯 胺 膠 體 電 泳 是 一 種 不 連 續 膠 體 的 蛋 白 質 膠 體 電 泳 （ Gel electrophoresis），由焦集膠體（Stacking gel）和分離膠體（Separating gel）所組 成。兩膠體皆由聚丙烯醯胺（Polyacrylamide）所組成，但兩者的膠體孔徑不同、
pH 值不同、緩衝液離子成分亦不同。這三種不同使得蛋白質混合液在焦集膠體中 進入分離膠體前壓縮成一條狹窄的區帶，而進入分離膠體後，蛋白質隨著空間中 的電場遷移，因各個蛋白質所帶淨電荷不相同造成不同的遷移速率，又因分離膠 體的孔徑很小造成不同分子大小和形狀的蛋白質表現出不同的遷移速率。到了六
（Sodium dodecyl sulfate，SDS）的帶電清潔劑作為蛋白質變性劑能夠使得蛋白質 變性而去除蛋白質本身形狀造成的遷移率差異，而且與 SDS 的結合使蛋白質表面 均勻帶電進而使蛋白質電泳的遷移速率只與其本身的分子量大小有關[58], [59]。
使用 SDS 的聚丙烯醯胺膠體電泳常簡稱做 SDS-PAGE。
3-4 蛋白質變性 (Protein Denaturation)
蛋白質變性係蛋白質的結構受到破壞或影響使 之與原來的構型不相同，這可 能造成許多的影響，例如聚集沉澱或失去其生理活性。蛋白質的變性可以發生在 蛋白質的各級結構〆在四級結構的變性，蛋白質的次級單元分離或是在空間排列 生發生錯亂々在三級結構的變性，主要影響的是各個胺基酸殘基的共價鍵（例如 雙硫鍵）、極性胺基酸彼此或與溶劑之間的偶極耦合交互作用（例如 Salt bridge），
以及非極性胺基酸之間的凡德瓦力和疏水性作用（Hydrophobic interaction）々在 二級結構的變性，蛋白質失去原有的胺基酸排列的模式包括α-helix、β-sheet、β-turn 等。不過，蛋白質變性並不包括其一級結構[60]。
穩定蛋白質結構最主要的作用力是疏水性作用、氫鍵（ Hydrogen bonds）和 離子作用（Ionic interaction），故大多數的變性因素是影響這些作用力而變性蛋白 質，包括溫度、pH（酸鹼）、有機溶劑、變性劑、還原劑、機械力等等 。變性劑
（Denaturant）主要是破壞蛋白質內部的疏水性作用和氫鍵，常用的變性劑如 鹽酸 胍（Guanidine hydrochloride）和尿素（Urea）。而還原劑是將雙硫鍵還原為兩個 硫 氫 基 ， 這 可 能 造 成 蛋 白 質 三 級 結 構 崩 毀 ， 常 見 的 還 原 劑 有 1,4- 二 硫 蘇 糖 醇
（Dithiothreitol，DTT）和 2-巰基乙醇 (β-mercaptoethanol)。
3-5 蛋白質摺疊 – 過臨界點摺疊法（Over-critical Folding Process）
此蛋白質摺疊方法以階段性熱平衡透析法為基礎，以透析法使變性的蛋白質 在一個緩慢變化的環境逐步摺疊成自然態，此透析過程稱作準靜過程（quasi-static process）[4, 7]。我們認為在 蛋白質 摺疊 反 應相圖中 包含 了一個 相轉變 線（phase transition line）或稱為相轉變區間（phase transition region），而且此相轉變線有一
臨界範圍，因此設計出一個繞過態轉變線的蛋白質摺疊方法，稱作過臨界點摺疊 法（over-critical folding process）[5, 6]。這樣的摺疊方法主要是藉由 urea 和 pH 值的逐步改變使蛋白質摺疊，並利用了 mannitol 作為蛋白質摺疊時的化學輔佐子
（chemical chaperone）[5, 61]以保護並穩定蛋白質的摺疊中間態。
實驗步驟〆
將蛋白質 PGB1 以高鹼性及高 urea 濃度的 denature buffer （8 M urea，0.1%
mannitol，10 mM Tris，pH 12）變性後，利用 MWCO 為 3.5 kDa 的透析膜逐步透 析至 M1、M2、M3、M4和 M5等五個摺疊階段緩衝液（各成分如表三所示），每次 皆以 2,500 ml 摺疊緩衝液透析並至少二次。透析膜須以 0.1 M EDTA 水溶液於高 溫（> 80°C）浸泡約五分鐘以除去透析膜上殘存的金屬離子，再以二次去離子水 清洗後方可使用。
因為需要觀察各摺疊中間態的蛋白質，故在每一階段透析完成後，便從透析 膜中取出適量的蛋白質溶液並以吸收光譜測量濃度，其餘的蛋白質溶液收回透析
因為需要觀察各摺疊中間態的蛋白質，故在每一階段透析完成後，便從透析 膜中取出適量的蛋白質溶液並以吸收光譜測量濃度，其餘的蛋白質溶液收回透析