1-1 研究動機與目的
蛋白質是組成生物體的一個很重要的分子，是由一系列的胺基酸以不同比例 組成不同長度並各自擁有特定結構的巨分子。這些特定結構與其功能有很大的關 係，但是如何從一團混亂的狀態摺疊成特定的構型仍未明瞭々以最簡單的想法，
假若一個蛋白質有 100 個胺基酸，每個胺基酸之間具有兩個可以旋轉的鍵結，每 個鍵結擁有二到三個自由度，則這個蛋白質會有 4100～9100個可能的構型。但實際 上，蛋白質通常只有一個特定的構型，要排出如此多的可能構型勢必使蛋白質的 摺疊所需時間大大增加，但實際上蛋白質傴需毫秒甚至是微秒時間便可摺疊完畢，
因此人們對於蛋白質的摺疊充滿了好奇並積極地去了解其過程。故在此論文中，
我們利用螢光共振能量轉移這種技術直接地去觀察蛋白質內部在摺疊過程的變化，
去推敲蛋白質的摺疊過程。
1-2 蛋白質結構
蛋白質為多種胺基酸以不同比例所組成的生物巨分子 ， 這些胺基酸的序列稱 為一級結構，二級結構主要是由主鏈中胺基之間的氫鍵形成的結構，亦包含局部 殘基（residues）之間的氫鍵々最常見的就是 α-helix、β-sheet 以及 turn。三級結 構則的是蛋白質的整體構型。四級結構則是多種蛋白質彼此以特定的方式形成的 複合體[1]。
1-3 蛋白質摺疊
蛋白質摺疊是一種物理現象指的是一條胺基酸序列鏈如何從一個在空間中隨 意排列的構型形成特定且具有功能的構型[1]。這些特定的構型通常為能量最低態，
當某蛋白質摺疊至其特有且具有功能的構型時，我們稱該構型狀態為自然態。摺 疊至自然態構型包含了溶劑的參與、鹽濃度的改變、溫度變化以及輔助分子等等。
一般認為蛋白質的胺基酸序列決定了其自然態構型[2]。
1-4 蛋白質摺疊方法
直接稀釋法（Direct Dilution）
顧名思義是以單一步驟的溶液置換使蛋白質快速從高變性劑環境進入無變性 劑環境，從而使蛋白質摺疊，又稱作直接反應法（off-path）。以此方法必須將蛋 白質維持在非常低的濃度底下才能進行，蛋白質的摺疊效率隨著蛋白質濃度的增 加而下降[3]。
階段性熱平衡透析法（Stepwise Thermal Equilibrium Dialysis）
此方法是透過逐步緩慢的去除溶液中的變性劑，一般是利用透析法，由於變 性劑置換的過程十分緩慢，對蛋白質摺疊而言幾乎為靜止狀態，故又稱作準靜過 程（Quasi-static process）[4]。此法能夠大量地摺疊蛋白質至其自然態，避免造成 錯誤的摺疊或聚集[4-7]。
1-5 蛋白質摺疊理論模型 Framework Model
此理論由 Ptitsyn[8]所提出，蛋白質的摺疊是先形成二級結構，因此完成了整 個蛋白質結構的架構（framework）再進而形成三級結構。不穩定的二級結構區段 先形成再凝聚使整個胜肽鏈變的緊密，最後形成三級結構。
Hydrophobic Collapse Model
此理論認為蛋白質摺疊最主要的驅動力是由疏水性作用造成，親水環境驅使 疏水性胺基酸非特定的聚集。這項理論可以解釋為何蛋白摺疊速度如此快速。此 理論的實驗證明是蛋白質 barstar 的摺疊研究[9]。
Nucleation-condensation Growth Model
一個任意的蛋白質序列擁有的可能構型數量極為可觀，但其 摺疊 傴發生在一 個極短的時間內 變達到其自然態，故此理論利用蛋白質結構的 核化（nucleation）
來解釋如此快速的摺疊[10, 11]々如此一來，蛋白質所擁有的可能構型經過核化後
便能大量減少，因此加速了摺疊的速度。這些核化的區域是由彼此相鄰的胺基酸 殘跡組成的二級或三級結構，接著核加速了四周的結構成型，而這些周邊的結構 又使得核的結構更為穩定[12]。
The Diffusion-collision Model
1976 年由 Karplus 和 Weaver[13, 14]所提 出，認為蛋 白質是 許多 微 小區 間
（ micro-domain）的組合，在摺疊初期各個微小區間藉由擴散碰撞尋找到最穩定 的結構，接著再逐漸為調至自然態。
First-order-like Phase Transition
此理論是本實驗室於 2002 年提出[4]，指出蛋白質在準靜態熱力學平衡的摺 疊模型與 Landau 的一階相變（first-order phase transition）相似，系統相圖（phase diagram）中具有一個有限長度的 相變線（transition line），若此一相變線存在一次 微分不連續，則此稱為一階相變，通常此不連續出現在其端點，此點稱作特異點
（critical point）々此相變區隔出線兩旁的相區，此線上為兩相共存狀態，若繞過 此特異點，儘管相已改變，仍不會觀察到相轉變現象。而蛋白質摺疊穿過相轉變 區，則此蛋白質會發生沉澱或是玻璃態（ glassy）的未摺疊態。故透過 stepwise thermal equilibrium dialysis 可以繞過此相轉 變區，使蛋白質正確的摺疊。
圖一〆蛋白質摺疊似一階態轉變示意圖
Φ(n1, n2, ..)表 示蛋 白 質摺 疊 狀態 （the order parameter ） 々而 n1、n2 代表 著 各項 會 影響 摺疊 狀 態 的參數像是溫度、變性劑的濃度等等[7]。
1-6 蛋白質 PGB1（Protein G B1 Domain）
PGB1 的自然功能
Protein G 是一個多功能區蛋白質（mutlidomain protein），存在於 Group C 和 G Streptococcus 的細胞表面，一般認為該種細菌可以藉由此蛋白質與宿主的 免疫 球蛋白（Immunoglobulin G，IgG）結合而躲避宿主身體的防禦系統[15-19]々Protein G B1 IgG-Binding Domain （PGB1）是 Protein G 的一個功能區（domain）對 IgG 的 hFc 上的 CH2-CH3區域（即第二與第三個 Heavy Chain Constant Domain）有很 強的親和力[20, 21]，無論是對於 monoconal 或 polyclonal IgG 都有很好的偵測或 分離特性[22, 23]々對 IgG 的 Fab 區域（the antigen-binding region）的親和力傴只 有對 Fc 區域的 10% [22, 23]。X-ray 結晶結構顯示一個 IgG 能與兩個 PGB1 鍵結
（圖二，PDB〆1FCC）[21]。
圖二〆(a)蛋白質 PGB1 上負責與 Fc 區域鍵結的胺基酸々(b)PGB1 與 IgG 上的一個 Fc 區域鍵結 的結構圖（PDB〆1FCC）
CH3
CH2 PGB1
(a) (b)
PGB1 的蛋白質結構
蛋白質 PGB1 擁有 56 個胺基酸（包含 N 端的 Met），中間序列形成一個α-helix
（Ala23-Asn36）躺在由四個 β-strand （β1〆Met1-Leu9々β2〆Lys12-Ala20々β3〆 Glu42-Tyr45々β4〆Lys50-Thr55）組成的 β-sheet 之上々β1 和 β2 以及 β3 和 β4 分 別形成兩端的 β-hairpin （β-hairpin1〆Met1-Ala20々β-hairpin 2〆Glu42-Thr55）[24]。
由於不包含半胱胺（Cys）或脯胺酸（Pro）等會形成較複雜蛋白結構的胺基酸，
PGB1 非常適合做為研究蛋白質摺疊研究。又由於 PGB1 只擁有 56 胺基酸，故常 被用作分子模擬的模型蛋白質。另外，將 近 95%的 GB1 胺基酸都參與了二級結構 的組成，並包覆了一個緊密的疏水核心，以及超過 70%骨幹上的 amide 和 carbonyl 都形成了氫鍵，因此擁有非常高熱穩定性[25],[26]，無論是對熱或 urea 引貣的變 性都有很好的抵抗性[24]，且可由熱變性中回復原有結構[26]。PGB1 的 β-hairpin 2 被發現能夠穩定地單獨存在於水溶液中[27]，且此獨立出來的 β-hairpin 摺疊時 間約為 6 s [28]。
1 11 21 31 41 51
MTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE
-strand -helix
圖三〆PGB1 以卡通（cartoon）模式表示的二級結構圖
α-helix 以紅色表示，β-strand 或 β-sheet 則以藍色表示。（PDB〆1pga）
β2 β1
β4 β3
β1 β2 β3 β4
PGB1 的摺疊
PGB1 屬於小型 蛋白 質，因 此在 早期被 認 為此蛋 白質的 摺疊 會如 同其他 小型 蛋白質一樣遵循二狀態反應（two-state reaction）[24, 26, 29]。而此蛋白質的摺疊 是否為存在中間態（intermediate）目前還有些爭議[30-32]。但多數的研究結果都 指 出 蛋白 質 PGB1 的摺疊最初期存在一個與自然態類似的疏水核心。 氫氘交換
（ hydrogen-deuterium exchange ） 和 核 磁 共 振 光 譜 （ nuclear magnetic resonance spectrum）的研究指出 PGB1 的 β-hairpin 2 以及 α-helix 的中間區段與 N 端區段在 摺疊過程初期即不易進行氫氘交換且此區的胺基酸的動態（mobility）顯然較與其 他 區 域 來 的 慢 ， 故 認 為 此 區 域 在 摺 疊 初 期 扮 演 了摺 疊 核 心 的 角 色 [33], [34]。 以 continuous-flow fluorescence 測量 PGB1 上的 Trp43 螢光動態變化的研究結果推測 PGB1 的摺疊初期存在一個與自然態類似的疏水核心[35]。分子模擬也給予相同的 推論，S. Kmiecik 和 A. Kolinski [36]於 2008 年以 CA-CB side (CABS) chain model [37]與蒙地卡羅模擬（Monte Carlo simulation）得到 PGB1 的摺疊為多狀態反應
（multi-state reaction），摺疊由 α-helix 與 β-hairpin 之間的疏水胺基酸聚集形成摺 疊核心（Phe30、Trp43、Tyr45 和 Phe52），再由其他的疏水胺基酸繼續聚集形成 二級結構，最後達到自然態。另外，David Baker [38]等人於 2000 年針對 PGB1 的 β-sheet formation 的研究發現，在 β-hairpin1 與 α-helix 上的點突變對整體結構 影響最小，而在 β1、β3 和 β4 的點突變對整體影響較大，故認為可能會存在由三 個 β-strand 組成的 β-sheet 的中間態結構。
1-7 螢光焠熄（Fluorescence Quenching）
螢光焠熄（fluorescence quenching）一般泛指任何能造成螢光強度減弱的效應，
其中因分子交互作用造成的螢光焠熄包括了激發態反應（excited-state reaction）、
分子重排（molecular rearrangements）、能量轉移（energy transfer）、基態錯合物
（ground-state complex formation），以及碰撞焠熄（collisional quenching）[39]。
在此研究中，我們利用碰撞焠 熄 （又可稱作動態 焠 熄 dynamic quenching）對於 PGB1 內部的 Trp43 的螢光焠熄能力來比較在各個摺疊狀態下 Trp43 包埋於蛋白質 內部的程度。欲達到此目的，我們利用 acrylamide 這種中性的小分子焠熄劑來焠
熄 Trp43 的螢光。Acrylamide 能特別針對色胺酸的螢光進行焠熄的效應[40]，此 分 子 很 小 且 為 中 性 能 夠 藉 由 擴 散 進 入 蛋 白 質 內 部 的 疏 水 核 心 [41, 42] 々 故 acrylamide 的螢光焠熄能力會受到擴散速率的影響，及越接近蛋白質內部的色胺 酸越不容易被焠熄，因此能夠利用此螢光焠熄能力的變化來了解色胺酸在包埋於 蛋白質內部的程度。
圖四〆acrylamide 結構式
1-8 四氯金酸（Chloroauric acid，HAuCl4）
化學式 HAuCl4，一般以 HAuCl4〃4H2O 存在，黃色針狀結晶，易溶入水。由 王水（濃鹽酸和濃硝酸按 3 比 1 混合制得）和純金反應製得。HAuCl4的腐蝕性能
極強，氧化性也極強，它能腐蝕一切金屬。但 HAuCl4 不穩定，加熱即可分解成
HCl，AuCl3和 AuCl。在水中以檸檬酸根還原 HAuCl4製得奈米金粒子[43, 44]。
HAuCl4 是一個平面分子，由中間一個金離 子外面四個 氯離子組成。HAuCl4 的吸 收光譜在 217 和 287 nm 各有一個特徵峰[45]。我們實驗室發現，HAuCl4可以焠 熄 Tryptophan 的螢光，但目前機制並不明瞭。
圖五〆HAuCl4結構式
1-9 螢光共振能量轉移（Fluorescence Resonance Energy Transfer）
螢光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）是一種發 生在兩個很靠近的發光基團之間的能量轉移的機制々由德國科學家特奧多〄福斯 特（Theodor Föster）於 1946 年所發現，故此機制應正確地稱為福斯特共振能量
螢光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）是一種發 生在兩個很靠近的發光基團之間的能量轉移的機制々由德國科學家特奧多〄福斯 特（Theodor Föster）於 1946 年所發現，故此機制應正確地稱為福斯特共振能量