實驗結果

4-1 基因序列

目標 PGB1 基因序列全長為 178 bp（如圖十三中的 PGB1 G9C 基因所示），接合入 pET200 基因載體中 E. coli BL21( DE3)系統表現蛋白質。接入 pET200 基因載體後 的 PGB1 基因可以利用 PGB1 fp 和 T7 rp 或 T7 fp 和 PGB1 rp 確認目標基因為正確 方向接入載體中（如圖十二和圖十四所示）。

圖十二〆以 PGB1 fp 與 T7 rp 所挑選放大的 PGB1 wt 基因

以 PGB1 fp 與 T7 rp 所挑選放大的 PGB1 wt 基因長度應為 245 bp（箭頭所指處），並且藉此確認 目標 PGB1 基因是正確 地接合入 pET200 基因載體中。

bp

500 400 300 200 100

圖十三〆PGB1G9C 基因

PGB1 基 因全 長 為 178 bp（ 箭 頭所 指 處）， 利用 預 先 設計 好 的 PGB1 G9C fp 與 PGB1 rp 進行 PCR 反應以此送交基因定序。

圖十四〆以 T7 fp 與 PGB1 rp 所挑選放大的 PGB1 A23C 基因

以 T7 fp 與 PGB1 rp 所挑選放大的 PGB1 wt 基因長度應為 371 bp（箭頭所指處），並且藉此確認 目標 PGB1 A23C 基因是正確地接合入 pET200 基因載體中。

bp

500 400 300 200 100

M 1 2 3 4

bp

500 400 300 200 100

4-2 大量表現並純化 PGB1 蛋白質

將帶有 pET200-pgb1 基因的 E. coli BL21( DE3)以 IPTG 誘導表現至少八小時，

破菌後 12,000 離心 20 分鐘，再從上清液純化帶有 His-tag 的 PGB1。以 15%

SDS-PAGE 確認表現和純化效果。大約 1.8 公升菌液可以得到約 40 mg 的蛋白質 PGB1々純化後的蛋白質純度至少 96%。各突變株皆以相同方式獲得。蛋白質 PGB1 的分子量約為 10 kDa。

圖十五〆蛋白質 PGB1（包括突變株）表現效果以及從上清液純化效果

圖(a)~(c)中，各 lane 的表示為〆M，Unstained Protein Marker (mid range) (3.5 L)々1，表 現 PGB1 wt 之破 菌 後上 清 液々2，通過 His-tag column 後 的 上清 液 々3， 純化 後 PGB1 wt (a)、A23C (b)或 G9C (c)。 以上 皆 是 15% SDS PAGE。

kDa 116.0 66.2 45.0 35.0 25.0 18.4 14.4

M 1 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3

(a) (b) (c)

4-3 摺疊後 PGB1 功能測試 (ITC 實驗)

此實驗係 為了確 認摺 疊後之 蛋白質 PGB1 是否還具 有自然 與免 疫球蛋 白質

（IgG）結合的能力。自然狀態下，一個 IgG 能與兩個 PGB1 鍵結。PGB1 與 IgG 的鍵結與其三級結構有關。

以 47.4 nmole 摺疊後的 PGB1 wt 與 10.8 nmole rabbit IgG 進行滴定作用，觀 察每一次作用的熱量變化。所使用的緩衝液為 phosphate buffer saline (pH 7.4)。圖 十六(a)為每一次滴定作用所造成的熱量變化，總共有 20 次滴定作用。圖十六(b) 為每 次熱 量 的變 化 量與 各次 滴 定狀 態 下的 蛋白 質濃 度 比例 。 結果 顯示 摺 疊後 的 PGB1 wt 與 IgG 的結合比率為 2:1，與自然狀態摺疊的 PGB1 wt 狀態[21]相同々反 應常數為 ，莫爾反應熱為 。

0 1 2 3 4 -1

0 1 2 3 4

Heat (W)

[L]/[M]

Heat

0 1 2 3 4

0 10 20 30 40 50 60 70

d Q /d A m o u n t (k J /m o l)

Molar Ratio [L]/[M]

n = 2

K = 3.51 × 10¹³ M⁻² ΔH = 127.8 kJ/mol

圖 十 六 〆 Over-critical Refolding Process 摺 疊 後 的 PGB1 wt 與 IgG 的 Isothermal Titration Calorimetrics 結果 。(a)每 次滴 定 作用 的 功率 變化 。 (b)每 次 滴定 作 用的 莫 爾熱 變 化。

(a)

(b)

4-4 蛋白質摺疊中間物之螢光光譜變化

利用 295 nm 激發光，我們能夠觀察 Trp 這個疏水性胺基酸環境的變化。隨著 Over-critical Folding Process 摺疊，蛋白質 PGB1 wt 的 Trp43 螢光整體逐漸增強（圖 十七）々傴在 M₂進入 M₃摺疊態時有個明顯的下降的現象，可能與 urea 保護了蛋 白質使所受的高 pH 變性的程度減低。在 8 M Urea 和 pH 12 環境（denatured 狀態）

底下變性的 PGB1 wt 的螢光強度或說 Trp43 的螢光量子產率（fluorescence quantum yield）傴約只有摺疊至 M5狀態下的三分之一々將環境中的 urea 逐漸地減少並維 持在 pH 11 的高鹼性，PGB1 wt 的螢光便逐漸地增強，當 pH 下降到 8.8 時，整體 的螢光強度立刻增強原有的一倍々M4狀態下地螢光略強於 M5狀態可能是因為有 了 mannitol 這種化學輔佐子穩定蛋白質結構使得 M₄狀態下的 PGB1 wt 略較穩定 而有較強的螢光強度或螢光量子效率。

另外，從螢光光譜波峰波長（Emission Maximum，λ_{ma x}）的變化為藍位移（圖 十七內插圖），意為波峰往低波長移動。在 denatured 狀態下，λma x位在較大的波 長 345.0±0.4 nm々M₁狀態下，λmax為 341.4±0.4 nm々M₂，341.4±0.4 nm々M3，341.6±0.4 nm々M4，341.2±0.4 nm々M5，340.8±0.4 nm。λma x變化與 Trp43 所處的周遭微環 境變化有關，當 Trp 在極性很強的環境中時，其螢光光譜波峰波長會出現在約 350 nm，而當 Trp 在非極性（疏水性）強的環境中，波峰的位置便會下降到約 325 nm々 因此，從 PGB1 wt 的 λ_{ma x}變化可以得知 Trp43 周遭的環境在 denatured 環境下是 暴 露 在 高 極 性 環 境 中 ， 隨 著 摺 疊 而 被 包 埋 入 蛋 白 質 的 疏 水 核 心 （ hydrophobic core）。

350 400 450 500

Relative Fluorescence (arb. unit)

Wavelength (nm)

Folding State Emission Maximum λma x (nm)

4-5 蛋白質摺疊中間物之圓二色光譜變化及二級結構比例分析

（self-consistent）[79, 80]方法解析在 M5狀態下的 PGB1 wt 的 SRCD 光譜，可以 得到 PGB1 主要的二級結構比例〆α-helix，12.9%々β-sheet，25.8%々Turn，11.2%。

圖二十一顯示 PGB1 wt 與各突變株的圓二色光譜相似，表示突變位置不影響 PGB1 原有的二級結構比例。

190 200 210 220 230 240 250 260

-10

[θ ]

MRE



(×103 deg cm2 dmol-1 )

Wavelength (nm)

D M

[θ ]

MRE 222(×103 deg cm2 dmol-1 )

Folding State

圖十九〆PGB1 在 222 nm 波長的圓二色光譜變化

175 200 225 250

-8 [θ] MRE (×103 deg·cm-1 dmol-1 )

圖二十〆PGB1 wt 在 M5狀態的同步輻射圓二色光譜

190 200 210 220 230 240 250 260 -10

-5 0 5 10

[θ ]

MRE



(×103 deg cm2 dmol-1 )

Wavelength (nm)

PGB1 G9C PGB1 A23C PGB1 wt

圖二十一〆PGB1wt 與各突變株的 同步輻射圓二色光譜

4-6 蛋白質摺疊中間物之水合直徑分析結果

水合直徑分析的結果顯示 PGB1 wt 的水合直徑在 denatured 環境中(8 M urea, pH 12)為 6.6 nm，接著 在 pH 11 逐漸降低 urea 濃度，在 M1狀態為 5.9±0.3 nm，

M₂狀態為 5.4±0.1 nm，M₃狀態為 5.3±0.2 nm，又當 pH 下降到 8.8 時（M₄狀態），

直徑突然下降到 4.4±0.2 nm，最後移除了作為 chemical chaperone 的 mannitol 而到 了 M₅狀態後，蛋白質直徑略為下降到 4.2±0.2 nm。PGB1 wt 的 X-ray 結晶結構表 示的凡德瓦直徑（Van der Waal diameter）約為 3.4 nm，若再加上水合層，其水合 直徑可達 3.9 nm。因此 M₅狀態的 PGB1 wt 與 X-ray 結晶結構所揭示的 PGB1 大 小幾乎相同。

D M1 M2 M3 M4 M5

4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0

4.1 +/- 0.2 4.4 +/- 0.2

5.3 +/- 0.2 5.9 +/- 0.3

5.4 +/- 0.1 6.6+/- 0.0

Diameter (nm)

Folding State

圖二十二〆動態光散射之 GB1 wt 蛋白質分子水合直徑隨摺疊狀態變化圖

4-7 螢光焠熄光譜變化

Acrylamide（丙 烯 醯 胺） 被 認 為可 以 擴 散 的 方式 進 入 蛋白 質 內 部， 若 該 蛋 白 質具有色胺酸，則該色胺酸的螢光會被 acrylamide 所焠熄々因此，利用 acrylamide 對蛋白質上色胺酸的螢光焠熄能力程度變化可以相互比較得知色胺酸在蛋白質中 曝露或包埋的程度。將不同摺疊狀態下的 PGB1 以 acrylamide 焠熄其螢光以了解 其 Trp43 包埋的程度，各螢光光譜變化如圖二十三～圖二十八所示。以螢光焠熄 對原有螢光強度比例（F/F0）對 acrylamide 濃度作圖，可以得到關係常數 KSV，再 除以該狀態下 PGB1 的螢光壽命（lifetime）便能得到 acrylamide 的螢光焠熄能力 kq（表六）。從圖二十九可以看到 kq在 denatured 狀態下最強，為 3.37×10⁹ M^-1s^-1々 M₁~M₂狀態下有略大於自然態（M₅）的值，約為 1.8×10⁹ M^-1s^-1々M₄和 M₅狀態下 有最小值，約為 1.5×10⁹ M^-1s^-1。以上變化顯示在 denatured 到 M1過程中有一個作 用很快的將曝露出來的非極性的 Trp43 包埋保護，隨著 over-critical folding process 摺疊後 Trp43 是被包覆貣來的。

Relative Fluorescence (arb. unit)

Wavelength (nm)

圖二十三〆PGB1 wt 在 denatured 狀態下被 Acrylamide 焠熄螢光的 Stern-Volmer 關係圖，K_{S V}=3.37

×10⁹ M^-1s^-1

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08

325 350 375 400 425 450

0.0

Relative Fluorescence (arb. unit)

Wavelength (nm)

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08

1.0

325 350 375 400 425 450

0.0

Relative Fluorescence (arb. unit)

Wavelength (nm)

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 1.0

1.1 1.2 1.3

325 350 375 400 425 450

0.0

Relative Fluorescence (arb. unit)

Wavelength (nm)

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08

1.0

325 350 375 400 425 450

0.0

Relative Fluorescence (arb. unit)

Wavelength (nm)

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08

325 350 375 400 425 450

0.0

Relative Fluorescence (arb. unit)

Wavelength (nm)

表六〆由 Acrylamide 焠熄 PGB1 wt 的 Trp43 螢光之結果總表

Folding State Stern-Volmer Constant

Fluorescence Lifetime ^a

Quenching Constant ^b KSV (M^-1) τ0 (ns) kq (×10⁹ M^-1s^-1)

Denature 7.92 1.8 3.37

M1 4.86 2.9 1.73

M2 5.82 3.2 1.79

M₃ 4.36 2.4 1.81

M4 7.61 5.1 1.48

M5 7.36 4.9 1.52

a〆由各 狀 態的 螢 光強 度 推算 得 知。

b〆kq與 KSV的關係為kq 0 KSV，可由 Stern-Volmer 方程式得知。

4-8 螢光共振能量轉移受體接合結果

測量接合了 IAEDANS 的 PGB1，以上述公式計算便可以獲得其中的蛋白質含量[P]

和 IAEDANS 含量[F]，兩者相除（[F]/ [P]）便得到溶液中蛋白質與 IAEDANS 的 接合比率。圖三十一和圖三十二各為接合比率 95.7%和 89.8%的 PGB1 G9C 和 PGB1 A23C。

250 275 300 325 350 375 400 425 450

0

240 290 340 390 440 490 0.000

0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030

Absorbance

Wavelegnth (nm)

圖三十一〆PGB1 G9C-I 吸收光譜

240 290 340 390 440 490

0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040

Absorbance

Wavelenth (nm)

A₂₈₀=1.90×10^-2 A₃₃₆=9.04×10^-3 [F]/[P]=89.8%

A280=1.44×10^-2 A336=7.25×10^-3 [F]/[P]=95.7%

4-9 螢光共振能量轉移之 Förster Distance (R₀)變化

欲計算分析螢光共振能量轉移（FRET）距離就必須先計算出在各個摺疊狀態 下的 Förster Distance (R0)，以得到正確的距離。

6 5 2 4

0 8 79 10. _D ( ) R   ^ Q  n J^ 

如方程式所示，R0主要受到螢光供體的螢光量子產率（QD）、折射率（n）和 光譜重合區域（J(λ)）所影響。光譜重合區域指的是 FRET donor 的標準化發射光 譜（normalized fluorescence spectrum）與 FRET acceptor 的以消光係數（extinction coefficient ） 表 示 的 吸 收 光 譜 ， 兩 者 的 重 合 面 積 。 此 實 驗 所 使 用 的 FRET acceptor—IAEDANS，在不同的 pH 值的環境中，其吸收光譜幾乎沒有變化（ 圖三 十三）々而 Trp43 的螢光光譜傴只有小幅度的位移（圖十七），因此在這邊不考慮 光譜重合區域變化。溶液的折射率的改變也會造成 R0的改變，增加 urea 濃度會 增加溶液的折射率而造成較小的 R₀值々其折射率可以由 urea 與溶液折射率關係 式推算[81]。整合以上，已知色胺酸與 IAEDANS 的 R0在水溶液（pH 7.0）中為 22 Å [39]，R₀計算方程式可簡化成〆

4 4

6

0 22 ( 0 _D) (( _D 0))

R   n Q n Q

Q0、n0、QD和 nD表示標準能量轉移供體的螢光量子產率、標準溶液折射率、

蛋白質的螢光量子產率和摺疊溶液折射率。為此實驗的 FRET donor—Trp43 的螢 光量子產率由 Tryptophan 在 pH 7 的水中（25°C）作為標準螢光量子產率（0.14）

推算，在 M₅狀態的 PGB1 wt 的螢光量子產率為 0.26。標準溶液折射率則為水在 pH 7.0，25°C（1.335）。PGB1 G9C 於各摺疊狀態的 R0〆Denatured，17.5 Å 々M1， 17.3 Å 々M2，16.7 Å 々M₃，17.0 Å 々M₄，22.4 Å 々M₅，22.2 Å 。A23C 於各摺疊狀 態的 R0〆Denatured，19.5 Å 々M1，21.6 Å 々M2，22.2 Å 々M3，21.2 Å 々M4，24.0 Å 々 M₅，23.9 Å 。以上整理如表七。整體上，R₀隨著摺疊過程增加。

260 310 360 410 460

4-10 螢光共振能量轉移螢光光譜

將接合了 IAEDANS 的蛋白質 PGB1 G9C 和 A23C（簡稱為 PGB1 G9C-I 和 PGB1 A23C-I）各自皆以 over-critical Folding Process 摺疊，並且觀察各個摺疊過 程中的蛋白質螢光光譜。PGB1 G9C-I 和 A23C-I 的 Trp 螢光光譜（圖三十四、圖 三十五）因為加上了 IAEDANS 這個 FRET 受體，原來的蛋白質的 Trp 螢光強度 被減弱並且大約在 460 和 490 nm 多了 IAEDANS 因能量轉移所發出的螢光。將這 些被減弱的 Trp 螢光比上不存在 IAEDANS 的 Trp 螢光便可得知螢光能量轉移的 效率々各蛋白質在各摺疊狀態的能量轉移效率整理如表八和表九所示。能量轉移 效率計算公式如下〆

1 _{DA D} E F F

PGB1 G9C-I 的螢光共振能量轉移效率在各狀態下各為〆Denatured，59.8%々 M₁，84.2%々M₂，87.8%々M₃，86.6%々M₄，92.1%々M₅，91.9% （表八）。PGB1 A23C-I 的螢光共振能量轉移效率在各狀態下各為〆Denatured，56.8%々M1，81.9%々 M₂，83.7%々M₃，80.7%々M₄，88.9%々M₅，88.4%（表九）。兩個蛋白質的螢光 共振能量轉移效率都隨著摺疊而逐漸增加，表示 FRET donor 與 acceptor 的距離逐 漸接近々螢光共振能量轉移效率 E 與 R₀有代入以下關係式以得到螢光共振能量轉 移供體與受體之間的距離 r〆

6 6

6

0 / 0

r R ER

PGB1 G9C 和 A23C 各狀態下的供體受體之間的距離整理如圖三十六、圖三 十七。PGB1 G9C 在各個摺疊狀態下的距離變化〆Denatured，21.3 Å々M1，18.6 Å 々 M2，18.8 Å 々M₃，17.0 Å 々M₄，16.1 Å 々M₅，16.0 Å 。PGB1 A23C 在各個摺疊狀 態下的距離變化〆Denatured，18.6 Å 々M1，16.8 Å 々M2，16.7 Å 々M3，16.7 Å 々 M₄，17.0 Å 々M₅，17.0 Å 。很明顯地，兩者的距離變化趨勢不盡相同，PGB1 G9C 的距離變化所呈現的為三階層轉變（three-state transition），而 PGB1 A23C 的距離 變化所呈現的為二階層轉變（two-state transition）

350 400 450 500 0

200 400 600 800 1000

Fluorescence (arb. unit)

Wavelength (nm)

D M₁ M₂ M₃ M₄ M₅

310

圖三十四〆PGB1 G9C-I 隨摺疊狀態改變的螢光光譜

表八〆PGB1 G9C-I 的光譜強度變化與螢光共振能量轉移效率

Folding State Fluorescence

Intensity FRET Efficiency Distance

f (arb. unit) E (%) r (Å )

Denatured 305.3 59.8 21.3

M₁ 207.6 84.2 18.6

M₂ 184.5 87.8 18.8

M3 151.3 86.6 17.0

M4 191.6 92.1 16.1

M5 187.0 91.9 16.0

350 400 450 500 0

200 400 600 800 1000

310

Fluorescence (arb. unit)

Wavelength (nm)

D M₁ M₂ M₃ M₄ M₅

圖三十五〆PGB1 A23C-I 隨摺疊狀態改變的螢光光譜。

表九〆PGB1 A23C-I 的光譜強度變化與螢光共振能量轉移效率。

Folding State Fluorescence

Intensity FRET Efficiency Distance

Intensity FRET Efficiency Distance

在文檔中 以螢光共振能量轉移揭示蛋白質PGB1分子內摺疊機制 (頁 40-69)