(3-aminopropyl)triethoxysilane (APTS)交聯(cross-linking)包覆在 rFND-COOH 表 面，粒徑大小分別是61 ± 3 nm 和 166 ± 9 nm，相較 rFND-COOH 的大小，估計 APTS 包覆在表面的厚度皆約為 10 nm，其表面電位分別是-17.8 ± 0.7 mV 和-25.4
± 0.9 mV。由於 APTS 是直接包覆在 rFND-COOH 表面，內部 rFND-COOH 的表 rFND-COOH、rFND-Tf 和 rFND-NH2，對胞吞作用的專一性和效率。海拉細胞培 養在含有10 %胎牛血清的培養基中，三片直徑 12 毫米的蓋玻片上各種 5 × 105
(b) rFND-COOH 在不含胎牛血清的培養基，(c) rFND-Tf 和(d) rFND-NH2。比較於 圖4-1(a)和圖 4-1(b)，我們發現培養基含有 10 % FBS 的情況下，140 nm
rFND-COOH 不和細胞作用，在圖 4-1(a)中我們並無觀察到細胞內有 rFND 的螢光 影像。我們推測rFND-COOH 和細胞膜表面皆為負電，產生電荷斥力，降低 rFND-COOH 和細胞間的作用力，所以不易進入細胞。圖 4-1(b)是不含 FBS 培養 基的結果，細胞在飢餓的情況下，140 nm rFND-COOH 和細胞的非專一性作用力 增加，因而進入細胞，所以圖4-1(b)中觀察到細胞內有 rFND 的螢光影像。文獻 雖曾報導，rFND-COOH 在含有 FBS 的培養基下，仍會進入細胞，但相較於不含
FBS 的培養基，rFND-COOH 進入細胞的效率低 [15, 32, 37, 81]。考慮含 FBS 和
我們已證實此現象。Li 等人利用競爭抑制檢驗(competitive inhibition assay)，亦證 實rFND-Tf 進入細胞是藉由受體媒介胞吞作用 [82]。他們在培養基中加入蔗糖 (sucrose)中斷受體媒介胞吞作用，發現進入細胞內的 rFND-Tf 大為減少 80 %。圖 4-1(d)螢光影像顯示，140 nm rFND-NH2會和細胞作用。我們也進一步利用共焦螢 光顯微鏡，進行縱向截面掃描，確認rFND-NH2也會進入細胞質中。由表4-1 的
察到胞吞作用效率因粒子尺寸縮小而提高。根據表面電位的結果，40 nm rFND-COOH 表面電位是-38.3 ± 1.5 mV，雖然較 140 nm rFND-COOH 表面電位 -48.3 ± 1.3 mV 小，仍會和細胞膜表面有電荷斥力，降低和細胞間的作用力，因此，
減小rFND-COOH 的尺寸，我們並無觀察到胞吞作用效率的提高。圖 4-2(b)是 40 nm rFND-COOH 在無 FBS 培養基和細胞作用的結果，和 140 nm rFND 的結果相 同，40 nm rFND-COOH 進入細胞是因為細胞飢餓，增加無選擇性的胞吞作用。
圖4-2(c)和圖 4-2(d)的結果顯示，40 nm rFND-Tf 和 rFND-NH2進入細胞，分別透 rFND-Tf、rFND-NH2和rFND-COOH 在不含 FBS 情況下，對胞吞作用效率的差 異。我們進行兩種實驗，分別是測量反應濃度(concentration dependent)和反應時 間(reaction time)對胞吞作用的效應。細胞培養在含 10 % 胎牛血清的培養基中，
細胞種在12 孔盤中，每個孔皆約有 5 × 105細胞。在反應濃度分析方面，不同表 面官能基的rFND 分別和細胞反應的時間固定是 6 小時，反應濃度分別是 1、2、
5、10 和 20 μg/mL。反應時間分析方面，rFND 的反應濃度是 10 μg/mL，反應時
rFND-COOH(不含 FBS)的比例約是 1：0.6：0.2，顯示 rFND-Tf 的胞吞作用效率 最高。圖4-4 是 140 nm rFND 螢光強度隨濃度改變的分析圖，紅色和綠色分別代
用(macropinocytosis) [87, 88]。巨胞飲作用屬於胞吞作用的一種，是非專一性進入
約是rFND-NH2的2 倍，胞吞作用的途徑分別是受體媒介胞吞作用和巨胞飲作 rFND-COOH 的表面電位，140 nm rFND-Tf 表面的運鐵蛋白電性是正電。先前有 提到運鐵蛋白在水溶液中自然狀態是負電性，我們140 nm rFND-Tf 表面的運鐵蛋
− 100 μg/mL，rFND-Tf 和 rFND-NH2的反應濃度範圍是0 − 10 μg/mL。細胞影像 和細胞計數是各別的兩組細胞樣品，在反應第48 小時後，分別擷取細胞影像和 計算細胞數目。MTT 檢驗的部份，96 孔盤的每個孔皆種約 5 × 103細胞，分別和 10 μg/mL 的 rFND-COOH、rFND-Tf 和 rFND-NH2反應，在反應第0、24、48 和 72 小時，分別跟 MTT 試劑反應 4 小時後，測量 540 nm 的吸收度；細胞的數目
和rFND-NH2在反應濃度1 μg/mL 的情況下，相較於控制實驗，細胞形態並無改 [89]。200 nm 二氧化矽奈米管(silica nanotube，簡稱 SNT)在反應濃度 5 μg/mL 的 情況下，和細胞反應72 小時後並大量進入細胞，利用 MTT 檢驗亦觀察到抑制細 胞生長的現象，細胞活性減少63 %。此外，Faklaris 等人顯示 ND-COOH 在很高 的反應濃度480 μg/mL，觀察到細胞活性降低 20 % [37]。雖然 ND-COOH 的胞吞 作用效率很低，但是在高的反應濃度下，亦會有抑制細胞生長的效應。儘管奈米
鑽石大量進入細胞後，會產生細胞生長抑制的現象，但是製作成標靶探針，專一 結果，照射光的波段是510−560 nm。圖 4-11(a)的控制實驗組結果顯示，細胞形 態不因連續照射1 小時而改變，表示在此照射波段 510 − 560 nm 和功率密度 7 W/cm2的情況下，照射光不會造成細胞的傷害。我們進一步連續照射3 小時，亦 無觀察到細胞形態的改變。比較圖4-11(a)和圖 4-11(b)的結果，被 140 nm rFND-Tf 標定的細胞經由照射1 小時後，細胞形態明顯萎縮，顯示細胞因 rFND 而被毒殺。
我們也進行照射光波段590 − 650 nm 的光毒性測試，我們發現細胞無論是否和 140 nm rFND-Tf 反應，連續照射細胞 3 小時後，細胞的形態都不改變，表示 rFND 在波段590 − 650 nm 的照射下，不會產生光毒性。由圖 4-11 的結果歸納，rFND
吸收波段510 − 560 nm 會產生光毒性，而此波段的吸收源自於鑽石晶格中的孤立 氮原子，在吸收不轉換成光能的情況下，而是轉換成熱能將癌細胞殺死。波段 590−650 nm 的吸收源自於 rFND 內的「氮-空缺」中心，其螢光的量子產率(quantum yield)接近 1 [91]，推測將吸收轉換成螢光，所以對細胞不造成傷害。
連續照射 1 小時對治療的應用性不佳，我們將提高照射光源的功率密度，以 縮短照射的時間。我們選用532 nm 雷射作為光源，功率密度範圍是 25 − 75 W/cm2，照射時間設定是10 分鐘。我們除了觀察細胞形態的變化來判別細胞是否 死亡，也利用染劑輔助判別細胞的存活。細胞在照射結束後，隨即加入染劑Calcein AM 和 EthD-1，分別是代表活細胞和死細胞的染劑。Calcein AM 會進入細胞質，
和活細胞質內的酵素作用後發出綠色螢光。死細胞的細胞膜會破損，EthD-1 會穿
作用6 小時後，在不同功率密度照射下的結果。rFND-Tf 的反應濃度是μg/mL， NIR)，例如柱狀金奈米粒子(gold nanorod)、核殼金奈米粒子(core-shell gold nanoparticle)和籠狀金奈米粒子(gold nanocage) [48, 92, 93]，在相同的功率密度下 可有效殺死被標靶的癌細胞，因為近紅外光對細胞的穿透性較佳，所以可提供更
石的溫度是否因照射而上升。拉曼實驗的激發光源是532 nm 雷射，奈米鑽石的
stretching vibration)波數，其數值為 1332 cm-1，k 是波茲曼常數，T 是絕對溫度。
由公式可看出，當溫度升高，Ianti-stoke/Istokes的比值會變大。所以在不同激發功率下，
將測得拉曼光譜的Istokes強度歸一化後，預期會觀察到Ianti-stokes的強度隨激發功率 變大而增加。圖4-14 分別是不同激發功率的(a)拉曼光譜和(b)溫度推算。圖 4-14(a) 中的影像是測量時的奈米鑽石，粒子的大小約5 μm，和 rFND 聚集在細胞內的大 小相似。由圖4-14(a)的拉曼光譜可發現，將 Istokes的強度歸一化後，Ianti-stokes的強 度確實隨激發功率增加而變大，顯示奈米鑽石的溫度隨之上升，亦證實奈米鑽石 能將吸收轉換成熱能。圖4-14(b)是奈米鑽石的溫度推算結果，顯示奈米鑽石的溫 度隨雷射的激發功率增加而線性成長。經由線性適解可得到兩種實驗狀態的起始 溫度，溫度的線性適解的公式如下：
y = A + Bx (4-3)
細胞的數目減少50 %。此外，我們首次發現奈米鑽石的光熱效應，可吸收小於 550 nm 的光轉換成熱能，將被標靶的癌細胞有效殺死。我們利用拉曼光譜觀察奈 米鑽石的光熱效應，直接證實奈米鑽石因光的照射而溫度上升。總歸以上奈米鑽 石的特性，專一性進入細胞後，不僅可抑制癌細胞的生長，還可藉由光熱效應選 擇性的將癌細胞有效殺死，在標靶治療方面，提供新的平台。
圖4-1 細胞螢光影像，(a) 140 nm rFND-COOH，(b) 140 nm rFND-COOH，不含 胎牛血清，(c) 140 nm rFND-Tf，(d) 140 nm rFND-NH2。反應濃度皆為10 μg/mL，
反應時間6 小時。第一、二欄分別是 rFND 和細胞核染劑的螢光影像，第三欄是 螢光影像和微分干涉對比影像的重疊圖。
(a)
(b)
(c)
(d)
圖4-2 細胞螢光影像，(a) 40 nm rFND-COOH，(b) 40 nm rFND-COOH，不含胎 牛血清，(c) 40 nm rFND-Tf，(d) 40 nm rFND-NH2。反應濃度皆為10 μg/mL，反 應時間6 小時。第一、二欄分別是 rFND 和細胞核染劑的螢光影像，第三欄是螢 光影像和微分干涉對比影像的重疊圖。
(a)
(b)
(c)
(d)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
FND-COOH (without FBS) FND-NH2
FND-Tf
140 nm 40 nm X37
Normalized intensity
圖4-3 不同表面官能基 rFND 的流式細胞儀分析結果，紅色和綠色分別是 140 nm 和40 nm rFND，反應濃度是 10 μg/mL，反應時間 6 小時，40 nm rFND 的螢光強 度乘以37 倍之後加以比較，每組實驗都是統計 5 × 103個細胞的結果。
1 2 5 10 20 0
2500 5000 7500 10000 12500 15000
140 nm rFND-Tf 140 nm rFND-NH2
Mean fluorescence intensity / a.u.
rFND concentration / μg mL-1
圖4-4 紅光奈米鑽石反應濃度的流式細胞儀分析結果，紅色和綠色分別是 140 nm rFND-Tf 和 rFND-NH2，反應時間6 小時，反應濃度是 1、2、5、10 和 20 μg/mL，
每組實驗結果皆是統計5 × 103個細胞的結果。
1 2 5 10 20 0.0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
1.4 140 nm rFND-Tf image 140 nm rFND-NH2 image
140 nm rFND-Tf flow cytometry 140 nm rFND-NH2 flow cytometry
Normalized intensity
rFND cincentraion / μg mL-1
圖4-5 細胞螢光影像和流式細胞儀對 rFND 反應濃度分析的比較圖，黑色和紅色 曲線分別代表螢光影像分析140 nm rFND-Tf 和 rFND-NH2的結果，綠色和藍色分 別代表流式細胞儀分析140 nm rFND-Tf 和 rFND-NH2的結果。
0 1 2 3 4 5 6
(a)
half-life=0.8 h 140 nm rFND-Tf
Mean fluorescence intensity / a.u.
Incubation time (h)
0 1 2 3 4 5 6
(b)
half-life=1.4 h 140 nm rFND-NH2
Mean fluorescence intensity / a.u.
Incubation time (h)
圖4-6 紅光奈米鑽石反應時間的流式細胞儀分析結果，(a) 140 nm rFND-Tf，(b) 140 nm rFND-NH2，反應濃度皆是10 μg/mL，反應時間是 0.5、1、1.5、2、3、4 和5 小時，每組實驗是統計 5 × 103個細胞的結果。
(a) rFND-COOH 0 μg/mL 10 μg/mL 100 μg/mL
(b) rFND-Tf 0 μg/mL 1 μg/mL 10 μg/mL
(c) rFND-NH2 0 μg/mL 1 μg/mL 10 μg/mL
圖4-7 不同表面官能基的 140 nm rFND 對細胞毒性的細胞影像，分別是(a) 140 nm rFND-COOH，反應濃度是 0、10 和 100 μg/ mL，(b)和(c)分別是 140 nm rFND-Tf 和rFND-NH2，反應濃度皆為0、1 和 10 μg/mL。rFND 和細胞作用 48 小時。
100 μm
(a) rFND-Tf 0 μg/mL 1 μg/mL 10 μg/mL
(b) rFND-NH2 0 μg/mL 1 μg/mL 10 μg/mL
圖4-8 不同表面官能基的 40 nm rFND 對細胞毒性的細胞影像，(a)和(b)分別是 40 nm rFND-Tf 和 rFND-NH2，反應濃度皆是0、1、10 μg /mL。rFND 和細胞作用 48 小時。
100 μm
0h 24h 48h 72h 0
2 4 6 8 10
12 Control
140 nm ND-COOH 140 ND-Tf
140 ND-NH2 40 ND-Tf 40 ND-NH2
Cell viability / 100%
Incubation time / h
圖4-9 不同表面官能基 rFND 對細胞活性的 MTT 檢驗結果，紅色是控制實驗，
綠色、藍色和青綠色分別是140 nm 的 ND-COOH、ND-Tf 和 ND-NH2和細胞作用 的結果，粉紅色和黃色分別是40 nm 的 ND-Tf 和 ND-NH2和細胞作用的結果，奈 米鑽石的反應濃度皆是10 μg/mL，分別在第 0、24、48 和 72 小時進行 MTT 檢驗。
0h 24h 48h 0
5 10 15 20 25 30
35 Control
140 nm ND-Tf 140 nm ND-NH2 40 nm ND-Tf 40 nm ND-NH2
Cell numbers / 10
4Incubation time / h
圖4-10 不同表面官能基 rFND 和細胞作用的細胞計數結果，紅色是控制實驗，綠 色和藍色分別是140 nm 的 ND-Tf 和 ND-NH2和細胞作用的結果，青綠色和粉紅
圖4-10 不同表面官能基 rFND 和細胞作用的細胞計數結果，紅色是控制實驗，綠 色和藍色分別是140 nm 的 ND-Tf 和 ND-NH2和細胞作用的結果，青綠色和粉紅