間可產生較多的「氮-空缺」中心；(2)大氣下 600 ℃退火 2 小時，因氧化作用清
液洗去未反應的rFND-Tf，並用 4 %的三聚甲醛將細胞固定。我們利用共焦雷射
圖3-5 分別是(a) rFND-COOH，(b) rFND-Tf 和(c)細胞質中 rFND-Tf 的螢光光譜。
每個螢光光譜中有黑、紅、綠三條曲線，代表測量三顆不同的rFND，其螢光強 度上的差異，源自於待測rFND 的顆粒大小不同。依樣品的製備方式，所測量的 顆粒應為rFND 聚集的形態。比較圖 3-5(a)和圖 3-5(b)，rFND 的螢光光譜並無明 顯差異，仍可清楚看到兩根零聲子線，位置分別在576 nmc 和 638 nm，表示運鐵 蛋白固定在rFND-COOH 表面後，光譜特性並不受影響。圖 3-5(c)是 rFND-Tf 在
細胞質中的螢光光譜，我們發現零聲子線較不明顯，推測在複雜的細胞質環境 別是(a) rFND-COOH，(b) rFND-Tf 和(c)細胞質中 rFND-Tf 的螢光強度隨時間衰減 曲線和適解結果，螢光生命期分別是(a) 11.8 ± 0.1 ns，(b) 11.6 ± 0.1 ns 和(c) 12.1 ±
驗，以確認140 nm rFND-Tf 辨認細胞的途徑，是專一性透過細胞膜表面的運鐵蛋 驗結果顯示，並無觀察到rFND-COOH 的螢光影像，表示 rFND-COOH 和細胞之 間的非專一性作用力很小。推測rFND-COOH 表面的羧基是負電，和細胞膜表面 影像掃描(single color vertical cross-section confocal fluorescent image)，觀察整個細 胞的厚度範圍中，是否有140 nm rFND-Tf 螢光訊號的分佈。一般細胞的厚度約是
(Hoechst 33342)經由 405 nm 雷射激發，會放出藍色螢光範圍在 420 − 500 nm，所 以我們進行雙色縱向截面共焦螢光影像掃描，結果如圖3-9 所示。有三個方向的 投影，分別是xy、xz 和 yz，z 軸的深度是 20 μm，紅色和藍色分別代表 rFND-Tf 和細胞核染劑的螢光。在xz 和 yz 的投影中，顯示整個細胞核厚度的範圍內，有 rFND-Tf 的螢光影像，表示 rFND-Tf 已進入細胞質。從三個不同方向的投影中，
rFND-Tf 看起來似乎進入細胞核內，但是經由不同縱向截面的分析，發現 rFND-Tf rFND 螢光特性的研究方面，對於兩種表面官能基(1) rFND-COOH，(2) rFND-Tf 和外在環境(3)細胞質中 rFND-Tf 的探討，我們發現 rFND 的螢光光譜和螢光生命 期皆無明顯差異，推測「氮-空缺」中心在鑽石晶格內，rFND 的螢光受表面官能 基或外在環境影響很小。
在專一性標靶細胞螢光影像方面，rFND-COOH 的非專一性作用力很小，推 測rFND-COOH 和細胞膜間的電荷斥力，降低和細胞間的作用力，不易辨認細胞。
rFND-Tf 可有效的標靶癌細胞，並由阻塞細胞膜表面的運鐵蛋白受體，使 rFND-Tf 受阻而無法辨認細胞，證實rFND-Tf 是經由 Tf-TfR 作用力，變成專一性的探針。
我們利用縱向截面共焦雷射掃描螢光影像，進一步確認rFND-Tf 已進入細胞質，
此途徑是已知的受體媒介胞吞作用。本研究已成功將rFND 製作成專一性探針，
增加標靶細胞螢光影像的應用性。
550 600 650 700 750 800
550 600 650 700 750 800
0
550 600 650 700 750 800
Inteisity / a.u.
Wavelength / nm
圖3-2 40 nm 紅光奈米鑽石螢光光譜圖，退火條件是真空 800 ℃退火 4 小時，以 及大氣下600 ℃退火 2 小時。
550 600 650 700 750 800 rFND
HeLa cell
Intensity / a.u.
Wavelength / nm
圖3-3 140 nm 紅光奈米鑽石和海拉細胞的螢光光圖譜，激發光源是 514.5 nm 氬 離子雷射，紅色曲線代表紅光奈米鑽石，綠色曲線代表海拉細胞自體螢光，紫色 區域是擷取細胞螢光影像時，螢光訊號的收集範圍。
圖3-4 海拉細胞的明視野和共焦螢光影像，(a)明視野影像，(b)和(c)是共焦雷射 掃描螢光影像，螢光收集範圍：(b)大於 550 nm，(c) 663 − 738 nm。細胞和 140 nm rFND-Tf 作用 1 小時，反應濃度是 10 μg/mL，激發光源是 514.5 nm 氬離子雷射。
(a)
(b)
(c)
550 600 650 700 750 800
Intensity / a.u.
(a)
638 nm
576 nm
550 600 650 700 750 800
Intensity / a.u.
(b)
638 nm
576 nm
550 600 650 700 750 800
Intensity / a.u.
(c)
Wavelength / nm
圖3-5 140 nm 紅光奈米鑽石螢光光圖譜，(a) rFND-COOH，(b) rFND-Tf，(c)細胞 質中的rFND-Tf。
lifetime = 11.8 ns
lifetime = 11.6 ns
(b)
lifetime = 12.1 ns
(c)
圖3-6 140 nm 紅光奈米鑽石螢光生命期，(a) rFND-COOH，(b) rFND-Tf，(c)細胞 質中的rFND-Tf。
圖3-7 專一性標靶細胞影像圖，(a)細胞的明視野影像，(b)紅光奈米鑽石的共焦螢 光影像，(c)明視野和共焦螢光影像的重疊圖。左欄是細胞和 140 nm rFND-COOH (10 μg/mL)反應 1 小時，中間欄是細胞和 140 nm rFND-Tf (10 μg/mL)反應 1 小時，
右欄是細胞先和運鐵蛋白(10 mg/mL)作用 1 小時，再和 140 nm rFND-Tf (10 μg/mL) 反應1 小時。
(a)
(b)
(c)
圖3-8 單色縱向截面共焦螢光影像，每個截面間隔距離是 200 nm。海拉細胞和 140 nm rFND-Tf (10 μg/mL)反應 1 小時。
圖3-9 雙色縱向截面共焦螢光影像，藍色螢光代表是細胞核，激發光源是 405 nm 雷射，螢光收集範圍420 − 500 nm。紅色螢光代表 140 nm rFND-Tf，激發光源是 514.5 nm 雷射，螢光收集範圍 650 − 750 nm。xz 和 yz 的 z 軸深度是 20 μm。
圖3-10 不同截面的雙色縱向截面共焦螢光影像，藍色螢光代表細胞核，激發光 源是405 nm 雷射，螢光收集範圍是 420 − 500 nm，紅色螢光代表 140 nm
rFND-Tf，激發光源是 514.5 nm 雷射，螢光收集範圍是 650 − 750 nm。