1-1 螢光奈米鑽石(Fluorescent nanodiamonds，簡稱 FND)
奈米技術已廣泛被應用在生物醫學的範疇，例如細胞螢光影像、藥物輸送和 診斷治療 [1 – 6]。舉例來說，在生物醫學實驗中，常用染料(dye) [7]、螢光蛋白 質(fluorescent protein) [8] 或量子點(quantum dots) [5] 作為螢光標記，跟生物分子 或蛋白質結合後，製作成專一性的探針，以進行標靶螢光影像。但是這些應用仍 I鑽石又細分為兩大類，分別是型式Ia (type Ia)和型式Ib (type Ib)，型式Ia鑽石的氮
含量較高，濃度範圍大約是100 − 1000 ppm，氮原子在晶格中的排列，主要呈現 兩兩相鄰，98 %的天然鑽石是型式Ia。型式Ib鑽石的氮含量較低，濃度範圍大約 是50 − 300 ppm，氮原子在鑽石晶格中的排列，主要是以孤立(isolated)的形式存 在。型式Ib鑽石在自然界中的含量很少(< 1 %)。合成方式製造的鑽石幾乎是型式 列，就可創造出缺陷中心。型式Ia的天然奈米鑽石，所形成的缺陷是「氮-空缺-氮」中心(N-V-N center)，可發出波長範圍500 − 600 nm的綠色螢光 [19]，稱作綠 光奈米鑽石(green fluorescent nanodiamonds，簡稱gFND)。圖1-1是「氮-空缺-氮」
中心的螢光光譜，激發光源是488 nm氬離子雷射，螢光譜線峰值約是520 nm。文 獻記載其光吸收波長範圍是400 − 520 nm，吸收峰約470 nm [19]。合成鑽石是型 式Ib，所形成的缺陷是「氮-空缺」中心 (N-V center)，可發出波長範圍是550-800 nm 的紅色螢光 [15]，稱作紅光奈米鑽石(red fluorescent nanodiamonds，簡稱 rFND)。圖1-2是「氮-空缺」中心的螢光光譜，激發光源是514.5 nm氬離子雷射，
螢光譜線峰值約是660 nm。文獻記載其光吸收波長範圍是400-650 nm，吸收峰約 560 nm [20]。圖1-2光譜中有兩條零聲子線(zero phonon line，簡稱ZPL)，位置在 576 nm和638 nm，是(N-V)0和(N-V)-發光中心分別對應的電子躍遷1E→1A1和3A2
就可避開細胞自體螢光，增加影像的訊雜比。相對地，綠光奈米鑽石的螢光範圍 跟細胞自體螢光重疊，無法利用光學方式分離，所以細胞自體螢光的干擾較為顯 著。因此，在生物醫學上的應用，是以紅光奈米鑽石較為常見。張煥正老師實驗 室進一步測量「氮-空缺」和「氮-空缺-氮」中心的吸收截面(absorption cross section)，分別在532 nm和488 nm激發波長下，其吸收截面分別是(1.7 ± 0.5) × 10-17 和(3.1 ± 0.8) × 10-17 [19, 20]，所以rFND的發光強度約是gFND的2倍。
利用 MTT檢驗(MTT assay)比較奈米鑽石和其他奈米材料的細胞毒性 [16, 17]， (lung epithelial cells)膜表面的受體 [31]，再利用奈米鑽石的史托克拉曼(Stokes Raman)訊號位置在1332 cm-1，對應是鑽石晶格中碳-碳鍵的伸縮振動(C-C
的探針，探討和細胞膜表面受體的作用力。除此之外，我們也研究不同大小和表
奈米粒子是透過胞吞作用進入細胞，而奈米粒子的表面性質，會影響胞吞作 (dynamic light scattering，簡稱 DLS)和界面電位分析儀(zeta potential)，鑑定 rFND 的表面特性，確認是否成功製作出三種表面官能基的rFND。螢光影像和流式細 胞儀(flow cytometry)，分析 rFND 對胞吞作用的效率。細胞毒性的試驗是利用細 胞影像、MTT 檢驗和細胞計數，作為判別細胞活性的依據。
螢光共振能量轉移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，簡稱 FRET)常應 用在生物系統，觀察蛋白質間的作用力 [58–61]。FRET 過程需要兩個螢光物質，
在定義上一個稱作供體(donor)，另一個稱作受體(acceptor)，供體所發螢光波長範 圍剛好和受體吸收範圍有相當重合，當此兩螢光物質因作用力結合，才會有能量 轉移的機會，此時供體的螢光生命期會縮短。生物系統FRET 的應用中，常用的 螢光物質是螢光蛋白質(fluorescent protein)，但是螢光蛋白質的螢光穩定性不佳，
在應用上有所限制。綠光奈米鑽石的發光範圍，恰好和紅光奈米鑽石的吸收範圍 有良好的重疊，可組成適合的FRET 配對。目前螢光奈米鑽石間 FRET 的效應尚 未被報導，所以我們好奇螢光奈米鑽石間是否會有FRET 的可能性，如此一來，
因為螢光奈米鑽石的螢光穩定性高，可改善螢光蛋白質在應用上的缺點。因此，
我們將進行簡單的實驗，測試螢光奈米鑽石間是否有FRET 的現象。圖 1-8 是螢 光奈米鑽石間FRET 的實驗設計示意圖，我們分別將抗體和抗原固定在綠光和紅 光奈米鑽石表面，利用抗原-抗體作用力將兩種螢光奈米鑽石結合，觀察綠光奈米 鑽石的螢光生命期變化，即可得知螢光奈米鑽石間是否有FRET 的現象。
500 550 600 650 700 750 800
Intensity / a.u.
Wavelength / nm
圖1-1 綠光奈米鑽石螢光光譜圖，激發光源是 488 nm 氬離子雷射。
550 600 650 700 750 800
(N-V)
-(N-V)0
638 nm
576 nm
Intenaity / arb. units
Wavelength / nm
圖1-2 紅光奈米鑽石螢光光譜圖，激發光源是 514.5 nm 氬離子雷射。
圖1-3 「氮-空缺」中心模型圖。
圖1-4 細胞活性測試的 MTT 檢驗結果，藍、黑、紅、紫和黃色分別代表奈米鑽 石、碳黑、多壁奈米碳管(Multi-Walled Carbon Nanotubes，簡稱 MWNT)、單壁奈 米碳管(Single-Walled Carbon Nanotubes，簡稱 SWNT) 和氧化鎘，添加物和細胞 的反應時間是 24 小時。
圖1-5 運鐵蛋白進入細胞的示意圖。
圖1-6 專一性標靶探針製作的示意圖。
圖1-7 專一性標靶實驗示意圖。
圖1-8 螢光奈米鑽石間 FRET 實驗設計示意圖。