螢光奈米鑽石的特性和生物應用：專一性、光毒性和能量轉移研究

國

立

交

通

大

學

應用化學系碩士班

碩

士

論

文

螢光奈米鑽石的特性和生物應用：

專一性、光毒性和能量轉移研究

Characterizations and biological applications of fluorescence

nanodiamonds: specifically targeting, phototoxicity,

and energy transfer

研究生：翁茂峯

指導教授：王念夏 博士

江素玉 博士

螢光奈米鑽石的特性和生物應用：

專一性、光毒性和能量轉移研究

Characterizations and biological applications of fluorescence

nanodiamonds: specifically targeting, phototoxicity,

and energy transfer

研 究 生：翁茂峯 Student：Mao-Feng Weng 指導教授：王念夏 Advisor：Niann-Shiah Wang 江素玉 Su-Yu Chiang 國 立 交 通 大 學 應 用 化 學 系 碩 士 班 碩 士 論 文 A Thesis

Submitted to M. S. Program, Department of Applied Chemistry College of Science

National Chiao Tung University in partial Fulfillment of the Requirements

for the Degree of Master of Science

in

Applied Chemistry

June 2011

Hsinchu, Taiwan, Republic of China

螢光奈米鑽石的特性和生物應用：專一性、光毒性和能量轉移研究 學生：翁茂峯 指導教授：王念夏 博士 江素玉 博士 國立交通大學應用化學系碩士班 摘 要 近來奈米鑽石在生物醫學上的應用極具潛力，因為螢光奈米鑽石具有良好的 光學特性和生物相容性。本研究主要分為三部份：(1)將 140 nm 紅光奈米鑽石製 作成專一性的探針，利用螢光影像研究運鐵蛋白和海拉細胞膜表面受體的作用 力；(2)探討不同表面官能基 40 nm 和 140 nm 奈米鑽石對胞吞作用的影響，以及 觀察奈米鑽石大量進入細胞後的毒性，並利用光熱效應選擇性殺死癌細胞；(3) 首次探討綠光和紅光奈米鑽石間是否有螢光共振能量轉移，以拓展生物醫學上的 應用。實驗結果顯示，透過運鐵蛋白和受體的作用力，螢光奈米鑽石成功變成專 一性的探針並進入細胞，其螢光光譜和螢光生命期特性亦不受外在環境影響。利 用流式細胞儀的分析，發現螢光奈米鑽石-運鐵蛋白複合物的胞吞作用效率，約是 胺化奈米鑽石的2 倍。奈米鑽石有效率的進入細胞後，我們觀察到細胞的生長速 度變慢。此外，在532 nm 的雷射照射下，專一性進入細胞的奈米鑽石可產生光 熱效應，選擇性將被標靶的癌細胞殺死，使用的照射能量是低於殺死未被標靶細 胞所需能量的二分之一。綠光奈米鑽石的螢光範圍，和紅光奈米鑽石的吸收範圍 有良好的重疊，可形成很好的螢光共振能量轉移配對。我們分別將抗體和抗原固 定在綠光和紅光奈米鑽石表面，利用抗原-抗體作用力相結合，其螢光共振能量轉 移的效率約是18 %。本研究結果顯示螢光奈米鑽石在生醫應用的可能性，有潛力 變成專一性探針和扮演成光熱治療試劑去殺死癌細胞。

Characterizations and biological applications of fluorescence nanodiamonds: the studies of targeted imaging, phototoxicity, and energy transfer

Student：Mao-Feng Weng Advisor：Dr. Niann-Shiah Wang Dr. Su-Yu Chiang

M. S. Program, Department of Applied Chemistry National Chiao Tung University

ABSTRACT

Recently, fluorescent nanodiamonds (FNDs) have attracted considerable attention

as optical probes in biological and medicinal applications because of their special optical properties and great biocompatibility. In this study, we investigated FNDs as specifically targeted probes to image the interactions of transferrins (Tf) with

transferrin receptors (TfR) on HeLa cells, the mechanisms involved in the cellular uptake of surface-modified FNDs, the effects of particle size on the specificity of cellular uptake, and evaluated their cytotoxicity and phototoxicity following particle internalization, and the efficiency of fluorescence resonance energy transfer (FERT) between green and red fluorescent nanodiamonds (gFND and rFND). With Tf immobilized on the surface of rFNDs, we demonstrated that rFND-Tf bioconjugates successfully targeted HeLa cells through Tf-TfR interactions and the surface effects of chemical interactions on the emission of rFND are negligible. Through an analysis of the efficiency of internalized rFND-Tf and rFND-NH2 by flow cytometry, the

endocytosis of rFND-Tf particles was highly effective and nearly twice as efficient as that of rFND-NH2 particles. The cytotoxicity of internalized particles resulted in

decreasing the rate of proliferation of rFND-treated cells. An examination of the

photothermal effect of internalized rFND-Tf particles under irradiation using a 532 nm laser revealed that the rFND-treated cells could be killed selectively using less than half the energy required for untreated cells. gFND and rFND could be a proper FRET pair because the emission of gFND overlaps well with the absorption of rFND. With antibody and antigen immobilized on the surface of gFND and rFND, we observed that the efficiency of FRET was 18 % after the combination of gFND and rFND through antigen-antibody interactions. Our results demonstrated that bioconjugated FNDs could be highly effective in the targeting of cancer cells for fluorescence imaging and photokilling with a minimum of collateral cell damage.

誌謝

感謝多年來指導教授與實驗室夥伴們的包容和陪伴，得以在國家同步輻射研 究中心完成此論文。在我一踏進實驗室，特別感謝宜鋒學長的指教，以及感謝博 睿學長和俐君給予論文撰寫的寶貴意見。還有要感謝的人太多，在此獻上我最深 的謝意。 最後要感謝我的親愛的家人：我的父母以及由女朋友變成我太太的秝玟，在 我最艱難的時刻，給予我最大的支持和包容。在七年的博士研究中，雖然已達到 畢業的所有條件，但是卻無法獲得博士學位，感謝你們大大的體諒我和安慰我， 並告訴我人的一生中，若沒有健康和快樂，一切都是枉然。你們安定了我的心， 最後我作出長久以來讓我痛苦的決定：降轉碩士班。再次感謝你們在生活以及精 神上給我的支持，讓我可以順利完成學業，願將此份榮耀與你們共享。

目 錄

頁次 頁次 第一章 緒論……… 1 1-1 螢光奈米鑽石……… 1 1-2 研究動機和方法……… 5 第二章 實驗技術和步驟……… 13 2-1 實驗原理……… 13 2-1-1 范氏加速器……… 13 2-1-2 共焦雷射掃描螢光顯微術……… 13 2-1-3 螢光生命期影像顯微術……… 14 2-1-4 螢光共振能量轉移……… 15 2-1-5 流式細胞儀……… 16 2-1-6 動態光散射儀……… 17 2-1-7 界面電位……… 18 2-1-8 細胞活性測試-MTT 檢驗 ……… 18 中文摘要 ……… i 英文摘要 ……… ii 誌謝 ……… iv 目錄 ……… v 圖目錄 ……… viii 表目錄 ……… xiv

2-2 實驗系統……… 19 2-2-1 共焦雷射掃描螢光顯微鏡……… 19 2-2-2 螢光生命期顯微鏡……… 19 2-2-3 拉曼和螢光光譜儀……… 20 2-3 實驗步驟……… 20 2-3-1 螢光奈米鑽石的製備和表面修飾……… 20 2-3-2 細胞培養和專一性標靶……… 22 2-3-3 細胞螢光影像……… 23 2-3-4 流式細胞儀的樣品處理……… 23 2-3-5 螢光奈米鑽石的細胞毒性……… 24 2-3-6 螢光奈米鑽石的光毒性……… 24 2-3-7 螢光共振能量轉移……… 25 第三章 紅光奈米鑽石的螢光特性和專一性標靶影像應用………… 37 3-1 奈米鑽石螢光特性……… 37 3-2 專一性標靶鑑定……… 40 3-3 結論……… 42 第四章 紅光奈米鑽石的胞吞作用和毒性研究……… 54 4-1 表面性質鑑定……… 54 4-2 胞吞作用細胞螢光影像……… 55 4-3 胞吞作用效率分析……… 57 4-4 奈米鑽石細胞毒性……… 60 4-5 奈米鑽石光毒性……… 63 4-6 拉曼光譜……… 65

4-7 結論……… 67 第五章 奈米鑽石的螢光共振能量轉移……… 84 5-1 綠光奈米鑽石……… 84 5-2 螢光共振能量轉移……… 84 5-3 結論……… 87 參考文獻 ……… 92

圖 目 錄

頁次 圖1-1 綠光奈米鑽石螢光光譜圖，激發光源是488 nm 氬離子雷射。… 8 圖1-2 紅光奈米鑽石螢光光譜圖，激發光源是514.5 nm 氬離子雷射。 8 圖1-3 「氮-空缺」中心模型圖。……… 9 圖1-4 細胞活性測試的MTT 檢驗結果，藍、黑、紅、紫和黃色分別 代表奈米鑽石、碳黑、多壁奈米碳管(Multi-Walled Carbon Nanotubes，簡稱 MWNT)、單壁奈米碳管(Single-Walled Carbon Nanotubes，簡稱 SWNT) 和氧化鎘，添加物和細胞的反應時間 是 24 小時。……… 10 圖1-5 運鐵蛋白進入細胞的示意圖。……… 11 圖1-6 專一性標靶探針製作的示意圖。……… 11 圖1-7 專一性標靶實驗示意圖。……… 12 圖1-8 螢光奈米鑽石間FRET 實驗設計示意圖。……… 12 圖2-1 加速器設計圖，奈米鑽石放置在輸出端接受撞擊。……… 27 圖2-2 加速器的現場照片，(a)離子源和射束輸出方向，(b)靶端，紅色 框是奈米鑽石試片放置靶。……… 28 圖2-3 共焦的基本架構，(A)光源針孔，(B)偵測針孔，(C)集光透鏡， (S)待測樣品，(O)物鏡，(P)光電管。……… 29 圖2-4 一般共焦雷射掃描顯微鏡的架構，藍色曲線是激發雷射路徑， 橘色曲線是螢光路徑。……… 29 圖2-5 時間相關單光子計數系統之概念圖。……… 30 圖2-6 螢光共振能量轉移概念圖。……… 30 圖2-7 螢光共振能量轉移效率計算方法。(a)測量作用力結合前後，供

體的螢光生命期變化，(b)經由作用力結合，測量受體光褪色前 後，供體螢光生命期的變化。……… 31 圖2-8 流式細胞儀的流動室剖面圖，利用流體動力聚焦，使單一細胞 通過雷射激發區。……… 31 圖2-9 典型流式細胞儀的實驗結果，黑色曲線是控制實驗，即細胞不 經染色，代表細胞自身的背景值，紅色曲線是被染色細胞的螢 光強度。……… 32 圖2-10 光動態散射儀基本架設圖。……… 33 圖2-11 界面電位分析儀基本原理。……… 33 圖2-12 MTT 檢驗的還原化學反應方程式。……… 34 圖2-13 本實驗室共焦雷射掃描螢光顯微鏡的架設。……… 34 圖2-14 APC 光纖接頭示意圖。……… 35 圖2-15 Nikon C1 掃描系統設計圖，(1)平行光透鏡，(2)分色鏡(dichroic mirror)，(3) x-y 掃描鏡系統，(4)掃描透鏡，(5)集光透鏡，(6) 針孔。藍色和橘色分別代表雷射和螢光路徑。……… 35 圖2-16 本實驗室螢光生命期顯微鏡之架設。……… 36 圖2-17 本實驗室拉曼和螢光光譜儀架設圖。……… 36 圖3-1 140 nm 紅光奈米鑽石螢光光譜圖，(a)文獻條件，退火條件是 真空800 ℃退火 2 小時，(b)本實驗室最佳化條件，退火條件是 真空800 ℃退火 4 小時，以及大氣下 600 ℃退火 2 小時。…… 44 圖3-2 40 nm 紅光奈米鑽石螢光光譜圖，退火條件是真空 800 ℃退火 4 小時，以及大氣下 600 ℃退火 2 小時。……… 45 圖3-3 140 nm 紅光奈米鑽石和海拉細胞的螢光光圖譜，激發光源是 514.5 nm 氬離子雷射，紅色曲線代表紅光奈米鑽石，綠色曲線 代表海拉細胞自體螢光，紫色區域是擷取細胞螢光影像時，螢

光訊號的收集範圍。……… 46 圖3-4 海拉細胞的明視野和共焦螢光影像，(a)明視野影像，(b)和(c) 是共焦雷射掃描螢光影像，螢光收集範圍：(b)大於 550 nm，(c) 663 − 738 nm。細胞和 140 nm rFND-Tf 作用 1 小時，反應濃度 是10 μg/mL，激發光源是 514.5 nm 氬離子雷射。……… 47 圖3-5 140 nm 紅光奈米鑽石螢光光圖譜，(a) rFND-COOH，(b) rFND-Tf，(c)細胞質中的 rFND-Tf。……… 48 圖3-6 140 nm 紅光奈米鑽石螢光生命期，(a) rFND-COOH，(b) rFND-Tf，(c)細胞質中的 rFND-Tf。……… 49 圖3-7 專一性標靶細胞影像圖，(a)細胞的明視野影像，(b)紅光奈米鑽 石的共焦螢光影像，(c)明視野和共焦螢光影像的重疊圖。左欄 是細胞和140 nm rFND-COOH (10 μg/mL)反應 1 小時，中間欄 是細胞和140 nm rFND-Tf (10 μg/mL)反應 1 小時，右欄是細胞 先和運鐵蛋白(10 mg/mL)作用 1 小時，再和 140 nm rFND-Tf (10 μg/mL)反應 1 小時。……… 50 圖3-8 單色縱向截面共焦螢光影像，每個截面間隔距離是200 nm。海 拉細胞和140 nm rFND-Tf (10 μg/mL)反應 1 小時。 51 圖3-9 雙色縱向截面共焦螢光影像，藍色螢光代表是細胞核，激發光 源是405 nm 雷射，螢光收集範圍 420 − 500 nm。紅色螢光代表 140 nm rFND-Tf，激發光源是 514.5 nm 雷射，螢光收集範圍 650 − 750 nm。xz 和 yz 的 z 軸深度是 20 μm。……… 52 圖3-10 不同截面的雙色縱向截面共焦螢光影像，藍色螢光代表細胞 核，激發光源是405 nm 雷射，螢光收集範圍是 420 − 500 nm， 紅色螢光代表140 nm rFND-Tf，激發光源是 514.5 nm 雷射， 螢光收集範圍是650 − 750 nm。……… 53

圖4-1 細胞螢光影像，(a) 140 nm rFND-COOH，(b) 140 nm rFND-COOH，不含胎牛血清，(c) 140 nm rFND-Tf，(d) 140 nm rFND-NH2。反應濃度皆為10 μg/mL，反應時間 6 小時。第一、 二欄分別是rFND 和細胞核染劑的螢光影像，第三欄是螢光影 像和微分干涉對比影像的重疊圖。……… 69 圖4-2 細胞螢光影像，(a) 40 nm rFND-COOH，(b) 40 nm rFND-COOH，不含胎牛血清，(c) 40 nm rFND-Tf，(d) 40 nm rFND-NH2。反應濃度皆為10 μg/mL，反應時間 6 小時。第一、 二欄分別是rFND 和細胞核染劑的螢光影像，第三欄是螢光影 像和微分干涉對比影像的重疊圖。……… 70 圖4-3 不同表面官能基rFND 的流式細胞儀分析結果，紅色和綠色分 別是140 nm 和 40 nm rFND，反應濃度是 10 μg/mL，反應時 間6 小時，40 nm rFND 的螢光強度乘以 37 倍之後加以比較， 每組實驗都是統計5 × 103個細胞的結果。……… 71 圖4-4 紅光奈米鑽石反應濃度的流式細胞儀分析結果，紅色和綠色分 別是140 nm rFND-Tf 和 rFND-NH2，反應時間6 小時，反應濃 度是1、2、5、10 和 20 μg/mL，每組實驗結果皆是統計 5 × 103 個細胞的結果。……… 72 圖4-5 細胞螢光影像和流式細胞儀對rFND 反應濃度分析的比較圖， 黑色和紅色曲線分別代表螢光影像分析140 nm rFND-Tf 和 rFND-NH2的結果，綠色和藍色分別代表流式細胞儀分析140 nm rFND-Tf 和 rFND-NH2的結果。……… 73 圖4-6 紅光奈米鑽石反應時間的流式細胞儀分析結果，(a) 140 nm rFND-Tf，(b) 140 nm rFND-NH2，反應濃度皆是10 μg/mL，反 應時間是0.5、1、1.5、2、3、4 和 5 小時，每組實驗是統計 5 ×

103個細胞的結果。……… 74 圖4-7 不同表面官能基的140 nm rFND 對細胞毒性的細胞影像，分別 是(a) 140 nm rFND-COOH，反應濃度是 0、10 和 100 μg/ mL， (b)和(c)分別是 140 nm rFND-Tf 和 rFND-NH2，反應濃度皆為 0、1 和 10 μg/mL。rFND 和細胞作用 48 小時。……… 75 圖4-8 不同表面官能基的40 nm rFND 對細胞毒性的細胞影像，(a)和 (b)分別是 40 nm rFND-Tf 和 rFND-NH2，反應濃度皆是0、1、 10 μg /mL。rFND 和細胞作用 48 小時。……… 76 圖4-9 不同表面官能基rFND 對細胞活性的 MTT 檢驗結果，紅色是 控制實驗，綠色、藍色和青綠色分別是140 nm 的 ND-COOH、 ND-Tf 和 ND-NH2和細胞作用的結果，粉紅色和黃色分別是40 nm 的 ND-Tf 和 ND-NH2和細胞作用的結果，奈米鑽石的反應 濃度皆是10 μg/mL，分別在第 0、24、48 和 72 小時進行 MTT 檢驗。……… 77 圖4-10 不同表面官能基rFND 和細胞作用的細胞計數結果，紅色是控 制實驗，綠色和藍色分別是140 nm 的 ND-Tf 和 ND-NH2和細 胞作用的結果，青綠色和粉紅色分別是40 nm 的 ND-Tf 和 ND-NH2和細胞作用的結果，奈米鑽石的反應濃度皆是10 μg/mL，別在第 0、24 和 48 小時計算細胞的數目。……… 78 圖4-11 奈米鑽石的光毒性測試細胞影像結果，(a)控制實驗，細胞不和 140 nm rFND-Tf 作用，(b)細胞和 1 μg/mL 的 140 nm rFND-Tf 作用6 小時。照射光源是 100 W 高壓汞燈，照射光的波段是 510 − 560 nm，功率密度是 7 W/cm2_{，連續照射1 小時。……… 79} 圖4-12 照射光的毒性測試細胞影像結果，微分干涉對比和螢光影像重 疊圖。(a)和(b)皆是控制實驗組，細胞不和 140 nm rFND-Tf 作

用。照射光源是532 nm 雷射，照射時間是 10 分鐘，黃色區域 是照射範圍，雷射的功率密度分別是(a) 50 W/cm2和(b) 75 W/cm2。……… 80 圖4-13 奈米鑽石的光毒性測試細胞影像結果，微分干涉對比和螢光影 像重疊圖。細胞和10 μg/mL 的 140 nm rFND-Tf 作用 6 小時後 進行光照射。照射光源是532 nm 雷射，照射時間是 10 分鐘， 黃色區域是照射範圍，雷射的功率密度分別是(a) 25 W/cm2和 (b) 50 W/cm2。……… 81 圖4-14 奈米鑽石拉的曼光譜和溫度分析結果，激發光源是532 nm 雷 射，激發功率範圍是0.69 − 2.67 mW。(a)不同激發功率下的拉 曼光譜，將史托克拉曼(1332 cm-1)訊號的強度歸一化，觀察反 史托克拉曼(-1332 cm-1)訊號強度的變化，中間的影像是測量時 的奈米鑽石。(b)不同功率激發下，計算所得到的奈米鑽石溫 度，以及線性適解曲線。……… 82 圖5-1 「氮-空缺-氮」中心模型圖。……… 88 圖5-2 綠光奈米鑽石螢光光譜圖，激發光源是488 nm 氬離子雷射。… 89

圖5-3 (a) gFND-anti-Tf IgG 螢光影像，(b) rFND-Tf 螢光影像，(c)螢

光影像重疊圖，(d)螢光生命期影像，紅色和黃色框是螢光生命

期適解區域。(a)和(d)的螢光訊號收集範圍是 510 − 530 nm，(b)

表 目 錄

頁次

表4-1 40 nm 和 140 nm 螢光奈米鑽石的粒徑大小和表面電位。……… 83

表5-1 綠光和紅光奈米鑽石的粒徑大小。……… 91

第一章 緒論

1-1 螢光奈米鑽石(Fluorescent nanodiamonds，簡稱 FND)

奈米技術已廣泛被應用在生物醫學的範疇，例如細胞螢光影像、藥物輸送和 診斷治療 [1 – 6]。舉例來說，在生物醫學實驗中，常用染料(dye) [7]、螢光蛋白 質(fluorescent protein) [8] 或量子點(quantum dots) [5] 作為螢光標記，跟生物分子 或蛋白質結合後，製作成專一性的探針，以進行標靶螢光影像。但是這些應用仍 有些問題須克服，例如染料和螢光蛋白質的螢光穩定性不佳，容易產生光褪色 (photobleaching) [9, 10]。量子點雖然改善螢光穩定性的問題，但是生物相容性不 高，具有細胞毒性 [11, 12]，這些缺點限制生物醫學上的應用。其他的奈米材料 方面，惰性金屬(noble metal)形成的金奈米粒子，具有較高的生物相容性和低細胞 毒性，也可進行散射光影像(scattering imaging)實驗，且散射光不會有光褪色的現 象 [13, 14]。雖然金奈米粒子改善生物相容性和光褪色的問題，但要製作成專一 性探針，則需進行較複雜的化學表面修飾。 近年來螢光奈米鑽石(fluorescent nanodiamonds，簡稱FND)逐漸嶄露頭角， FND具有以下特性：(1)高度的螢光穩定性 [15]，不會有光褪色的現象，利用汞燈 連續激發8小時，FND的螢光強度不會衰減；(2)生物相容性佳和細胞毒性低 [16, 17]，細胞和高濃度100 μg/mL的奈米鑽石作用，仍然維持良好的細胞活性；(3)容 易進行表面化學修飾，可利用吸附或共價鍵的方式，將生物分子或蛋白質固定在 表面，製作成專一性的探針 [18]。這些特性改善了上述染料、螢光蛋白和量子點 的缺點，可成功扮演生物螢光標記的角色，所以螢光奈米鑽石是極具發展潛力的 奈米材料。接下來將對奈米鑽石的分類、特性和應用作介紹。

鑽石主要分為兩大類，分別是型式I (type I) 和型式II (type II)，型式I鑽石是 含有氮的成分，自然界中99 %是型式I鑽石，型式II鑽石是不含有氮的成分。型式 I鑽石又細分為兩大類，分別是型式Ia (type Ia)和型式Ib (type Ib)，型式Ia鑽石的氮

含量較高，濃度範圍大約是100 − 1000 ppm，氮原子在晶格中的排列，主要呈現 兩兩相鄰，98 %的天然鑽石是型式Ia。型式Ib鑽石的氮含量較低，濃度範圍大約 是50 − 300 ppm，氮原子在鑽石晶格中的排列，主要是以孤立(isolated)的形式存 在。型式Ib鑽石在自然界中的含量很少(< 1 %)。合成方式製造的鑽石幾乎是型式 Ib，無法有效合成型式Ia鑽石，所以要研究型式Ia和Ib鑽石的特性，取材分別是以 天然跟合成鑽石為主。 鑽石本身並不會放出螢光，螢光奈米鑽石的螢光源自於鑽石晶格中的缺陷中 心(defect center)，主要是利用高能量粒子撞擊鑽石，例如電子、中子或質子等等， 在鑽石晶格中產生空缺(vacancy)，再經由真空高溫退火(anneal)，使晶格重新排 列，就可創造出缺陷中心。型式Ia的天然奈米鑽石，所形成的缺陷是「氮-空缺-氮」中心(N-V-N center)，可發出波長範圍500 − 600 nm的綠色螢光 [19]，稱作綠 光奈米鑽石(green fluorescent nanodiamonds，簡稱gFND)。圖1-1是「氮-空缺-氮」 中心的螢光光譜，激發光源是488 nm氬離子雷射，螢光譜線峰值約是520 nm。文 獻記載其光吸收波長範圍是400 − 520 nm，吸收峰約470 nm [19]。合成鑽石是型 式Ib，所形成的缺陷是「氮-空缺」中心 (N-V center)，可發出波長範圍是550-800 nm 的紅色螢光 [15]，稱作紅光奈米鑽石(red fluorescent nanodiamonds，簡稱 rFND)。圖1-2是「氮-空缺」中心的螢光光譜，激發光源是514.5 nm氬離子雷射， 螢光譜線峰值約是660 nm。文獻記載其光吸收波長範圍是400-650 nm，吸收峰約 560 nm [20]。圖1-2光譜中有兩條零聲子線(zero phonon line，簡稱ZPL)，位置在

576 nm和638 nm，是(N-V)0和(N-V)-發光中心分別對應的電子躍遷1E→1A1和3A2 →3E [21, 22]。 紅光奈米鑽石的研究和應用較普遍，主要原因有兩個：(1)合成鑽石較易取 得，價格較低；(2)螢光波長範圍可避開細胞自體螢光的干擾。第二個原因對於生 物影像的應用性最佳，因為細胞在激發光300−500 nm的照射，會產生波長範圍450 − 650 nm的螢光，稱作細胞自體螢光 [23, 24]，會造成影像背景螢光的干擾。紅 光奈米鑽石的螢光範圍是550 − 800 nm，可利用濾光片收集大於650 nm的螢光，

就可避開細胞自體螢光，增加影像的訊雜比。相對地，綠光奈米鑽石的螢光範圍 跟細胞自體螢光重疊，無法利用光學方式分離，所以細胞自體螢光的干擾較為顯 著。因此，在生物醫學上的應用，是以紅光奈米鑽石較為常見。張煥正老師實驗 室進一步測量「氮-空缺」和「氮-空缺-氮」中心的吸收截面(absorption cross section)，分別在532 nm和488 nm激發波長下，其吸收截面分別是(1.7 ± 0.5) × 10-17 和(3.1 ± 0.8) × 10-17 [19, 20]，所以rFND的發光強度約是gFND的2倍。 紅光奈米鑽石的「氮-空缺」中心模型如圖1-3所示，氮原子和相鄰的空缺， 形成鑽石晶格中的發光中心。1997年，Gruber等人利用電子撞擊型式Ib鑽石，電 子的能量是2 MeV，撞擊粒子總量是1012−1015 electron/cm2，在900 ℃真空下退火2 小時產生「氮-空缺」中心 [25]，並首次利用共焦雷射掃描螢光顯微鏡，觀察「氮 -空缺」中心放光特性。他們利用高功率密度(5 MW/cm2)的514.5 nm雷射激發，並 無觀察到光褪色的現象，證明「氮-空缺」中心具有高度螢光穩定性。除了高能電 子撞擊之外，張煥正老師實驗室也相繼發展出利用質子(H+)或氦離子(He+)撞擊來 製造「氮-空缺」中心 [15, 26]。一般質子撞擊能量是3 MeV，撞擊粒子總量是 1015−1016 ion/cm2；氦離子的質量較大，單一粒子可產生較多的空缺，所以氦離子 撞擊能量是40 keV，撞擊粒子總量是1013 ion/cm2，就可產生足夠的「氮-空缺」中 心。相較於電子撞擊，質子和氦離子撞擊產生空缺的效率較好；平均一顆2 MeV 電子、3 MeV質子和40 keV氦離子，可產生的空缺分別是0.1、13和40個。但是穿 透深度方面，分別是2 mm、50 μm和0.2 μm，所以電子的穿透距離較深 [19, 20, 26, 27]。上述製造螢光奈米鑽石的方式，無法在單一次撞擊實驗就大量生產，Curmi 和Treussart實驗室等人於2009年發展出有效率大量製造螢光奈米鑽石的技術 [28]。主要是利用10 MeV的電子撞擊直徑150 − 200 μm的合成鑽石，經過高溫800 ℃退火2小時產生「氮-空缺」中心，再利用研磨的技術，將直徑150 − 200 μm鑽 石研磨成10 nm的螢光奈米鑽石，即可產出大量的螢光奈米鑽石。 奈米材料在生物方面的應用，首重生物的相容性和毒性。文獻報導奈米鑽石 具有生物相容性佳和細胞毒性低的特性，很適合應用在生物體中。Schrand等人，

利用 MTT檢驗(MTT assay)比較奈米鑽石和其他奈米材料的細胞毒性 [16, 17]， 發現奈米鑽石的細胞毒性最低。圖1-4是奈米鑽石、碳黑(carbon black)、奈米碳管 (carbon nanotubes)和氧化鎘(CdO)對細胞的毒性測試 [16]，因為鑽石是由碳原子 所組成，所以將不同形式的碳材加以比較，例如碳黑和奈米碳管。常使用的量子 點，其所釋放的氧化鎘亦列入考量。圖1-4的結果顯示，奈米鑽石的細胞毒性最低， 而量子點釋放出來的氧化鎘毒性最高。因此，奈米鑽石的在生物體上的應用性較 高。許多實驗室已成功展現奈米鑽石能夠成為專一性探針，應用在生物影像上 [29 – 38]。鄭嘉良老師實驗室，將不發光的奈米鑽石製作成標靶探針，將生長激 素(growth hormone)利用共價鍵固定在奈米鑽石表面，可專一辨認肺上皮細胞 (lung epithelial cells)膜表面的受體 [31]，再利用奈米鑽石的史托克拉曼(Stokes

Raman)訊號位置在1332 cm-1，對應是鑽石晶格中碳-碳鍵的伸縮振動(C-C

stretching vibration)波數，不會和細胞所產生的拉曼訊號重疊，所以在擷取拉曼影

像時，只收集鑽石的1332 cm-1 史托克拉曼訊號，即可得知奈米鑽石在細胞上的分

布。在標靶螢光影像方面，張煥正老師實驗室，將螢光奈米鑽石製作成標靶探針， 利用葉酸(folic acid，簡稱FA)固定在rFND表面，跟海拉細胞(HeLa cells)膜表面的 葉酸受體(folate receptor)作用 [35]，可得到rFND的標靶細胞螢光影像。並也利用 螢光奈米鑽石的高度螢光穩定性，將rFND送入細胞質中，長時間觀察rFND在細 胞質中隨時間變化的相對位置，可應用在藥物的追蹤 [26, 32]。除了奈米鑽石在 拉曼和螢光影像的應用之外，Curmi和Treussart實驗室等人，將奈米鑽石的應用拓 展到散射光影像 [36]。鑽石的折射率是2.4，約略是細胞折射率的2倍大，可產生 較大的散射光訊號，所以奈米鑽石送入細胞後，可成功得到奈米鑽石的散射光影 像，因此，不用經過粒子撞擊和高溫退火製作成螢光奈米鑽石，就可應用在細胞 影像。但是奈米鑽石的尺寸越小，散射光強度就會降低，當奈米鑽石尺寸小於37 nm，就無法獲得清楚的散射光影像，所以在應用上仍有限制。 綜觀以上螢光奈米鑽石的優良特性和研究，本研究首次將人體中重要的運鐵 蛋白(transferrin，簡稱Tf)，利用共價鍵固定在紅光奈米鑽石表面，製作成專一性

的探針，探討和細胞膜表面受體的作用力。除此之外，我們也研究不同大小和表 面官能基的奈米鑽石，對於胞吞作用(endocytosis)的特性，觀察是否會影響專一性 和效率。我們也進一步期望奈米鑽石能夠變成抗癌藥物，利用光熱效應將被標靶 的癌細胞殺死，以拓展其生物醫學上的應用。 1-2 研究動機和方法 本研究希望利用奈米鑽石的優越特性，將其製作成專一性的探針，研究人體 細胞中重要的胞吞作用。我們也進一步研究不同表面官能基的奈米鑽石，觀察是 否會影響胞吞作用的專一性和效率，可作為探針設計上的參考。除了設計使奈米 鑽石能夠專一性標靶癌細胞，我們更期望直接將被標定的癌細胞殺死，使奈米鑽 石不只可作為螢光標記，自身就可變成抗癌藥物，提供癌症治療上更多的選擇。 運鐵蛋白是人體中很重要的蛋白質，攜帶血液中的鐵離子，專一性透過細胞 膜表面的運鐵蛋白受體(transferrin receptor，簡稱 TfR)，將鐵離子帶進細胞，以維 持正常的機能 [39, 40]。圖 1-5 是運鐵蛋白進入細胞的示意圖，運鐵蛋白可專一 性辨認細胞膜表面的運鐵蛋白受體，再藉由胞吞作用進入細胞，此進入細胞的過 程，已知稱作受體媒介胞吞作用(receptor-mediated endocytosis)。本研究使用海拉 細胞進行實驗，已知其細胞膜表面有大量的運鐵蛋白受體。一般癌細胞的細胞膜 表面會有大量的運鐵蛋白受體，著名的乳癌化療藥物“小紅莓＂(Adriamycin)， 亦是藉由專一性的Tf-TfR 作用力，將藥物帶進癌細胞，以達治療目的 [40]。我 們將首次把運鐵蛋白固定在紅光奈米鑽石表面，將rFND 製作成專一性的探針， 圖1-6 是製作專一性標靶探針的示意圖，利用共價鍵結將運鐵蛋白固定在 rFND 表面。圖1-7 是專一性標靶實驗的示意圖，rFND-Tf 可專一辨認細胞膜表面的 TfR，進而因胞吞作用進入細胞。因為一般螢光物質的螢光特性很容易受外在環 境影響，所以我們亦將觀察rFND 辨認細胞後，螢光特性是否會受影響。我們利 用共焦雷射掃描螢光顯微鏡，鑑定專一性標靶影像，並藉由螢光光譜和螢光生命 期的測量，分析rFND 的螢光特性是否改變。

奈米粒子是透過胞吞作用進入細胞，而奈米粒子的表面性質，會影響胞吞作 用的效率和專一性 [41 – 43]。目前鮮少研究報導奈米鑽石的表面官能基特性，是 否對於胞吞作用產生影響。已知細胞膜表面是負電，所以我們設計三種不同表面 官能基的rFND，表面分別是修飾羧基(-COO-)、胺基(-NH3+) 以及運鐵蛋白，觀 察對於胞吞作用的效率。除此之外，我們也進一步觀察不同表面官能基的rFND， 是否會產生細胞毒性，這對於生物的應用也相當重要。我們利用動態光散射儀 (dynamic light scattering，簡稱 DLS)和界面電位分析儀(zeta potential)，鑑定 rFND

的表面特性，確認是否成功製作出三種表面官能基的rFND。螢光影像和流式細 胞儀(flow cytometry)，分析 rFND 對胞吞作用的效率。細胞毒性的試驗是利用細 胞影像、MTT 檢驗和細胞計數，作為判別細胞活性的依據。 奈米粒子在癌症標靶治療方面，角色通常是攜帶藥物，進行專一性標靶和藥 物輸送。光熱治療(photothermal therapy)近年來廣泛被研究，主要原理是奈米粒子 吸收照射光轉換成熱能，有效將癌細胞殺死 [44, 45]，不需另外攜帶抗癌藥物， 這樣的治療方式，具有很小副作用和容易操作的優點。主要的缺點是對於體內的 治療，照射光無法到達，因此，僅限於表皮的治療。金奈米和碳材是最常被應用 在標靶光熱治療的奈米粒子 [45 – 57]，而奈米鑽石在光熱治療上的應用，目前尚 未有文獻報導。文獻記載rFND 光吸收波長範圍 400 − 650 nm [21]，根據光熱治 療的原理，我們推測rFND 有機會將小於 650 nm 的光轉換成熱能。我們設計將運 鐵蛋白固定在rFND 表面後，專一性進入細胞，再給予大於 500 nm 的照射光，期 望產生光熱效應，選擇性將癌細胞殺死。

螢光共振能量轉移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，簡稱 FRET)常應 用在生物系統，觀察蛋白質間的作用力 [58–61]。FRET 過程需要兩個螢光物質， 在定義上一個稱作供體(donor)，另一個稱作受體(acceptor)，供體所發螢光波長範 圍剛好和受體吸收範圍有相當重合，當此兩螢光物質因作用力結合，才會有能量

轉移的機會，此時供體的螢光生命期會縮短。生物系統FRET 的應用中，常用的

在應用上有所限制。綠光奈米鑽石的發光範圍，恰好和紅光奈米鑽石的吸收範圍 有良好的重疊，可組成適合的FRET 配對。目前螢光奈米鑽石間 FRET 的效應尚 未被報導，所以我們好奇螢光奈米鑽石間是否會有FRET 的可能性，如此一來， 因為螢光奈米鑽石的螢光穩定性高，可改善螢光蛋白質在應用上的缺點。因此， 我們將進行簡單的實驗，測試螢光奈米鑽石間是否有FRET 的現象。圖 1-8 是螢 光奈米鑽石間FRET 的實驗設計示意圖，我們分別將抗體和抗原固定在綠光和紅 光奈米鑽石表面，利用抗原-抗體作用力將兩種螢光奈米鑽石結合，觀察綠光奈米 鑽石的螢光生命期變化，即可得知螢光奈米鑽石間是否有FRET 的現象。

500 550 600 650 700 750 800

Intensity / a.u.

Wavelength / nm

圖1-1 綠光奈米鑽石螢光光譜圖，激發光源是 488 nm 氬離子雷射。

550

600

650

700

750

800

(N-V)

-(N-V)

0

638 nm

576 nm

Intenaity / arb. units

Wavelength / nm

圖1-4 細胞活性測試的 MTT 檢驗結果，藍、黑、紅、紫和黃色分別代表奈米鑽 石、碳黑、多壁奈米碳管(Multi-Walled Carbon Nanotubes，簡稱 MWNT)、單壁奈 米碳管(Single-Walled Carbon Nanotubes，簡稱 SWNT) 和氧化鎘，添加物和細胞 的反應時間是 24 小時。

圖1-5 運鐵蛋白進入細胞的示意圖。

圖1-7 專一性標靶實驗示意圖。

第二章 實驗技術和步驟

2-1 實驗原理

2-1-1 范氏加速器(Van der Graaf accelerator)

我們使用質子束撞擊型式Ib 奈米鑽石薄膜，在鑽石晶格中產生「氮-空缺」

中心。范氏加速器(Van der Graaf accelerator，型號 KN，廠商 High Voltage

Engineering Europa B.V.)位於國立清華大學原子科學中心加速器實驗室，可提供終 端電壓是1-3 MV，圖 2-1 是加速器的設計圖，其工作原理如下。范式加速器是靜 電式加速器，利用電荷累積達到實驗所需的終端電壓。直流高壓電源供應器給予 電刷50 kV，電荷(正電或負電皆可選擇)由電刷轉移到滾動的橡膠皮帶上，最後轉 移到球面導體(spherical conductor)表面，經由電荷累積達到實驗所需的終端電 壓。質子由射頻離子源產生，經由淬取器吸出後通過加速管，質子在加速管中的 終端電壓獲得能量。圖2-2 分別是(a)加速器的離子源和(b)靶端，圖 2-2(a)的照片 中，圓筒狀是加速器的離子源，藍色箭頭是質子束輸出方向，圖2-2(b)照片中， 紅色框是奈米鑽石試片的放置靶，在真空中接受2.5 MeV 質子撞擊。

2-1-2 共焦雷射掃描螢光顯微術(Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy，簡稱 CLSFM)

1957 年 Marvin Minsky 提出共焦顯微鏡(confocal microscope) [62, 63]，提高影 像的清晰度和雜訊比，克服傳統螢光顯微術的平面成像上，無法觀測某一截面， 造成螢光影像模糊的缺點。時至今日，配合個人電腦以及雷射技術的發展，共焦 雷射掃描螢光顯微術(Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy，簡稱 CLSFM)可得到特定層面影像，並將不同層面影像重疊，進而得到三維立體影像 [64, 65]。共焦(confocal)源自於顯微鏡的物鏡焦點，和集光透鏡的焦點位置相互重

是共焦的基本概念 [63]。早期光源經由集光透鏡聚焦在樣品上，物鏡收集此焦平 面的訊號並成像在偵測器上。為了只收集焦點上的訊號，偵測器前面放置一個針 孔(pinhole)，阻擋非焦平面產生的訊號，可提高螢光影像的清晰度。若要得到二 維影像的螢光強度分佈，則須移動樣品或改變光聚焦的位置。現今共焦顯微鏡已 將集光透鏡與物鏡合而為一，光源由物鏡聚焦在樣品上，同一物鏡收集焦點上的 訊號。圖2-4 是一般共焦雷射掃描螢光顯微鏡的架設圖。雷射光通過 x-y 掃描鏡 改變聚焦位置，經由物鏡激發樣品產生螢光，相同物鏡收集放射的螢光，透過螢 光濾光片除去散射的雷射光，並選取欲偵測的螢光波長範圍，再由透鏡聚焦在針 孔上，移除非焦平面螢光的干擾，螢光強度由光電倍增管(Photomultiplier Tube， 簡稱PMT)偵測。一般常使用的針孔大小範圍是 50 − 150 μm，共焦雷射掃描螢光 顯微術所能達到的平面解析度是繞射極限(diffraction limit) [62]，其公式如下： obj NA r = 0.61 λ (2-1)

其中λ是放射螢光的波長，NAobj是物鏡的數值孔徑(numerical aperture)，r 是平面

上可分辨出兩點的最小距離。共焦雷射掃描螢光顯微術相較於傳統螢光顯微術，

有以下的優點：(1)降低背景螢光干擾，增進影像清晰度，提高訊雜比；(2)可擷取

不同截面的螢光影像，得到三維立體影像；(3)可進行多通道測量，例如兩個以上 螢光物質可同時偵測。缺點則是：(1)以雷射作為激發光源，無法適用所有螢光物 質；(2)雷射激發處的功率密度(power density)很高，螢光物質有光褪色的顧慮。

2-1-3 螢光生命期影像顯微術(Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy，簡稱 FLIM)

當螢光分子被激發到激發態(excited state)，能夠以放出螢光的形式回到基態 (ground state)，螢光生命期(fluorescence lifetime)定義是被激發的螢光分子，停留

在激發態的時間。不同螢光物質的螢光生命期不盡相同，即使是單一螢光物質， 在不同的外在環境下，自身的螢光生命期也會有所改變 [66]。結合螢光生命期和 共焦顯微術，其影像中每個像素(pixel)所記錄的是螢光生命期，而非螢光強度， 此項技術就稱為螢光生命期影像顯微術(Fluorescence Lifetime Imaging

Microscopy，簡稱 FLIM) [58, 67]。目前最常用時間相關單光子計數系統

(Time-correlated Single Photon Counting，簡稱 TCSPC)測量螢光生命期。圖 2-5 是 時間相關單光子計數系統的概念圖。激發光源是脈衝式雷射，常見的脈衝寬度 (pulse width)範圍是皮秒(ps)−飛秒(fs)，重複頻率(repetition rate)範圍是 1 − 80 MHz。當測量啟動時，雷射脈衝對應是時間起始點，光子偵測器偵測到螢光光子 對應時間終點，計算此螢光光子和相鄰雷射脈衝的時間差，在經過大量的計數之 後，就會得到時間和螢光出現次數分佈圖，就相當於螢光強度隨時間衰減曲線， 再經由適解就可得到螢光生命期。在測量的過程中，有許多的脈衝是沒有光子產 生，在這種情況下，光子計數會持續記錄到下一個脈衝有光子進入偵測器為止。 所以這種測量方法需要收集訊號一段時間，才能得螢光強度隨時間衰減曲線。螢 光生命期適解公式如下：

(

/τ

)

exp ) (t A₀ t A = − (2-2) 其中A(t)是隨時間變化的螢光強度，A0是起始的螢光強度，τ 是螢光生命期。

2-1-4 螢光共振能量轉移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，簡稱 FRET)

此法常應用在生物系統，觀察蛋白質間的作用力。圖 2-6 是螢光共振能量轉 移的基本概念 [58]。FRET 的過程需要兩個螢光物質，在定義上一個稱為供體 (donor)，另一個稱為受體(acceptor)，供體所放射的螢光波長範圍，須和受體的吸

會有FRET 的機會。能量轉移的效率可由供體的螢光生命期變化得到，圖 2-7 是 計算能量轉移效率的兩種方法 [58]，分別是圖 2-7(a)測量作用力結合前後，供體 螢光生命期的變化，圖2-7(b)是兩螢光物質經由作用力結合，測量受體光褪色前 後，供體螢光生命期的變化，計算能量轉移效率的公式如下： D DA E τ τ − = 1 (2-3) 其中E 是能量轉移的效率，τDA是發生能量轉移時，供體的螢光生命期，τD是能 量轉移前，供體自身的螢光生命期。 2-1-5 流式細胞儀(Flow cytometry) [68, 69] 流式細胞儀是以流體(flow)帶動細胞(cyto)，進行細胞特性檢測(-metry)的一種 分析技術。主要特色是以單一細胞作為偵測基礎，可在短時間內分析大量細胞 數，例如一分鐘內可偵測104以上的細胞。依實驗目的，使用各式染劑在細胞上， 利用雷射激發偵測螢光。流式細胞儀主要包括三部份：(1)流體系統(fluidics)、(2) 光學系統(optics)和(3)電子系統(electronics)。流體系統的主要功用是將細胞依序送 到測量區，圖2-8 是流體系統的流動室(flow cell)設計概念。流動室內充滿鞘液 (sheath fluid)，細胞樣品被高於整個液流系統的壓力推出去，並藉由流體動力聚焦 (hydrodynamic focusing)原理，使單一細胞通過雷射激發區，偵測個別細胞的螢光 特性。光學系統包括兩部份：(1)激發光學系統(excitation optics)和(2)收集光學系 統(collection optics)。雷射、光纖、稜鏡和透鏡組成激發光學系統，將雷射聚焦通 過流動室，激發細胞上的染劑。螢光由收集光學系統收集，經由光柵、各式光學 濾片、透鏡和反射鏡，選取並收集欲觀察的螢光波長範圍。電子系統主要是將光 子轉換成電子訊號，由光電倍增管接收光子轉換成電子訊號，即代表個別細胞的 螢光強度，數位化後由電腦進行分析。圖2-9 是典型的流式細胞儀實驗結果，黑

色曲線是控制實驗，代表細胞未被染色時的自體螢光強度分佈，紅色曲線是細胞 被染色後的螢光強度分佈，單一細胞內染劑的螢光強度，即為紅色和黑色曲線平 均螢光強度的差值。流式細胞儀的實驗結果是以對數座標呈現，其平均值的計算 公式是幾何平均數(geometry mean)，其公式如下： n Xi geo n i

X

=

10

(

∑

=1log )/ (2-4) 其中X_geo是幾何平均數，Xi是每個細胞所偵測到的螢光強度，n 是偵測的細胞總 數。

2-1-6 動態光散射儀(Dynamic Light Scattering，簡稱 DLS) [70, 71]

動態光散射法常用來檢測奈米等級的粒子，具備測量快速的優點。粒子在溶 液中作布朗運動，粒子越大，運動越慢，反之則越快，所以可從擴散速率求出奈

米粒子的大小。圖2-10 是光動態散射儀的基本架設，當雷射通過懸浮的奈米粒子

溶液，雷射光碰到奈米粒子產生散射光，偵測器紀錄散射光的強度變化，即可得 到隨時間變化的散射光強度，藉由自相關函數(autocorrelation function)推演，可得

到奈米粒子的擴散係數，再經由Stokes- Einstein equation 的推算獲得粒徑大小，

Stokes- Einstein equation 的公式如下：

a T k D b πη 6 = (2-5) 其中D 是粒子的擴散係數，kb是波茲曼常數，T 是絕對溫度，η 是溶劑的黏滯係 數，a 是待測粒子的半徑。

2-1-7 界面電位(Zeta potential) [72] 奈米粒子的表面電性，在生物系統的應用中，會影響胞吞作用的專一性和效 率 [41 − 43]。界面電位是用來估量奈米粒子的表面電位，圖 2-11 是界面電位分 析儀的基本原理。主要是藉由電場下，測量正負電極間奈米粒子的電泳速度。當 雷射光打在帶電的奈米粒子上產生散射光，偵測隨時間變化的散射光強度，藉由 自相關函數的推演，即可得到奈米粒子在電場下的電泳速度，再利用 Smoluchowski equation 計算求得界面電位，其公式如下： ξ = η μ / ε (2-6) 其中ξ 是界面電位，η 是溶劑的黏滯係數，μ 是奈米粒子在電場下的電泳速度，ε 是溶劑的介電常數。 2-1-8 細胞活性測試-MTT 檢驗 [73] MTT 檢驗是常用來判定細胞活性的方法之ㄧ，主要是檢驗細胞內粒線體 (mitochondria)的還原能力，圖 2-12 是 MTT 還原化學反應方程式。MTT 試劑是水 溶性分子，化學命名是3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

bromide。MTT 試劑經過粒線體中的琥珀酸去氫酶(succinate dehydrogenase，簡稱 SDH)的還原，在細胞質內形成不溶解的紫色結晶顆粒(formazan)，在特定的反應 時間後，加入二甲亞碸(Dimethyl sulfoxide，簡稱 DMSO)破壞細胞膜，並使 formazan

溶解，formazan 溶解後會有 540 nm 的吸收，因此，測量溶液中 540 nm 的吸收度，

可得知細胞的還原能力。每隻細胞的還原能力相近，所以當活細胞數目越多，還 原能力就會越強，540 nm 的吸收度就會越大，表示細胞活性高。

2-2 實驗系統 2-2-1 共焦雷射掃描螢光顯微鏡 圖 2-13 是本實驗室自製共焦雷射掃描螢光顯微鏡的架設圖，以 Nikon TE2000 倒立式顯微鏡為主體，配備有Nikon C1 共焦掃描系統、雷射和偵測器。雷射光 未經擴束直接由透鏡導入Nikon 的激發光纖，激發光纖的接頭是 APC 形式，圖 2-14 是 APC 光纖接頭示意圖，其光纖頭呈現 8°的倒角，可降低光源的反射次數， 以提高穿透效率。此光纖會保有雷射的偏振(polarization)方向，雷射在導入光纖 時，其偏振方向需和標記平行，如圖2-14 所示。雷射光導入激發光纖後，再接到 Nikon C1 掃描系統，圖 2-15 是 Nikon C1 掃描系統的設計圖。激發光纖將雷射導 入掃描系統，先經過平行光透鏡，將雷射光變成平行光。再經過分色鏡(dichroic mirror)反射到 x-y 掃描鏡系統，可進行二維的平面掃描，最後通過掃描透鏡進入 顯微鏡中。光源經由物鏡將樣品激發，放射的螢光由原物鏡收集並導回Nikon C1 掃描系統。螢光經由集光透鏡聚焦在針孔上，最後導入螢光收集光纖到達光電倍 增管(型號 H5783-02，廠商 Hamamatsu)偵測螢光強度。本實驗室雷射光源有連續 波473 nm 固態雷射(總功率 25 mW)、氬離子雷射(主要波長 488 nm 和 514.5 nm， 總功率65 mW)以及氦-氖綠光(波長 543 nm，總功率 1 mW)和紅光(波長 632.8 nm，總功率 22 mW)雷射，可作為單光子激發光源，脈衝式鈦-藍寶石雷射(波長 範圍700 − 1000 nm，最大功率 1 W，重複頻率 80 MHz)可做為雙光子激發光源。 Nikon C1 的針孔大小方面，有四種大小可供選擇，分別是 30、60、100 和 150 μm。 2-2-2 螢光生命期顯微鏡 圖 2-16 是本實驗室螢光生命期顯微鏡架設圖，以共焦雷射掃描螢光顯微鏡為 主體，配備脈衝式雷射和PicoQuant 的時間相關單光子計數系統。脈衝式雷射光 源經由透鏡導入APC 光纖，並接到 Nikon C1 掃描系統，可進行二維的影像掃描。 除此之外，TCSPC 數據卡上要輸入兩個訊號：(1)雷射的脈衝訊號，可由雷射本 身的輸出訊號獲得，將訊號接在數據卡上的sync 位置；(2)螢光光子的訊號，可

由光子偵測器獲得，將訊號接在數據卡上的start 位置。此兩訊號經由 TCSPC 數 據卡處理，計算此螢光光子和相鄰雷射脈衝的時間差，在經過大量的計數之後，

就會得到時間和螢光出現次數分佈圖。本實驗所使用的脈衝式雷射是470 nm 二

極體雷射(總功率是 1 mW，重複頻率是 10 MHz)，另有脈衝式鈦-藍寶石雷射可做 為雙光子激發光源。光子偵測器方面，本實驗室有光子計數式光電倍增管(photo counting mode PMT，型號 H5783P-03，廠商 Hamamatsu)，以及雪崩光電二極體 (avalanche photodiode，簡稱 APD，型號 SPCM-AQR-14-FC，廠商 Perkin Elmer)。

2-2-3 拉曼和螢光光譜儀 拉曼和螢光光譜儀的架設相同，利用顯微鏡系統擷取拉曼或螢光訊號，圖 2-17 是拉曼光譜的架設圖。雷射光小角度(小於 10 度)打在刻槽濾光片(notch filter) 並反射進入顯微鏡，若雷射光打在刻槽濾光片的角度大於10 度，其反射率和阻 隔雷射光的效率會大為降低。激發光源透過物鏡聚焦在樣品上，拉曼或螢光訊號 由相同物鏡收集，依循原路徑穿透刻槽濾光片，訊號經由透鏡聚焦在光纖上，再 導入單光儀(型號 iHR320，廠商 Jobin-Yvon)進行光譜解析，電荷藕合元件

(Charge-Coupled Device，簡稱 CCD，型號 DU970N-UVB，廠商 Andor)作為偵測

器，即可得到拉曼或螢光光譜。本實驗室的刻槽濾光片所對應的雷射波長有488

nm (型號 NF01-488U-25，廠商 Semrock)、514.5 nm (型號 NF01-514U-25，廠商 Semrock)、532 nm (型號 NF03-532E-25，廠商 Semrock)和 633 nm (型號

NF03-633E-25，廠商 Semrock)。 2-3 實驗步驟 2-3-1 螢光奈米鑽石的製備和表面修飾 140 nm 型式 Ib 合成奈米鑽石由 Element Six 購得，40 nm 型式 Ib 合成鑽石， 以及70 nm 型式 Ia 天然奈米鑽石由 Micro Diamant 購得。我們先將奈米鑽石懸浮 在去離子水(deionized water)中，配製成濃度 10 mg/mL，取 50 μL 滴在矽晶片

(silicon wafer)上使其自然乾燥，即完成奈米鑽石薄膜製作，再送到國立清華大學 原子科學中心加速器實驗室，進行質子撞擊。質子撞擊的能量是2.5 MeV，撞擊 的粒子總數約是1016 ions/cm2，撞擊時的電流依奈米鑽石的大小而有所不同，140 nm 型式 Ib 和 70 nm 型式 Ia 奈米鑽石的撞擊電流是 6 μA，40 nm 型式 Ib 奈米鑽 石撞擊電流是1 μA，因為 40 nm 型式 Ib 奈米鑽石在較低的撞擊電流下，製作出 來的螢光奈米鑽石可得到較強的螢光，所以40 nm 型式 Ib 奈米鑽石的撞擊電流較 小。撞擊後結束後，放進真空高溫爐進行退火，流程如下：在真空中800 ℃退火 4 小時，壓力是 6 × 10-3 torr，接著在大氣下 600 ℃退火 2 小時，即完成螢光奈米 鑽石的製作。合成奈米鑽石可發出波長範圍550 − 800 nm 的紅色營光，稱作紅光 奈米鑽石，天然奈米鑽石可發出波長範圍500 − 600 nm 的綠色營光，稱作綠光奈 米鑽石。 若 FND 表面要固定蛋白質，需有羧基(-COOH)在奈米鑽石表面，可和蛋白質 的胺基(-NH2)形成醯胺鍵結(amide bond)。螢光奈米鑽石經過強酸處理，表面會生 成羧基，實驗流程如下：FND 懸浮在濃硫酸和硝酸(硫酸：硝酸 = 9：1)中，在室 溫下反應24 小時，接著在 0.1 M 氫氧化鈉水溶液中，90 ℃反應 2 小時，以及 0.1M 氯化氫水溶液中， 90 ℃下反應 2 小時，羧基化螢光奈米鑽石(FND-COOH)製備 完成 [38, 74]。 為了將 FND 製作成專一性探針，我們把運鐵蛋白(型號 T4382，廠商 Sigma-Aldrich)利用共價鍵固定在 FND-COOH 表面。因為 rFND 的螢光範圍可有 效避開細胞的自體螢光，所以選用rFND 來做專一性探針。運鐵蛋白(0.1 mg)和

rFND-COOH (0.2 mg)溶解懸浮在 1 mL 磷酸鹽緩衝溶液(Phosphate Buffer Saline，

簡稱PBS) 中，加入 5 mg 的 N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethyl-carbodiimide

hydrochloride (簡稱 EDC，型號 E7750，廠商 Sigma-Aldrich)反應試劑活化反應，

在室溫下反應24 小時，運鐵蛋白和奈米鑽石間形成共價鍵的醯胺鍵結，即完成

rFND-Tf 複合物的製作。表面帶正電的胺化螢光奈米鑽石(rFND-NH2)的製作，是

APTS，型號 A3648，廠商 Sigma-Aldrich)水溶液中，使 APTS 包覆在 rFND-COOH 表面 [75]，反應 30 分鐘即完成 rFND-NH2的製備。rFND-Tf 和 rFND-NH2的純化 程序是先經過離心，將上層液除去，再加入PBS 溶液使 rFND-Tf 和 rFND-NH2 重新懸浮，此程序進行3 次，最後配製在 PBS 溶液中以備使用。 2-3-2 細胞培養和樣品製作 進行各種細胞實驗之前，海拉細胞是培養在10 公分培養皿，培養基是 DMEM

(Dulbecco's Modified Eagle Medium)，其中添加 10 %胎牛血清(Fetal Bovine Serum，簡稱 FBS)和 1 %青黴素/鏈黴素(Penicillin/Streptomycin，簡稱 PS)。專一 性標靶的實驗方面，104細胞種在直徑12 毫米蓋玻片上，使細胞貼附 12 小時後 進行實驗。實驗組是rFND-Tf (10 μg/mL)和細胞作用 1 小時，另有兩組控制實驗： 分別是(1)細胞和 rFND-COOH (10 μg/mL)反應 1 小時，觀察是否有非專一性作 用；(2)細胞先和運鐵蛋白(10 mg/mL)作用 1 小時，再和 rFND-Tf (10 μg/mL)反應 1 小時，目的是阻塞(block)細胞膜表面的運鐵蛋白受體，觀察 rFND-Tf 是否仍會 辨認細胞。細胞和rFND 反應結束後，先用 PBS 將未反應的 rFND 洗掉，總共清 洗三次，再加入4 %三聚甲醛(paraformaldehyde，型號 P6148，廠商 Sigma-Aldrich) 固定細胞，反應15 分鐘後用 PBS 清洗三次，即完成細胞樣品的製備，就可擷取 共焦雷射掃描螢光影像。 在探討三種表面官能基rFND 的胞吞作用方面，三片直徑 12 毫米的蓋玻片上 各種5 × 105細胞，培養基含有10 %胎牛血清，分別和三種不同表面官能基的 rFND 作用6 小時，反應濃度是 10 μg/mL。有一個控制實驗是細胞在不含胎牛血清的培 養基中，和rFND-COOH 的反應 6 小時。此實驗目的是觀察使細胞飢餓的情況下， 是否會增加非專一性的胞吞作用。反應結束後，將未反應的rFND 用 PBS 清洗 3 次，再用4 %三聚甲醛固定細胞，接下來進行細胞核染色。在細胞固定結束之後， 和稀釋1000 倍的細胞核染劑(Hoechst 33342，原液濃度是 10 mg/mL，型號 H3570， 廠商Invitrogen)反應 30 分鐘，再用 PBS 清洗三次，即完成細胞核染色。

2-3-3 細胞螢光影像擷取

螢光影像的擷取分為三種：分別是(1)共焦雷射掃描、(2)螢光生命期和(3)廣 視野(wide field)螢光影像。共焦雷射掃描螢光影像方面，使用 60 X 物鏡(NA 1.2)， rFND 和細胞核染劑的激發光源，分別是 514.5 nm 氬離子雷射和 405 nm 二極體 雷射，分別收取663 − 738 nm 和 420 − 500 nm 的螢光訊號，針孔大小設定是 60 μm。rFND 螢光生命期的測量方面，激發光源是 470 nm 二極體雷射(PicoQuant)， 重複率(repetition rate)設定是 10 MHz，螢光訊號收集範圍是 663-738 nm。廣視野 螢光影像方面，激發光源是100 W 高壓汞燈，利用濾片選取激發和螢光的波段， rFND 和細胞核染劑的激發波段分別是 510 − 560 nm 和 340 − 380 nm，螢光的收 集範圍分別是大於590 nm 和 435 − 485 nm。 2-3-4 流式細胞儀的樣品處理 我們利用流式細胞儀分析單一細胞內 rFND 的螢光強度，探討不同表面官能 基的rFND 對胞吞作用的效率。實驗設計有兩種：分別是(1)反應濃度和(2)反應時 間的探討。細胞培養在含10 % 胎牛血清的培養基中，細胞種在 12 孔盤(12 well plate)中，每個孔皆約有 5 × 105細胞，和不同表面官能基的 rFND 作用。在反應 濃度分析方面，不同表面官能基的rFND 分別和細胞反應的時間固定是 6 小時， 反應濃度分別是1、2、5、10 和 20 μg/mL。反應時間分析方面，rFND 的反應濃 度是10 μg/mL，反應時間分別是 0.5、1、1.5、2、3、4 和 5 小時。反應結束後， 未反應的rFND 用 PBS 沖洗細胞三次，在加入 0.05 %胰蛋白酵素(trypsin，型號 25300054，廠商 Invitrogen)50 μL 和細胞作用 1 分鐘，使細胞不再貼附，再用 1 mL 細胞培養基將細胞沖下，放在的1.5 mL 的離心管中。接下來使用離心機(型號 5424，廠商 eppendorf，轉速設定 1500 rpm，時間是 3 分鐘)將細胞離心下來，取 走上層細胞培養基，加入0.3 mL 的 PBS 溶液，充分搖盪使細胞懸浮，再加入 70 %酒精溶液 0.6 mL，完成流式細胞儀樣品製備，並存放在-20 ℃中儲存，等到要 測量時再取出。在上機進行測量之前，含酒精的溶液先需經過離心，將溶液置換

成PBS，才可打入流式細胞儀(型號 FACS Array，廠商 BD)進行分析。本研究測 量的細胞總數是5 × 103。 2-3-5 螢光奈米鑽石的細胞毒性 我們利用細胞影像、細胞計數和 MTT 檢驗，觀察奈米鑽石對細胞的毒性。 在細胞影像和細胞計數的部分，細胞種在12 孔盤中，每個孔皆有約 5 × 104細胞， 培養基含有10 % 胎牛血清，細胞分別和三種表面官能基的 rFND 作用。 rFND-COOH 的反應濃度是 0、10 和 100 μg/mL，rFND-Tf 和 rFND-NH2的反應濃 度範圍是0、1 和 10 μg/mL。細胞影像和細胞計數是各別的兩組細胞樣品，在反 應第48 小時後，利用 10 X 相位對比(phase contrast)顯微鏡和細胞計數器，分別擷 取細胞影像和計算細胞數目，以觀察細胞的型態以及數量的變化。在MTT 檢驗 方面，96 孔盤的每個孔皆種約 5 × 103細胞，分別和10 μg/mL 的 rFND-COOH、 rFND-Tf 和 rFND-NH2反應，在第0、24、48、72 小時測量 MTT 的結果。MTT 的測量方式如下：MTT 試劑(型號 M5655，廠商 Sigma-Aldrich)配製成 12 mM， 在96 孔盤中各加入 10 μL，和細胞反應 4 小時，最後再加入 50 μL 的 DMSO 反

應10 分鐘，就直接利用免疫酵素分析儀(ELISA reader，型號 EMax，廠商 Molecular

Devices)測量 540 nm 的吸收，檢定細胞的存活率。

2-3-6 螢光奈米鑽石的光毒性

rFND-Tf 透過細胞膜表面的運鐵蛋白受體，專一性進入細胞後，我們將給予

照射光測試rFND 的光毒性。細胞培養在含 10 %胎牛血清的培養基中，8 孔腔體

玻片(8 well chamber coverglass，型號 155411，廠商 Lab-TekTM)上的每個孔皆有 5 ×

104細胞，和140 nm rFND-Tf 反應 6 小時，反應濃度是 1 μg/mL。反應結束後，

將未反應的rFND-Tf 用培養基洗去，置換成新的培養基。將細胞樣品放在顯微鏡

上的細胞培養箱(incubator)中，接受光照射並觀察細胞形態的變化。照射光源分

片選擇兩個波段，分別是510 − 560 nm 和 590 − 650 nm，經由 40 X 微分干涉對比 (Differential Interference Contrast，簡稱 DIC)物鏡(NA0.75)照射在細胞上，功率密

度(power density)皆是 7 W/cm2，照射時間是連續3 小時，紀錄細胞形態的變化。

532 nm 雷射由 20X 微分干涉對比物鏡(NA0.75)照射在細胞上，功率密度範圍 25 −

75 W/cm2，照射時間是10 分鐘，除了紀錄細胞形態的變化之外，還利用染劑輔

助判斷細胞的存活。細胞經由照射結束後，隨即加入活細胞染劑Calcein AM，以

及死細胞染劑ethidium homodimer-1 (EthD-1)。這組細胞染劑是由 Invitrigen 購

得，型號是L3224。Calcein AM 和 EthD-1 皆可由 495 nm 激發，所放出的螢光峰 值分別是515 nm 和 635 nm，藉由觀察螢光顏色輔助判斷細胞存活。Calcein AM 和EthD-1 的作用機制如下： 活細胞染劑：Calcein AM 是疏水性(hydrophobic)物質，不發螢光，容易穿過 細胞膜進入細胞，經由活細胞質內的酵素代謝，轉換成親水性(hydrophilic)物質， 會被侷限在細胞質中，經由激發放出綠色螢光，所以是利用酵素的活性，判定活 細胞與否。 死細胞染劑：當細胞死亡，細胞膜會受損而破洞，EthD-1 會穿過細胞膜並進 入細胞核，跟核酸結合後，經由激發放出紅色螢光。活細胞的細胞膜完整，EthD-1 不會進入細胞，就不會觀察到紅色螢光。 觀察活和死細胞染劑的螢光，激發光源是 100 W 高壓汞燈，激發波段都是 460 − 500 nm，螢光收集波段分別是 510 − 560 nm 和 618 − 675 nm。 2-3-7 螢光共振能量轉移 為了觀察螢光奈米鑽石間的螢光共振能量轉移，我們利用抗體-抗原作用力， 將rFND 和 gFND 相結合。運鐵蛋白和抗運鐵蛋白免疫球蛋白 G (anti-Tf IgG，型 號T6265，廠商 Sigma-Aldrich)分別固定在 rFND 和 gFND 表面，製作成 rFND-Tf

和gFND-anti-Tf IgG，固定方法亦是利用 EDC 的反應，使蛋白質和 FND 表面形

10 μg/mL，混合的體積比是 1：1，使總體積是 0.4 mL。反應環境是 pH = 7.4 的 PBS 溶液，反應時間是 1 小時，讓兩種螢光奈米鑽石複合物在溶液中相互結合。 反應結束後，將0.4 mL 反應溶液均勻滴在蓋玻片上，靜置 30 分鐘讓 rFND-Tf 和 gFND-anti-Tf IgG 吸附在蓋玻片表面。30 分鐘後洗掉上層液，即完成螢光共振能 量轉移樣品。在螢光影像擷取方面，激發光源是470 mn 脈衝式雷射(PicoQuant)， 重複率(repetition rate)是 10 MHz，gFND 和 rFND 的螢光收集範圍，分別是 510 − 530 nm 和 650 − 730 nm。FLIM 影像的擷取方面，螢光訊號收集範圍是 510 − 530 nm，以觀察能量轉移前後 gFND 螢光生命期的變化。

圖2-2 加速器的現場照片，(a)離子源和射束輸出方向，(b)靶端，紅色框是奈米鑽 石試片放置靶。

(b)

(a)

圖2-3 共焦的基本架構，(A)光源針孔，(B)偵測針孔，(C)集光透鏡，(S)待測樣品， (O)物鏡，(P)光電管。

圖2-4 一般共焦雷射掃描顯微鏡的架構，藍色曲線是激發雷射路徑，橘色曲線是

圖2-5 時間相關單光子計數系統之概念圖。

圖2-7 螢光共振能量轉移效率計算方法。(a)測量作用力結合前後，供體的螢光生 命期變化，(b)經由作用力結合，測量受體光褪色前後，供體螢光生命期的變化。

圖2-8 流式細胞儀的流動室剖面圖，利用流體動力聚焦，使單一細胞通過雷射激

發區。

100 1000 10000 100000 0 10 20 30 40 50 60 70 Control Stained cells

C

ounts

Fluorescence intensity

圖2-9 典型流式細胞儀的實驗結果，黑色曲線是控制實驗，即細胞不經染色，代 表細胞自身的背景值，紅色曲線是被染色細胞的螢光強度。

圖2-10 光動態散射儀基本架設圖。

圖2-12 MTT 檢驗的還原化學反應方程式。

圖2-14 APC 光纖接頭示意圖。

圖2-15 Nikon C1 掃描系統設計圖，(1)平行光透鏡，(2)分色鏡，(3) x-y 掃描鏡系

圖2-16 本實驗室螢光生命期顯微鏡之架設。

第三章 紅光奈米鑽石的螢光特性和專一性標靶影像應用

3-1 奈米鑽石螢光特性 本研究使用直徑是 40 nm 和 140 nm 的型式 Ib 合成奈米鑽石，製作成紅光奈 米鑽石進行研究。型式Ib 奈米鑽石的氮含量濃度約 50 − 300 ppm，氮原子在晶格 中主要是取代碳的位置，以孤立的形式存在。紅光奈米鑽石的發光中心是「氮-空缺」中心，主要利用清華大學原子科學發展中心加速器實驗室的加速器，2.5 MeV 質子撞擊奈米鑽石薄膜，在晶格中產生空缺，再經由真空 800 ℃退火，使晶 格重新排列，形成「氮-空缺」中心。濃度 10 mg/mL 的奈米鑽石水溶液，取 50 μL 滴在矽晶片上，使其自然乾燥，形成奈米鑽石薄膜。2.5 MeV 質子撞擊的粒子總

數約是1016 ion/cm2，40 nm 和 140 nm 的撞擊電流分別是 1 μA 和 6 μA，撞擊所需

的時間分別約是90 和 15 分鐘。我們發現 140 mn 奈米鑽石的螢光強度和撞擊電 流大小無關，撞擊電流越大，越快到達撞擊的粒子總數，可節省撞擊的時間，但 若電流太大，撞擊處產生的熱能會過高，撞擊靶無法承受，所以撞擊電流設定在 6 μA。相反地，40 nm 奈米鑽石的螢光強度會受撞擊電流影響，撞擊電流大於 1 μA，會使奈米鑽石螢光強度降低，所以 40 nm 奈米鑽石的撞擊電流設定在 1 μA。 真空高溫退火的條件，會影響螢光奈米鑽石的發光強度，文獻的退火條件是 真空800 ℃退火 2 小時。圖 3-1(a)是我們依文獻的退火條件，所得到的 140 nm rFND 螢光光譜範圍 550 − 800 nm，其中零聲子線位置在 576 nm 和 638 nm，分別 代表(N-V)0和(N-V)-對應的電子躍遷1E→1A1和3A2→3E [21, 22]，所量測的位置跟 文獻結果吻合。為了最佳化rFND 的螢光強度，我們改變真空退火的條件。最佳 化條件是在真空爐壓力6 × 10-3 torr 下，溫度 800 ℃退火 4 小時，接下來在大氣下 600 ℃退火 2 小時(文獻條件並無在大氣下退火)，得到的螢光光譜如圖 3-1(b)所 示。比較圖3-1(a)和圖 3-1(b)，最佳化條件所得到的螢光光譜，零聲子線較明顯， 且平均螢光強度約高於8 倍，推測的原因有兩個：(1)退火時間較長，有足夠的時

間可產生較多的「氮-空缺」中心；(2)大氣下 600 ℃退火 2 小時，因氧化作用清 除奈米鑽石表面的石墨，使螢光的穿透性變佳。我們嘗試加長真空高溫退火的時 間，大於4 小時的退火，螢光強度並無明顯差別，所以真空高溫退火的時間設定 在4 小時。圖 3-2 是經由最佳化條件所得到的 40 nm rFND 螢光光譜，相較於 140 nm rFND 的螢光光譜，並無觀察到兩條明顯的零聲子線，且 40 nm rFND 的螢光 強度很微弱，要從光譜直接比較單顆rFND 的螢光強度，準確性會降低。為了比 較出兩種尺寸rFND 的螢光強度，我們測量相同濃度 rFND 水溶液(10 μg/mL)的螢 光強度，以推算出單顆rFND 間的螢光強度比。我們測得相同濃度的 140 nm rFND 螢光強度是40 nm rFND 的 37 倍，而 40 nm 和 140 nm rFND 的體積比是 1：43， 所以單顆的強度比是1：1591。此兩種尺寸 rFND 的螢光強度差異很大，推測原 因如下，40 nm 和 140 nm 的奈米鑽石來源，是不同公司所購得，推測氮的含量差 異很大，或者是尺寸小的奈米鑽石接受撞擊時，產生空缺的效率較差，所以造成 如此大的差距。 為了要將螢光奈米鑽石應用在生物系統上，本研究選用海拉細胞來進行專一 性標靶細胞影像實驗，首先必須克服細胞自體螢光的干擾。圖3-3 的紅色和綠色 曲線分別代表rFND 和海拉細胞的螢光光譜，經由氬離子雷射波長 514.5 nm 的激 發，海拉細胞自體螢光範圍在520 − 650 nm，紅光奈米鑽石的螢光範圍在 550 − 800 nm，譜線峰值約是 660 nm。所以我們可利用 rFND 的螢光寬廣性，在螢光影像 擷取時，收集如圖3-3 的紫色區域，此處已無細胞的自體螢光，可單純得到紅光 奈米鑽石的訊號，以避免細胞的自體螢光的干擾。接下來我們將實際進行實驗， 以確認使用rFND 作為螢光標記，是否可有效避免細胞自體螢光的干擾。 海拉細胞已知其細胞膜表面會有大量的運鐵蛋白受體，所以我們將運鐵蛋白 固定在140 nm rFND 表面，製作成 rFND-Tf 複合物，和細胞膜表面的 TfR 作用。 細胞培養在含10 %胎牛血清的培養基中，104細胞種在直徑12 毫米的蓋玻片上， 海拉細胞在活著的時候，和濃度是10 μg/mL 的 140 nm rFND-Tf 反應 1 小時，使 140 nm rFND-Tf 辨認細胞膜表面的 TfR。反應結束後，用 pH = 7.4 的磷酸鹽水溶

液洗去未反應的rFND-Tf，並用 4 %的三聚甲醛將細胞固定。我們利用共焦雷射

掃描螢光顯微鏡，觀察rFND-Tf 是否可避免細胞自體螢光的干擾。圖 3-4 分別是

(a)海拉細胞明視野(bright field image)，(b)和(c)是共焦螢光影像，螢光收集範圍分 別是(b)大於 550 nm 和(c) 663 − 738 nm。比較圖 3-4(a)的明視野影像，圖 3-4(b) 的螢光影像是收集大於550 nm 的螢光訊號，會同時偵測到 rFND 和細胞的螢光， 所以螢光影像可看出整隻細胞的輪廓，顯示有背景螢光的干擾，即來自於細胞的 自體螢光。圖3-4(c)的螢光影像是收集 663 − 738 nm 的螢光訊號，顯示背景螢光 干擾明顯降低，只觀察到rFND-Tf 的螢光影像。由圖 3-4 的結果顯示，利用 rFND 螢光寬廣的特性，收集大於650 nm 螢光，成功降低細胞自體螢光的干擾，可增 加螢光影像的清晰度。 一般螢光分子的螢光光譜和螢光生命期，容易受官能基的置換或外在環境的 影響，會改變其原有的螢光特性。1959 年，Kaiser 和 Bond 利用 X-ray 繞射和紅 外光吸收的分析，確認氮原子是佔據鑽石晶格中碳的位置 [76]，所以「氮-空缺」 中心是在鑽石的晶格中。因此，我們欲探討rFND 的螢光特性，是否會受表面官 能基特性或外在環境的影響。我們利用螢光光譜和螢光生命期，觀察rFND 的螢 光性質是否改變。 本實驗設計分為三種：兩種表面官能基(1)羧基(rFND-COOH)和(2)運鐵蛋白 (rFND-Tf)；以及外在環境的探討：(3)細胞質內的 rFND-Tf。在樣品的製作方面， 將(1)和(2)分別配製成濃度 1 μg/mL 的水溶液，取 2 μL 滴在蓋玻片上使其自然乾 燥，即完成樣品的製作。細胞質內的rFND-Tf，就是圖 3-4 中所使用的細胞樣品。 圖3-5 分別是(a) rFND-COOH，(b) rFND-Tf 和(c)細胞質中 rFND-Tf 的螢光光譜。 每個螢光光譜中有黑、紅、綠三條曲線，代表測量三顆不同的rFND，其螢光強 度上的差異，源自於待測rFND 的顆粒大小不同。依樣品的製備方式，所測量的 顆粒應為rFND 聚集的形態。比較圖 3-5(a)和圖 3-5(b)，rFND 的螢光光譜並無明 顯差異，仍可清楚看到兩根零聲子線，位置分別在576 nmc 和 638 nm，表示運鐵 蛋白固定在rFND-COOH 表面後，光譜特性並不受影響。圖 3-5(c)是 rFND-Tf 在