1. 厚朴抽取物的製備
將木蘭科(Magnoliaceae)植物 Magnolia officinalis REHD. et WIL 之乾燥根皮溶於 methanol，經迴流萃取，過濾，濃縮，再以 chloroform 溶解，以 chloroform 可溶部分以水萃取，再取 chloroform 溶解以 n-hexane 萃取，將 n-hexane 層經濃縮，再結晶即可得厚朴之抽取物。
經由本方法所抽取的抽取物大部分為厚朴中之 magnolol (經 TLC 定性 的結果得知 90%為 magnolol)。
2. 血管平滑肌細胞的培養
將含有 10% FBS 的 DMEM 培養基（含 3.7g/l NaHCO3, 4.5g/l D-Glucose, 1.028g/l N-Acetyl L-alanyl-L-glutamine, 1% Na-Pyruvate, 100 units/ml penicillin G 及 100 ug/ml streptomycin sulfate）在 37℃之 水浴恆溫槽中加溫。將儲存在液態氮中大鼠主動脈平滑肌細胞（購自 食品工業發展研究所，Cell no.:60127，代號 A10）取出後迅速放入 37℃之水浴恆溫槽中快速解凍(自液態氮容器中取出冷凍管，檢查蓋 子是否旋緊，由於熱脹冷縮過程，此時蓋子易鬆掉)，以避免冰晶傷 害細胞(細胞活化後，需立刻培養，儘速放入培養基，需數日或繼代 一至二代，細胞生長及特性表現才會恢復)。以 70%酒精棉花擦拭冷 凍管外部， 移入無菌操作台內，以 1 ml pipette 將解凍之細胞懸浮液
吸出加入有培養基之離心管中(10 倍以上稀釋)，混合均勻，離心 1,200 rpm, 5 分鐘，移去上清液，加入新鮮培養基，混合均勻，放入 10 公 分培養皿中，在 37℃的細胞培養箱 (95％ O2, 5％CO2) 中培養，每 二天換一次培養基。當細胞長滿後，以 9 吋滴管接抽氣幫浦移除培養 皿中的培養基，用 10 ml pipette 吸取 10 ml 1X PBS 至培養皿中並稍 微搖晃後再以 9 吋滴管抽去，重複此步驟二次以維持培養皿中為中性 環境，接著以 1 ml pipette 吸取 1 ml trypsin (吸取的量以蓋過培養皿 表面為原則) 加到培養皿中，再放入細胞培養箱 5分鐘，之後加入 2 ml 培養基中和 trypsin 並以 1 ml pipette 來回沖刷培養皿上的細胞，盡量 使細胞呈單顆懸浮，將細胞懸浮液吸到 100ml 血清瓶後補加培養基 至 10 ml，以 haemocytometer 計算細胞數（細節將在下文敘述）。
注意事項: laminar flow 使用前先讓其抽氣運轉 10 分鐘，再以 70%酒 精擦拭桌面。所有進入 laminar flow 的物品均需先噴灑 70％酒精，有 蓋容器旋開瓶蓋前先過火。培養基若使用量小，則盡量置於室溫下回 溫，以避免 pH 值變化。
3. 利用 haemocytometer 來計數細胞數目
在細胞要做實驗前，先取出 100 ul 細胞懸浮液至薄壁微量管，再 加入 100 ul trypan blue（0.06％K2HPO4, 0.8％ NaCl, 0.4％ trypan
倍下以計數器計算在 haemocytometer 九大格中的左上，左下，右上，
右下及中間格的細胞數總合，除以 5 （等於每一大格的平均細胞數）， 再乘以 104（haemocytometer 中的一大格體積是 1×10-4 ml），再乘以 2
（因為之前加入 trypan blue 使得細胞數為原先的二分之一），則可得 到原本細胞懸浮液中 1 ml 所含的細胞數。
4. 利用[3H]thymidine incorporation assays來測定血管平滑肌細胞的 生長週期
將96 well培養盤的每一個 well種 5x103細胞，放入細胞培養箱中 培養24小時，換上200ul 0.5％ FBS的DMEM培養基繼續培養24小時 作同步化（Synchornization）的動作。之後分別在第0,24,30,36小時換 成200ul 15% FBS的DMEM (n=8) 培養48小時，第44小時加入2.5 uCi/ml methyl-[3H] thymidine 繼續培養4小時，接著利用細胞收集器將 細胞沖碎並轉至尼龍膜上並將膜置於抽氣中的laminar flow中隔夜，最 後將膜部分撕下放入含4ml catel溶液的計數小管中,最後把計數小管 放入機器判讀。
5. 西方墨漬法 ( Western blot )
將 3.5×105的平滑肌細胞種至 6 well 培養盤的每一個 well，再以 培養基補至最終體積為 2 ml，放入細胞培養箱培養 24 小時後取出，
抽去培養基且每一個 well 以 2 ml PBS 洗一次，換上 0.5％ FBS 的 DMEM 培養基繼續培養 27 小時作同步化。接著開始給藥，positive control 為 15％ FBS 之 DMEM， negative control 為 0.5％FBS 之 DMEM， 丹參抽取物 Salvianolic acid B 給予劑量為 0.001mg/ml, 0.01mg/ml, 0.1 mg/ml，厚朴抽取物 Magnolol 給予劑量為 0.001mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.05 mg/ml (n＝3)；接著在細胞培養箱中培養 24 小時。最 後，每一個 well 以 2 ml 1×PBS 洗一次並加入 100ul SDS sample buffer
（2％SDS, 50mM DTT, 62.5mM Tris-HCl, pH6.8）萃取蛋白質，接著 將培養盤放在冰上以刮勺將細胞刮下吸至薄壁微量管，把薄壁微量管 置入乾浴器中以 95℃加熱 5 分鐘(此時原本黏稠的細胞萃取液會變的 不黏稠)。測量蛋白質濃度的步驟如下: 先將分光光度計電源打開暖機 30 分 鐘 ， 設 定 波 長 為 540nm 。 取 6 個 薄 壁 微 量 管 分 別 標 示 0,5,10,15,20,25 並個別加入二次水, Bradford, Bovine serum albumin (BSA)，如下表所示:
二次水 Bradford BSA 0 800 ul 200 ul 0 ul 5 750 ul 200 ul 50 ul 10 700 ul 200 ul 100 ul 15 650 ul 200 ul 150 ul 20 600 ul 200 ul 200 ul 25 550 ul 200 ul 250 ul
待反應 5 分鐘後，依 0~25 的次序分別放入分光光度計中測吸光值，
以製作 standard curve，其 R-squared 值在 0.980~0.999 之間。再取薄 壁微量管製作待測樣本：10ul sample＋200ul Bradford＋790ul 二次水，
同樣地等反應 5 分鐘後放入分光光度計中測吸光值，再以 standard curve 所求出的方程式換算出樣本蛋白質濃度。
接著製作 SDS-PAGE，配方如下：
下層膠 上層膠
ddH2O 9.5 ml 6.08 ml 1.5M Tris, pH8.8 5.0 ml
0.5M Tris, pH6.8 2.5 ml 10％ SDS 200 ul 100 ul
40％
Acrylamide/bis
5.0 ml 1.22 ml
10％ APS 100 ul 100 ul TEMED 20 ul 12 ul
待膠體完全硬後，靜置 30 分鐘，之後以 150V 預跑 30~60 分鐘，再 來將在 95℃中加熱 5 分鐘的變性樣本蛋白質及蛋白質分子量標誌劑 注入至電泳槽中，以 100V 進行電泳。然後將電泳膠體上的蛋白質以 90~100V 的電壓且在 4℃的環境下轉印一小時至 PVDF 轉漬膜上
（PVDF 轉漬膜使用前先用甲醇浸泡 1 分鐘，再泡入 transfer buffer）； 接著將轉漬膜泡入 5％低脂牛奶（5g 牛奶及 0.1ml Tween-20 溶於 100ml PBS）室溫下搖一小時；用 0.1％ PBST 緩衝液（ 1ml Tween-20
溶於 1L PBS）每 5 分鐘洗一次，共洗三次；將轉漬膜放入有一級抗 體的封口袋中在 4℃搖一夜（此實驗中所用的抗體有 PCNA 1:1000, RIP 1:1000, Caspase-3 1:1000, Bcl-2 1:500, Bad 1:500, PARP 1:500, Fas-ligand 1:1000, TRADD 1:250, p27 1:1000, p21 1:1000, p53 1:1000）
；同樣再以 0.1％ PBST 緩衝液每 5 分鐘洗一次，共洗三次，將轉漬 膜放入有二級抗體（peroxidase-conjugated anti-mouse IgG）的封口袋 中在室溫下搖一小時，以 0.1％ PBST 緩衝液每 5 分鐘洗一次，共洗 三次；在暗房中將轉漬膜和 ECL 呈色劑反應一分鐘，用感光底片紀 錄訊號；最後用柯達的分析墨漬軟體分析。
6. 評估丹參抽取物對 NFκB promoter轉殖至血管平滑肌細胞的表現 採用 Gibco 的 DMRIE-C 試劑（屬於微脂體）。將 3.5×105的平滑 肌細胞種至 6 well 培養盤的每一個 well，培養 15 小時。準備 12 管 薄壁微量管，6 管包含 4ul DMRIE-C＋500ul 無血清培養基，另外 6 管包含 1ug NF-κB promoter-Luciferase Construct＋500ul 無血清培養 基，將不同的二管混合作用 20~30 分鐘成 lipid-DNA 複合物。移去培 養盤中的培養基，加入剛才的 lipid-DNA 複合物培養 6 小時後移去，
再換成 10％ FBS 培養基繼續培養至隔天。接著給予丹參抽取物 Salvianolic acid B，給予劑量為 0.001mg/ml, 0.01mg/ml, 0.1 mg/ml，
postive control 為 15％ FBS 的培養基，培養 24 小時。萃取細胞的蛋
白質並以分光光度計定量出濃度（方法與西方墨漬法相同）。取 5ml 透明小管先加入 30ug 的蛋白質，再以 PBS 補體積至 20ul（置於冰 上），上冷光分析儀前才加入 50ul luciferase reagent（每一管加入 luciferase reagent 與上機的間隔時間盡量一致）來測定 luciferase 表現 量。
7. 利用 cell proliferation ELISA（BrdU）kit 來分析丹參及厚朴抽取 物對血管平滑肌細胞 DNA 合成的影響
本實驗是採用 Boehringer Mannheim 的 cell proliferation ELISA kit。首先，在 96 well 培養盤上的每一個 well 種 1×104的平滑肌細胞 並培養 15 小時。移去培養基後用 1×PBS 洗一遍，加入 0.5％ FBS 的 培養基，繼續培養 30 小時。移去培養基後開始給藥：postive control 為 15％ FBS 的培養基，negative control 為 0.5％ FBS 的培養基，丹 參抽取物 Salvianolic acid B 給予劑量為 0.001mg/ml, 0.01mg/ml, 0.1 mg/ml，厚朴抽取物 Magnolol給予劑量為 0.001mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.05 mg/ml（每一個 well 均含有 100ul 培養基），培養 20 小時後，接著加 入 10ul/well 的 BrdU（10uM）再培養 4 小時。移去培養基後加入 200ul/well FixDenat，在室溫下靜置 30 分鐘。移去 FixDenat 後加入 100 ul/well anti-BrdU-POD ， 在 室 溫 下 靜 置 90 分 鐘 。 移 去
anti-BrdU-POD 後用 200 ul/well 的洗滌液洗 3 次。最後加入 100 ul/well substrate 後每隔 3 秒加入 25ul/well 1M H2SO4。將培養盤放在酵素免 疫分析測讀儀上以 450nm 的波長判讀。
8. 利用測量 Malondialdehyde（MDA）來評估丹參及厚朴抽取物對 血管大鼠血清的抗氧化能力
用 23 號針從大鼠尾動脈抽取約 3ml 血液，以 13000rpm 離心 15 分鐘將血清分離出。控制組取 15ul 的二次水＋10ul 血清＋10ul 10 mM CuSO4（總體積為 50ul，「Cu2＋」＝2~3 mM）；實驗組則加 10ul 的丹 參抽取物 Salvianolic acid B 最終濃度為 0.001mg/ml, 0.01mg/ml, 0.1 mg/ml，厚朴抽取物 Magnolol最終濃度為 0.001mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.05 mg/ml，再加入 5ul 二次水和 10ul 血清以及 10ul 10 mM CuSO4。將樣 本充分混合後放入 37℃的水浴恆溫槽中 4 小時；加入 350ul 20％
TCA，混合；接著加入 350ul 0.67％ TBA（溶於 0.05N NaOH），混合；
將樣本放入 69℃的水浴恆溫槽中 30 分鐘，最後以 10000 rpm 離心 2.5 分鐘。每個樣本取 200ul 上清液加到 96 well 培養盤中，將培養盤放 在酵素免疫分析測讀儀上以 540nm 的波長判讀。
9. 氣球擴張破壞大白鼠總頸動脈血管的實驗模式
本實驗模式是用 350~450g 品系為 SD 的大白鼠（購自國科會）
來做氣球擴張術。先由腹腔注射 3.6％ chloral hydrate（1ml/100g）麻 醉大白鼠，將大白鼠腹面朝上並用麻繩綁住四肢將大白鼠固定在解剖 板上，頭部套上裝有乙醚的 50c.c.離心管維持麻醉，擦拭少許優碘在 大白鼠頸部，用大剪刀沿大白鼠頸部中間將其胸部到下顎的皮剪開，
用鑷子將大白鼠頸部左側皮膜及一些結締組織剝離乾淨即可見左總 頸動脈，將總頸動脈及內頸動脈和外頸動脈所在位置的結締組織剝離 乾淨之後，將外頸動脈用縫線綁死結（距總頸動脈及內、外頸動脈交 會處往頭部方向約 1.5 公分），將內頸動脈用縫線綁活結（距總頸動 脈及內、外頸動脈交會處約 0.5 公分），用縫線繞過總頸動脈並用止 血鉗夾住縫線以斷絕血流（距總頸動脈及內、外頸動脈交會處往尾部 方向約 5 公分），用眼剪將外頸動脈剪個小洞（距綁死結處約 0.2 公 分）並稍微放血以確定有剪破血管，將 Forgaty 2F 導管自上述的小洞 插入並往總頸動脈處平推約 3 公分，打入約 1.3~1.5 大氣壓的氣體使 氣球撐大，然後來回三次破壞總頸動脈的血管壁，最後將氣球導管洩 氣並抽出，用 1ml 注射筒前接細軟管打入 heparin，在小洞與三叉處 中間綁死結，鬆開總頸動脈與內頸動脈的縫線，I.M 給予 Ampicillin，
將頸部剪開部分以縫線縫合回去，滴少許優碘後將大白鼠放回籠中待 其甦醒即完成。
10. 統計方法
10. 統計方法