2.2.1 大腸桿菌勝任細胞（Competent cell）的製備
首先取 Escherichia coli C41（DE3）與 C43（DE3）之單一菌落培養於
2.2.2 大腸桿菌轉形作用（transformation）
將儲存於-80 ℃的勝任細胞取出置於冰上解凍後，加入0.1～1 μg的質 體DNA充分混合，置於冰上25分鐘，再置於42 ℃水浴中進行熱休克（heat shock）1分鐘，之後加入 500 μl 的LB培養液於37 ℃震盪培養（160 rpm/min） 1小時，取100 μl 的菌液均勻塗布於含Ampicillin（50 μg/ml）
之LB培養基上，置於37 ℃恆溫箱中培養12～16小時。
2.2.3 建構質體 DNA
將所設計的引子（Primers）經由聚合酶連鎖反應（PCR , Polymerase Chain Reaction），透過每個引子 Tm 值的不同條件設計反應溫度，將欲得到 的 DNA 片 段 合 成 出 來 ， 而 DV3-NS2B 與 DV3-NS4A 的 模 板 基 因
（pcDNA3/DV3/1029-10696/fix5 ） 因 含 有 deletion 的 現 象 ， 因 此 利 用 Site-Directed Mutagenesis Kit 修補 deletion 的部分【附錄 1】，反應完成後利 用洋菜膠電泳確認PCR 產物片段大小是否正確，之後利用 PCR Clean- up Kit (PREMIER)純化 DNA 以去除酵素及鹽類。
經 Clean-up 且確認 DNA 大小無誤之 PCR 產物，使用 pGEM-T Vector Systems（Promega）進行 TA cloning 【附錄 2, 附錄 3】，使PCR 產物與 pGEM-T Vector 接合（Ligation），以利於限制酵素作用，可用來進一步確認 PCR 產 物並加以保存。
2.2.4 小量質體 DNA 萃取
使用ExcelPureTM Plasmid Miniprep Purification Kit（PREMIER）抽取 並純化 E. coli 之質體 DNA。操作流程如下：將大腸桿菌接種於 5 ml 的
於-20 ℃。【附錄 4】
酵素切割後，視需要以Gel Extraction Kit（PREMIER）或 PCR Clean-up Kit
（PREMIER）回收 DNA 並去除限制酵素及鹽類。【附錄 5】
2.2.6 萃取洋菜膠內之 DNA 片段
使用Gel Extraction Kit（PREMIER）萃取出洋菜膠內之 DNA 片段。
操作流程如下：將切下之洋菜膠 (約 50-200 mg)，置於微量離心管內，加 入500 μl Binding Solution，60 ℃加熱至完全溶解後，將混合液移至 Gel- MTM Column，以室溫 16100 ×g 離心 1 分鐘，倒掉收集管內液體，加入 700
將質體轉形於大腸桿菌 BL21(DE3) 或 NovaBlue(DE3)，隔天挑單一 菌落於含有Ampicillin（50 μg/ml）或 Kanamycin（50 μg/ml）之 LB 培養 液中於37 ℃培養箱震盪培養，隔夜後，取 1/100 之菌液轉養於 5 ml 的 LB 培養液中並於37 ℃培養箱震盪培養，至 OD 介於 0.6 到 0.8 之間時，
加入0.5 mM isopropyl-β-D- thiogalactoside（IPTG）誘導基因表現四小時。 體積之2X SDS-PAGE loading dye（含 200 mM β-mercaptoethanol, 200mM DTT 及 8M Urea）混合均勻，於室溫放置 30 分鐘以上後儲存於-20 ℃備 用。
2.2.9 以 SDS-PAGE 分析並以 Coomassie blue staining 及西方轉漬分析 (Western blot analysis)偵測蛋白質表現
2.2.9.1 SDS-PAGE 電泳
首先配製下層 14 % resolving gel，室溫靜置約 1 小時，膠凝後再配製上 層4% stacking gel，室溫靜置約 30 分鐘，待膠凝後移至 Mini-Protein 電泳槽
（Bio- Rad），加入 1X SDS-PAGE running buffer，接著將樣品以微量吸管置 入膠體之孔洞中，先以120 伏特跑膠直到樣品通過 stacking gel 成一直線後，
且以100 伏特電泳 2 小時直到適當位置。
2.2.9.2 Coomassie blue staining
將SDS-PAGE 膠體直接浸泡於 0.25 % Coomassie blue staining solution
30 分鐘，再以 Destain solution （30 % methanol，10 % acetic acid）褪染 膠體直到結果顯現後，以清水潤洗膠體，並取玻璃紙封膠並封乾保存。
2.2.9.3 西方轉漬分析(Western blot analysis)
SDS-PAGE 膠 體 電 泳 完 成 後 ， 利 用 半 乾 式 （ semi-dry ） 轉 漬 槽 TRANS-BLOT® SD CELL 221BR（Bio-Rad）轉漬膠體上的蛋白質至硝基 纖維膜上（nitrocellulose membrane, PROTRAN, Schleicher& Schuell），以 0.09 安培進行 37 分鐘，之後把膜置入 20 ml Blocking buffer （5 % milk in 1X TBS buffer）於室溫下平面震盪 1 小時後，加入稀釋 1/1000 倍的之 6xHis 單株抗體（BD Bioscience）、HA-probe（F-7）HRP 抗體（Santa Cruz Biotechnology ） 或 NS1-monoclonal antibodies （ NS1-Mabs, abcan ） 於 Blocking buffer 中於室溫下平面震盪 1 小時以偵測有 HA-His 標誌的複合 蛋白，之後再以20 ml 之 1X TBST buffer 於室溫下平面震盪清洗 5 分鐘 3 次，（使用6xHis 單株抗體於 1X TBST buffer 清洗後加入稀釋 1/9000 倍之 Goat anti-mouse HRP（PIERCE），再以20 ml 之 1X TBST buffer 於室溫下 平面震盪清洗5 分鐘 3 次），最後將500 μl 之 HRP substrate (MILLIPORE)
均勻地加到硝基纖維膜上約 5 分鐘，在暗房內以 X 光底片進行壓片，取
出底片沖洗顯像。用夾子將底片浸入顯影液（Developer solution）中搖晃
約30 秒後，將底片換到清水中漂洗底片至底片中影像顯現完成，接著將
底片浸入定影液（Fixer solution）中約 1 分鐘直到底片定影完成，以水清 洗底片後晾乾保存。
參、結果