第二章 加工前處理條件對紅豆中γ-胺基丁酸含量之影響
三、 實驗方法
（一） 紅豆前處理
紅豆以目視法去除破碎顆粒後，以自來水清洗3次，瀝乾，置於玻璃瓶 並 加 蓋 ， 添 加 5 倍 自 來 水 (w/w) 分 別 於 4 ℃ 、 25 ℃ 及 37 ℃ 浸 泡 2、4、8、12、24、30、36、48及60小時，並定時取樣分析紅豆之水分含量、生 菌數、花青素含量、GABA含量、GAD活性及浸泡液pH值，篩選提升紅豆 GABA含量之最適浸泡條件。
（二） 紅豆之冷凍解凍處理
參考Kwon等(2007)之方法並改變冷凍及解凍溫度，將經過最適浸泡條 件處理過之紅豆，瀝乾水份後放入PE袋密封(液態氮處理組放於紗袋中)，分 別置於 -4℃、 -20℃冰箱及液態氮中進行冷凍12、24、48小時，再於室溫下 解凍0、12、24小時，取樣分析紅豆之GABA含量及GAD活性，篩選可增加 紅豆GABA含量之最適冷凍、解凍條件。
（三） 紅豆生菌數測定
依CNS 10890號食品微生物之檢驗法-生菌數之檢驗。取浸泡後之紅豆 25 g，於無菌操作台中加入含 225g已滅菌 0.1％peptone稀釋液的均質瓶 中，以均質機攪拌2分鐘，成為10倍稀釋液，將稀釋液進行連續稀釋後，以 倒皿培養法將溶解並降溫之plate count agar與檢體液混合均勻，待培養基凝 固後於37℃培養2天，記錄其菌數。
（四） 紅豆花青素測定(Padmavati et al., 1997)
待測紅豆樣品先經冷凍乾燥，取0.5 g凍燥之紅豆粉末，加入 1％
HCl/methanol(MeOH)，於暗室下萃取60分鐘，再經 12000 g 轉速離心 15分 鐘，以分光光度計測定在 530 nm及 657 nm之吸光值，除以吸光係數ε= 31.6 nM-1cm-1，計算花青素含量。
花青素含量(μmole/g)＝(A530- 0.33×A657) ÷ 31.6 × MeOH毫升數 ÷ 重量(g)
（五） 紅豆總酚含量測定定(Wu et al., 2012)
凍乾紅豆粉末與 50％ ethanol以1：10比例混合，於4℃下攪拌60分 鐘，以12000 g轉速離心15分鐘，取上清液經0.45μm濾膜過濾，即為紅豆濾
液。
紅豆濾液5ml與Folin-Ciocalteu reagent 5ml 振盪混合後，靜置3分鐘，加 入 10% Na2CO3 5ml，間歇混合1小時，以分光光度計檢測 735nm之吸光 值，以gallic acid作為標準曲線，換算每公克紅豆(乾重)所含沒食子酸(gallic acid)毫克數。
（六） 紅豆GABA含量測定(陳，2006)
1. 樣品製備：浸泡後之紅豆樣品瀝乾後，進行冷凍乾燥並以咖啡磨豆機磨成 粉狀，取 1g紅豆凍乾粉加10倍(w/w)的70％乙醇於4℃下萃取1天、2小時及 1小時後，於4℃離心30分鐘，合併收集三次萃取所得上清液，經滅壓濃縮 後製成10 ml分析樣品，保存於-20℃(Rozan et al., 2001)。
2. PITC衍生劑配製
衍生劑A：將TEA、methanol與去離子水以2：1：1(v/v)之比例於抽氣櫃中混 合均勻，置於-20℃貯存備用。
衍生劑B：PITC、去離子水、TEA與methanol以 1：1：1：7(v/v)比例於抽氣 櫃中混合均勻，置於-20℃貯備用。
3. 取20μl樣品液進行真空乾燥，加入衍生劑A 20μl 混合均勻後立即真空乾 燥，以去除衍生劑。
4. 繼續加入30μl衍生劑B於室溫下作用20分鐘，真空乾燥，去除衍生劑。
5. 衍生後之樣品溶於 200μl動相( 0.1M ammonium acetate)中，以 0.22μm濾 膜過濾後進行HPLC分析。
6. 分析條件(Kuo et al., 2004)
動相A：0.1 M ammonium acetate。
動相B：0.1 M ammonium acetate、acetonitrile與methanol以44：46：10(v/v)比 例於抽氣櫃中混合均勻。
動相A及B混合後以glacial acetic acid調整pH值至6.5。
移動相梯度：動相A 100％-0％，動相B 0％-100％。
動相流速：1.0 ml/min。
分析時間：50分鐘。
檢測器波長：UV 254 nm。
7. 取0、5、10、15、20、25、30、35μl濃度為 0.2 mg/mL的GABA標準品進行 衍生化並以上述條件分析，並依積分面積作成標準曲線(R2＝0.9953)。將樣 品液分析後之積分面積以標準曲線回推計算出樣品中的GABA含量。
（七） 紅豆GAD活性測定
將浸泡後之紅豆瀝乾，並以乾淨毛巾拭乾表面，取 1 公克紅豆先以研缽 粗磨後，再添加 5ml potassium phosphate buffer ( 1/15 M, pH5.8, 含有 2 mM β-ercaptoethanol，2mM EDTA 及 0.2mM PLP) 於冰浴中充份均質，均質物以 12000 g 離心 30 min，可得粗麩胺酸脫羧酶萃取液。取 2 ml 粗酵素液加 1 ml 基質( 1％ glutamate，pH 5.8)，於 40℃反應 2 小時，再置於沸水浴中反應 5 分鐘使酵素失活，經 0.45 μl 濾膜過濾，經 PITC 衍生以 HPLC 分析 GABA 含量，換算為酵素活性單位 U，其定義為在 40℃下每小時可產生 1 μmol GABA 之活性(Zhang et al., 2007)。
（八） 紅豆組成分分析：將紅豆冷凍乾燥後，以磨豆機磨成粉狀，進行組成份分析。
1. 水份：以AOAC(1993)分析方法測定。
精秤1.0000 g紅豆置入已秤重且事先乾燥達恆重之坩鍋中，再將坩鍋加 蓋放入烘箱以 105 ℃乾燥 24 小時。取出坩鍋置於乾燥皿中，待溫度降至 室溫秤其重量，直到恆重為止，此時減去的重量即為水分含量。
水分(%) = 100 × (W1 - W2) / (W1 - W0) W0：坩鍋恆重(克)
W1：坩鍋 + 樣品重量(克) W2：W1 乾燥至恆重的重量(克)
2. 粗脂肪含量：依AOAC(1993)分析方法測定。
將圓底燒瓶置於烘箱中，經 105 ℃ 烘乾後恆重，秤其重量(X1)，取適 量樣品(重量：S)放入圓筒濾紙內，加一層薄脫脂棉，放入98℃烘箱2~3小 時，除去水份，將圓筒濾紙放入萃取器中，加入約200 ml之乙醚，於60℃熱 水浴中迴流萃取16小時，取下冷凝管，將圓底燒瓶於於98℃烘箱烘乾至恆 重X2。
粗脂肪(g/100g)＝[(X2－X1) / S ] × 100 3. 粗蛋白質：依AOAC(1993)分析方法測定。
取適量樣品於分解瓶中，加入 2 g K2SO4、40 mg CuSO4 及 2 ml H2SO4，加入沸石加熱分解，直至分解液為無色澄清，繼續加熱1小時，取 出冷卻，在未產生沈澱以前，再加入少量蒸餾水混合均勻後進行蒸餾，分解 中加入飽和 NaOH混合液，接受器中加入5 ml H3BO3飽和溶液，以水蒸氣 蒸出氨收集於 H3BO3和溶液中，用已標定之 0.02 N HCl溶液滴定。以不添 加樣品之滴定值作為空白樣品(blank)。
粗蛋白 (g / 100g)＝[( HCl (sample) 滴定ml數－HCl (Blank) 滴定ml數]× F
× 0.00028 × 6.25 / 樣品重(g) ] × 100 F：0.2 N HCl溶液的力價
0.00028：相當於1 ml 0.02 N HCl可滴定之氮量(g) 6.25：含氮係數
4. 灰分含量：依AOAC(1993)分析方法測定。
坩鍋與上蓋洗淨後置於 105℃ 烘箱中烘乾，取出置於乾燥皿內冷卻並 秤重量為 X1，精秤紅豆 1g於坩鍋中秤重為X2，置於灰化爐中，於550℃灰 化至樣品成白色或灰白色粉末狀(約需8小時，若灰化不完全，則先取出坩鍋 冷卻，加少許蒸餾水潤濕，再繼續灰化至完全)。灰化完全後，使其溫度下 降至 100~200℃左右，取出坩鍋，置乾燥器內冷卻，並秤重(X3)。
灰分(g/100 g)＝[ (X3－X1) / (X2－X1) ] × 100 5. 膳食纖維含量：依AOAC(1993)分析方法測定。
精稱 1.000 ± 0.005 g 樣品，加入fibre assay kit(Megazyme Inc.)套組所 附之 MES-TRIS 緩衝液40 mL，再加入 heat-stable a-amylase 50μl攪拌，蓋 上鋁箔後置於 95-100℃水浴震盪 35分鐘。取出冷卻至 60℃，加入 protease 100μl， 於60℃水浴震盪 30分鐘後，加入 5 mL 0.561N HCl 攪拌，並以 NaOH或HCl調整pH 值至4.1~4.8，最後加入 200μl amyloglucosidase 於樣 品中並低速攪拌，再次放入 60℃水浴震盪 30 分鐘，經過抽氣過濾後得到 濾液及濾渣。
(1) 非水溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber, IDF)：以預灰化及秤重過裝有 矽澡土之坩堝接收濾渣，經95% 乙醇及丙酮清洗濾渣，並於103℃烘箱 烘乾、冷却、秤重，另測定濾渣中粗蛋白質及灰分含量，將前述濾渣重
量扣除粗蛋白質及灰分含量，為非水溶性膳食纖維含量。
(2) 水溶性膳食纖維(soluble dietary fiber, SDF)：濾液部分加入4倍濾液重量 之 95％乙醇 (60℃)，靜置1小時沈降可性膳食纖維，過濾，以 78％乙 醇、 95％乙醇、丙酮淋洗後，於103℃烘箱烘乾、冷却、秤重，另扣除 其粗蛋白質及灰分含量，為水溶性膳食纖維含量。
(3) 將非水溶性膳食纖維含量(insoluble dietary fiber, IDF)加上水溶性膳食纖 維含量(soluble dietary fiber, SDF)即為總膳食纖維含量。
6. 總碳水化合物含量：
總碳水化合物（％）= 100 - 粗脂肪(g/100g）- 粗蛋白(g/100g )-總膳食纖維 含量 (g/100g) - 灰分(g/100g)
（九） 統計分析
各試驗均重複三次，所得之數據以平均值與標準偏差表示，使用SAS套 裝軟體(Statistical Analysis System 9.4版, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)進 行統計分析，並以鄧肯氏多變域測驗法(Duncan’s new multiple range test)進 行各試驗組之平均差異顯著分析，當p＜0.05時表示各試驗組間具顯著差異。