第一章 文獻回顧
四、 提高天然食物中γ-胺基丁酸之方法
榖物、蔬菜、水果、菇和海藻等天然食物中均含有 GABA，其中以榖物中米胚 芽、大麥芽和大豆芽中含量較高，分別為 389 nmol/g、 326 nmol/g 和 302 nmol/g，在 蔬菜中以菠菜 GABA 含量最高，有 414 nmol/g，栗子中的 GABA 含量為 188 nmol/g(操等，2008)，經過換算，這些天然食物之 GABA 含量在 0.019~0.042 mg/g 間，以日常攝取量而言，與達到生理功效之需要量相去甚遠。在天然食物中有效強 化 GABA 的方法，包括利用外在條件改變對植物組織進行刺激，在麩胺酸脫羧酶 (GAD)作用下，代謝麩胺酸生成 GABA，或利用微生物發酵進行生物轉換，分述如 下：
（一） 壓力刺激
研究發現，酸化、機械傷害、冷衝擊、缺氧、加熱等壓力條件，均可刺激植物 中 GABA 的累積(表 1.5.)，在正常情況下，植物體中 GABA 含量約為 0.03~0.2 μmol/g，當植物受到壓力刺激時，GABA 含量可提高 1.3~100 倍(Kinnersley and Turano, 2000)。
在植物中，pH 調節有助於 GABA 的累積，在適當 pH 值條件下，麩胺酸脫羧 酶(GAD)藉由細胞質中氫離子或鈣離子的增加而被活化(Diana et al., 2014)，酸性環 境可有助 GABA 的累積，在植物系統中 GAD 活性在 pH 5.8 可達最高(Kinnersley and Turano, 2000)；以丁酸處理蘆筍葉肉細胞，降低細胞質 pH 值，在 15 秒內可使 GABA 含量提高 2~3 倍，若將環境中 pH 值提高，除了使麩胺酸脫羧酶活性下降 外 ， 亦 有 利 於 GABA-T( 最 適 pH 值 8.9) 進 行 轉 胺 作 用 而 將 GABA 代 謝 成 SSA(Crawford et al., 1994)。
17 表 1.5. 植物中 GABA 累積之壓力相關動力學
Table 1.5. Stress-related kinetics of GABA accumulation in plants
a For each stress the time to reach the greatest reported GABA accumulation relative to unstressed controls has been shown.
Plant Stress GABA ％ of controla Time Ref
Asparagus cells Cold (10°C) 200 15 min Cholewa et al., 1997
Sesame Heat (50℃) 21 2 h Bor et al., 2009
Shoots of Arabidopsis thaliana Salt 1400 4 d Renault et al., 2010
Foxtail Millet Salt 141 48 h Bai et al., 2013
Asparagus cells Acidosis 300 15 s Crawford et al., 1994
Wheat Anoxia 120 2 h Youn et al., 2011
Rice bran byproduct Anoxia 1700 5 h Kim et al., 2015
Soybean Anoxia, cold (-18℃) 1420 42 h Yang et al., 2015
Tartary buckwheat Anoxia 210 2 d Guo et al., 2016
Soybean leaves Mechanical damage 1800 1 min Ramputh and Bown, 1996
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植物受到機械刺激時，細胞物質被破壞，使得細胞內鈣離子及氫離子濃度增 加，在短時間內刺激麩胺酸脫羧酶活性，並可使 GABA 含量急遽提高 18~27 倍 (Ramputh and Bown, 1996; Wallace et al., 1984)。
低溫環境亦有利於 GABA 的蓄積，天門冬的葉肉細胞在環境溫度由 20℃下降 至 1℃時，GABA 含量自 2.7 nmol/106 cell 提高至 5.6 nmol/106 cell，增加 2 倍以上 (Cholewa et al., 1997)；大豆浸泡後去除多餘水分，再經過-4℃、-20℃及-32℃冷凍 及 30℃解凍，其 GABA 含量與完全未處理之對照組相比，可增加 27.3 倍，隨冷凍 溫度降低及解凍時間增加，GABA 含量相對提高，乾燥後之 GABA 大豆可用來製 備豆奶、醬油、豆腐、豆渣、酸奶等機能性食品(Kwon et al., 2007)。發芽的大豆種 子於-18℃冷凍 12 小時，放置於密封的聚乙烯袋，再解凍 6 小時，可使 GABA 含 量提高 7.21 倍，冷凍、解凍的過程，加速基質催化作用，而促進 GABA 累積(Yang et al., 2015)。
缺氧條件下因植物粒線體氧化磷酸化作用減弱，還原電位增高，而使得 SSADH 催化 SSA 的反應減少，利於 GABA 累積(顧與蔣，2002)，將芥藍菜置於充氮的乙 烯袋中 12 小時，GABA 含量可提高約 3 倍(Hattori et al., 2001)。環境溫度提高有利 於 GABA 生成並可加快其生產速率，以佳葉龍茶而言，處理溫度控制在 30~40℃
經 4~6 小時即可使 GABA 達到最高產量，而溫度愈低，其反應時間要拉長才能顯 著增加 GABA 的含量(區，2002)。
植物種子在浸泡過程，環境中水份含量提高，有助活化其細胞質中 Glutamate decarboxylase 活性，提升 GABA 含量(Shelp et al., 1999)；大豆添加 10 倍水於 10~40
℃浸泡，可提高 GABA 含量，尤其於 40℃浸泡 8 小時後可使大豆 GABA 含量由 70 μg/g 提高至 768.1 μg/g，增加 10 倍以上，若再延長浸泡時間，GABA 含量 並不會隨浸泡時間延長呈比例增加(Kwon et al., 2007)。種子浸泡同時也會啟動種 子發芽，經過一連串的生化反應，將大分子分解並經由呼吸作用釋放能量，以進 行生長所需的各種代謝，當能量大量被消耗，澱粉、蛋白質、脂質等大分子會被 分解，而蛋白質被活化的酵素水解後會產生大量胺基酸，其中包括麩胺酸(操 等，2008)，由於提高了 GABA shunt 基質濃度而促進 GABA 生成。豌豆、扁豆及 四季豆經過發芽處理 6 天，可使 GABA 由無提高至 1.04 mg/g、0.32 mg/g、0.44 mg/g，發芽過程中是否避光對於 GABA 的產量未有顯著影響(Kuo et al., 2004)；不
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同品種的扁豆經過發芽 5 天，GABA 含量亦可提高至 2 倍(Rozan et al., 2001)；西 瓜子、南瓜子、絲瓜子、葵瓜子、冬瓜子及糙米在經過發芽 0-3 天後，GABA 含 量可以提高 2.5~50 倍(表 1.6.) (傅，2005)。
在壓力刺激植物累積 GABA 過程中，適當的添加物有助提高 GABA 產量；添 加鈣離子(Ca2+)在植物體中可與鈣受體蛋白(Calmodulin, CaM)結合，刺激 CAD 活 性而提高 GABA 的含量(Kinnersley and Turano, 2000)，於米胚芽磷酸緩衝液中，添 加氯化鈣，當添加之鈣離子濃度與麩胺酸濃度比達到 20 mmol/mol 時，可使 GABA 產量提高 30％(張等，2004)。麩胺酸是合成 GABA 的主要原料，當麩胺酸濃度增 加，便提高了 GAD 作用的基質濃度，刺激 GAD 活性，有助於將麩胺酸催化為 GABA(Kinnersley and Turano, 2000)。芥藍菜葉浸泡於含 3％的麩胺酸水溶液中 4 小 時，可使 GABA 增加約 8 倍(Hattori et al., 2001)，小米發芽過程中添加 1.5 mg/mL 麩胺酸、2.5 mM 氯化鈣或 50μM Pyridoxal-5-phosphate (PLP)，均可使 GABA 產 量顯著提高，以反應曲面法計算，添加 1.2 mg/mL 麩胺酸、50μM PLP 及 2.5 mM 氯化鈣，可使 GABA 含量提高至 42.9 mg/100g (Bai et al., 2009)。
(二) 微生物轉換
細菌、酵母和黴菌等微生物均具有生成 GABA 的能力，微生物中 GAD 的活 性與 GABA 形成速率及耐酸(H+)機制有關，微生物轉換 GABA 主要有二條路徑，(1) 在培養基中加入麩胺酸，透過微生物發酵生產 GABA；(2)透過微生物酵素或細胞 轉化麩胺酸生成 GABA(梁等，2013)。學者利用基因工程開發 Escherichia coli GADK 10 細胞，具有高 GAD 活性，可自麩胺酸中大量生產純度高達 99％的 GABA，1 公 克的乾菌體細胞可製造 23~25 公克的 GABA (Plokhov et al., 2000)。Aspergillus oryzae 亦具有高 GAD 活性，於含有麩胺酸的培養基中進行液態培養可之快速生產 GABA，其生產速率為 0.9g/g Aspergillus mycelium/hr (Tsuchiya et al., 2002)。利用 大腸桿菌生產 GABA 純度雖高，但對於人體食用上有安全性上之疑慮，以 Aspergillus oryzae 生產 GABA，必需經過透析分離才能得到純度高之終產品，增加 了加工製造上的不便，在食品應用上仍有其限制。為了突破微生物轉換法提高食品 GABA 含量的限制，近期研究透過習用於食品發酵、安全性較高的菌種來提高天 然食物中 GABA 含量；大豆接種 Rhizopus microsporus var. oligosporus 並在厭氧條 件下培養製成天貝(Tempeh)，可提高產品 GABA 含量，與一般傳統發酵製天貝
20 表 1.6. 不同種子在經過 0-4 天發芽後 GABA 的含量
Table 1.6. The GABA content of various seeds after germination 0-4 days 發芽時間
(天)
GABA(mg/100g dry material)
西瓜子 南瓜子 絲瓜子 葵瓜子 冬瓜子 橘子籽 檸檬籽 糙米
0 3.2 2.3 0 3.4 0 0 0 6.5
1 56.3 11.2 3.4 18.9 2.3 6.7 3.4 16.7
2 104.0 24.5 4.4 31.2 4.2 22.8 18.3
3 165.3 34.5 6.5 56.7 5.1 45.6 32.3
(傅，2005)
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相比，其 GABA 含量可增加 3 倍(Aoki et al., 2003)；接種黴菌發酵之豆豉亦含有較 高含量的 GABA，約.0.10 mg/g ~ 3.45 mg/g，主要是由於大豆中所含麩胺酸經過微 生物發酵作用轉換為 GABA(蔣等，2007)。由於天貝於國內食用並不普及，豆豉於 日常生活中食用量少，無法供應適量且足夠 GABA，開發可經常食用之富含 GABA 飲品應較符合消費者需求。
將蕃茄處理物調整糖度為 3~5％接種 Lb. breves IFO3345 在 25~42℃下培養 12~48 小時，可使 GABA 含量提高 3~5 倍，該蕃茄發酵物可作為健康食品直接飲 用(Monma and Hayakawa, 2007)。由泡菜中分離出 Lb. breves GABA100，接種於添 加 2％麩胺酸的黑覆盆莓果汁中發酵 12~15 天，可使 GABA 含量提高 10 倍以上，達 到 18.8~27.6 mg/mL(Kim et al., 2009)。蔬果汁添加 3％麩胺酸、1％檸酸鈉及 1.5％
酒粕，接種 Enterococcus avium 於 30℃發酵 48 小時，可使 GABA 由 33.3 mg/100ml 提高至 1070 mg/100ml (Sugiyama, 2007)。日本的蒸餾酒精飲料中含有許多游離麩 胺酸，經過 Lb. breves IFO-12005 發酵後可轉換為 GABA (Dhakal et al., 2012)。
近年 GABA 的優點漸被消費市場重視，需求量也大幅提高，全球 GABA 產品 每年產量約 6 達萬公噸(梁等，2013)，但各國對 GABA 能否直接添加於食品之規 定各不相同。美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，FDA)根據毒理學 實驗指出，食品中直接添加 GABA 是安全的，其允許使用範圍包括飲料、咖啡、茶 和口香糖等，但不允許添加於嬰兒食品、肉製品或含肉產品；歐洲食品安全局 (European Food Safety Authority，EFSA)允許在食物中直接添加 GABA，每日攝取 上限訂為 550 毫克，但要求業者以人體實驗佐證其宣稱之功能特性；中國大陸衛 生部規定，GABA 可添加於飲料、可可、巧克力及其飲料、糖果、焙烤食品和膨化 食 品 ， 但 嬰 兒 食 品 中 不 得 添 加 ( 梁 等 ， 2013) 。 我 國 衛 生 福 利 部 公 告
「glutathion、citicoline、GABA 及 rutin」皆尚未准許為食品原料或食品添加物，(衛 生福利部，2012)，故無法透過在製程中直接添加 GABA 以達到機能性訴求，採用 微生物轉換方式應為開發富含 GABA 之機能性食品較適合的方式。
調查發現，益生菌為 1997 至 2007 年間日本醫生針對兒童腸胃炎治療，使用 頻率最高的處方製劑，其使用率由 30.6％，增加至 63.3％，相對減少開立抗生素的 頻率(Kita et al., 2010)。日本在 1988 至 1998 年間，已開發 1,700 多種益生菌產 品，1999 年益生菌產品年營業額約 14 億美元，到了 2003 年增加到 19 億美元，歐
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洲市場 2006 年益生菌產品的年營業額約 15 億美元，約佔整個食品消費市場的 1％
(陳等，2016)。預估 2014 年至 2020 年全球益生菌市場年平均複合成長率(Compound annual growth rate, CAGR)將可達 7.4%，至 2020 年時其規模可達 960 億美元，其 中食品飲料市場的規模最大，另膳食補充劑及動物飼料亦將有顯著增長，消費者對 機能食品飲料的需求不斷增加(食品工業發展研究所，2016)。以紅豆為原料，經益 生菌發酵開發機能性飲品，將有助提高紅豆的利用價值。
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