發酵紅豆乳官能品評

將1％已活化之Lb. rhamnosus GG接種於添加1.44％ galactose、2.27％

glutamate 及 0.20％ pyridoxine之紅豆乳基質中，於37℃、5％CO2之厭氧培養 箱內培養36小時後取出，測量可滴定酸度含量，以75％蔗糖糖漿調整其糖酸 比為13、14、15、16、17，經均質後，冷藏使溫度降至4℃，進行喜好性品評 試驗，品評員包括臺灣大學食品科技研究所之學生及18歲以上之成人計25 名，以及經濟部智慧財產局滿18歲以上之職員計25名，共50名。每位品評員 需同時品評上述五種樣品，品評樣品更動時需用冷開水漱口，品評項目包括 色澤(color)、甜度(swewtness)、酸度(acidity)、香味(flavor)、質地(texture)及整 體喜好性(overall acceptance)等，採七分制品評法，7分表示最喜歡，1分表示 最不喜歡，將品評結果填寫於品評表(表3.4.)。

糖酸比＝可滴定酸度 ÷ 糖度（Brix^。） (十四) 發酵紅豆乳儲存試驗

將接種1％ Lb. rhamnosus GG 於37℃發酵36小時，並調整糖酸比為16之 發酵紅豆乳裝於玻璃瓶中，於7℃冷藏庫儲存15天，分別於第3、6、9、12及 第15天測定，評估冷藏儲存對發酵紅豆乳pH值、可滴定酸度、乳酸菌數、GABA 含量及GAD活性的影響。

(十五) 統計分析

各試驗均重複三次，所得之數據以平均值與標準偏差表示，使用SAS套 裝軟體(Statistical Analysis System 9.ed)進行統計分析，以鄧肯氏多變域測驗法 (Duncan’s new multiple range test)進行各試驗組之差異分析，當p＜0.05時表示 各試驗組間具顯著差異。

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參、 結果與討論

一、 篩選最適生產含 GABA 紅豆發酵乳之益生菌株

(一) 不同益生菌株發酵對紅豆乳pH值、可滴定酸及乳酸菌數之影響

红豆經過37℃浸泡8小時後，經磨漿、過濾、預糊化，再添加脫脂奶粉製 成紅豆乳基質，再分別接種12株商業製品中常見之益生菌，於37℃、5％ CO2

培養箱中發酵6-60小時，測得紅豆發酵乳之pH值、可滴定酸、乳酸菌數變化如 圖3.3.。

結果顯示，未發酵之紅豆乳基質pH值為6.30，經益生菌發酵6-36小時，紅 豆發酵乳pH值隨發酵時間增加而呈現直線下降趨勢，至發酵30小時後下降幅 度減緩，其中Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus與B. longum在發酵6-60小時間pH 值較其他乳酸菌顯著為低，經發酵60小時，pH值分別為3.40與3.44，接種其他 益生菌之紅豆乳經過發酵60小時後pH值分布在3.52~3.8間；Lb. rhamnosus GG 在 發 酵 第 6~18 小 時 pH 值 僅 由 6.27 下 降 至 6.00 ， 顯 著 高 於 所 有 處 理 組 (p ＜ 0.05)，於發酵第18小時後才開始明顯下降。

不同益生菌對紅豆乳發酵過程中可滴定酸之分析結果如圖3.4.，未經發酵 之紅豆乳可滴定酸含量為0.21％，接種乳酸菌發酵後於第6小時開始可滴定酸 含量顯著提高，於發酵第12~42小時間可滴定酸含量隨發酵時間增加而增多，其 中，接種B. longum與Lc. lactis Lab5之紅豆乳可滴定酸含量在發酵第24小時後即 顯著高於其他各組，直至發酵第60小時，可滴定酸合量分別達1.4％及1.3％，經 其他乳酸菌發酵60小時之紅豆乳可滴定酸含量分布在1.00％~1.26％間，且各組 所測得之pH值均無顯著差異；Lb. rhamnosus GG在發酵初期可滴定酸含量僅緩 慢增加，直至發酵第30小時後才顯著增加，經發酵60小時可滴定酸含量亦可達 1.24％。

在乳酸菌數的變化方面(圖3.5.)，接種益生菌之紅豆乳於發酵第6小時所測 得之乳酸菌數約為6.3~7.0 log cfu/ml，自發酵第6小時至第18小時乳酸菌數呈現 直線增加，除Lb. acidophilus外，其餘接種益生菌之處理組乳酸菌數於發酵第36 小時達到最高，約 9.5 log cfu/ml，經過發酵42小時，乳酸菌數開始緩慢下降；Lb.

acidophilus在發酵第24小時乳酸菌數即可達10.1 log cfu/ml，且直至發酵36小時 後才顯著下降；接種Lb. rhamnosus GG之紅豆乳在發酵第48及60小時乳酸菌數

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顯著高於其他各組(p＜0.05)，達 9 log cfu/ml。

大豆豆乳中接種5 × 10⁶ cfu/ml之益生菌，於37℃發酵，其中接種Lb.

rhamnosus GG之豆乳發酵9.5小時後，pH下降至4.5，可滴定酸亦以接種Lb.

rhamnosus GG的豆乳下降幅度最快，對照發酵過程中游離胺基酸含量的變 化，顯示豆奶中益生菌的生長取決於蛋白水解的能力，並導致胺基酸釋放，使 得pH值下降，可滴定酸增加 (Li et al., 2012)。牛乳中添加2~6％糯米或稉米的 全 榖 粉 ， 再 接 種 Str. salivarius subsp. thermophilus 與 Lb. delbrueckii subsp.

bulgaricus，經過發酵24小時，pH值由6.8下降至4.5，活菌數由6 log cfu/ml提高 至8 log cfu/ml (Bae et al., 2011)。紫米加5倍水磨漿經滅菌後接種Lb. casei、 Lb.

acidophilus E 、 Lb. casei 加 Lb. bulgaricus Lb 與 S. thermophilus 19987 、 Lb.

acidophilus E加Lb. bulgaricus Lb與S. thermophilus 19987、Lb. bulgaricus Lb與S.

thermophilus 19987，於37℃發酵48小時，pH 值約 3.78~3.90 之間，生長菌數 約為8.2~8.9 log cfu/ml，可滴定酸為0.21~0.28％(汪，2006)。經Monasus-發酵之 大 豆 萃 取 物 (MFSE) 添 加 於 豆 乳 中 ， 接 種 Lb. delbrueckii subsp. lactis 及 Lb.

plantarum，經發酵24小時後pH值下降至4.18，可滴定酸含量達1.09％，菌數達 10⁸cfu/ml，GABA含量亦增加至45.5 mg/100 g DW (Pyo and Song, 2009)；於日 本傳統發酵食品中篩選可促進GABA產生之乳酸菌Lb. brevis、Lb. plantarum及 Lb. paracasei於MRS中培養約40小時，pH值可降至最低，菌數在培養48小時達 到最高(Komatsuzaki et al., 2005)。本研究紅豆乳接種不同益生菌對pH、乳酸菌 數及可滴定酸的影響趨勢與前人研究相似，惟接種Lb. rhamnosus GG之紅豆乳 pH值及可滴定下降幅度較少，經過發酵36小時pH值才降至4.3，可滴定酸為0.87

％，乳酸菌數9.5 log cfu/ml。

(二) 不同益生菌株發酵對紅豆乳GABA含量及GAD活性之影響

接種不同益生菌株發酵對紅豆乳GABA含量之影響如表3.5.，紅豆乳基質 在未發酵前GABA含量約0.05 mg/mL，分別接種12株益生菌於37℃、5％CO2厭 氧環境發酵12小時後，除接種B.bifidum之紅豆乳外，接種其餘益生菌株均可使 紅豆乳GABA含量顯著提高(p＜0.05)，於發酵第36小時可使GABA含量達到最 高，將發酵時間延長卻使GABA含量降低。在所有益生菌中，接種Lb. rhamnosus GG 之 紅 豆 乳 在 發 酵 過 程 中 GABA 產 量 最 高 ， 明 顯 優 於 其 他 乳 酸 菌 (p ＜

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0.05)，經發酵36小時GABA含量可達0.44 mg/mL，與未經發酵之紅豆乳相 比，GABA含量提高約8倍，接種B. infantis發酵36小時之紅豆乳，GABA含量亦 可達0.38mg/mL，B. longum對GABA含量提升效果較差，發酵36小時GABA含 量僅提高至0.16 mg/mL，增加約3倍。

紅豆乳基質在未經發酵前所測得GAD活性非常低，只有約0.030 U/ml，經 分別接種12株益生菌於37℃、5％CO2厭氧環境發酵12小時後，除接種B. lactis Bb-12紅豆乳外，接種其餘益生菌株之紅豆乳GAD活性與未經發酵前相比均顯 著提高(p＜0.05)，經發酵36小時，可使GAD活性達到最高，而後隨發酵時間延 長，GAD活性逐漸下降(表3.6.)。在12株益生菌中，以接種Lb. rhamnosus GG之 發酵紅豆乳GAD活性顯著優於其他乳酸菌(p＜0.05)，於發酵第36小時可達 0.065U/ml，與未經發酵之紅豆乳相比，GAD活性約提高2倍，延長發酵時間至 48 小時，GAD 活性仍 有 0.061 U/ml ，在第 60 小時才降至 0.042 U/ml ；接種 B.bifidum、B. lactis Bb-12及Lb. acidophilus之紅豆乳於發酵期間GAD活性表現 最差，發酵36小時僅有0.046~0.049U/ml，經發酵60小時GAD活性已下降至約 0.028U/ml。

由馬奶酒(koumiss)中分離之Lb. helveticus接種至大豆乳發酵30小時，其pH 值下降至4.16，可滴定酸與菌數於發酵第18~30小時急速增加，而GABA含量在 第30小時達最高，約含170mg/100g DW GABA (Sun et al., 2009)；添加經Monasus 發酵得 到的 大豆 萃取 物於豆 乳中 ，接 種 Lb. delbrueckii subsp. lactis 及Lb.

plantarum經發酵 24 小 時，可使 GABA 含量 達 0.46 mg/g DW (Pyo and Song, 2009)。本研究中12株益生菌分別接種於紅豆乳基質於37℃發酵36小時可顯著 提高GABA含量與GAD活性，顯示益生菌發酵過程有助於活化GAD，並促進紅 豆乳中麩胺酸轉化為GABA。

研究顯示，Lc. lactis及E. coli培養過程中所產生之GABA對酸性pH環境具 有抗性(Castanie-Cornet et al., 1999; Sanders et al., 1998)；由於GAD產生GABA 過程中必需消耗H+離子，於酸性條件下可保持細胞質的pH值而促進細胞存 活，含有高含量GABA及GAD活性之乳製品可利用此抗酸能力，通過消化系統 並於小腸存活，發揮其益菌功效(Park and Oh, 2007; Sun et al., 2009)。本研究接 種Lb. rhamnosus GG之發酵紅豆乳於發酵36小時之GABA產量及GAD活性最

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高，對照pH值及有機酸的量測結果發現，其pH值在發酵第6~36小時均顯著高 於其他處理組(p＜0.05)，有機酸產量在發酵第12~36小時亦顯著低於其他處理 組(p＜0.05)，應與Lb. rhamnosus GG在發酵過程中產生大量GAD並消耗紅豆乳 中H+離子有關，且其發酵過程中乳酸菌數含量於36小時達到9.53 log cfu/ml，繼 續延長其發酵時間至60小時，乳酸菌數僅微幅下降至8.95 log cfu/ml，與接種其 他乳酸菌的紅豆乳相比，乳酸菌數存活率較高，顯示Lb. rhamnosus GG因產生 GABA，而能抵抗發酵過程中產生之酸性環境並維持細胞存活。儘管本研究所 使用之12株乳酸菌都具有提高紅豆乳GABA含量的能力，但以接種B.bifidum、B.

lactis Bb-12及Lb. acidophilus之紅豆乳在發酵期間GABA產量及GAD活性表現 較差。

統計結果顯示，接種Lb. rhamnosus GG之發酵紅豆乳於發酵36小時可 得到的GABA產量最高，故進一步調整紅豆乳基質添加之碳源、氮源及其他添 加物，接種Lb. rhamnosus GG於37℃、CO2培養箱中發酵36小時，以反應曲面 法探討可有效提高GABA產量之紅豆乳基質配方。

(三) 不同益生菌株發酵對紅豆乳花青素含量之影響

未經發酵之紅豆乳花青素含量為 0.68 μmole/g，接種不同益生菌發酵 6~12 小時，隨發酵時間拉長，花青素含量呈現上升趨勢，在 12 株益生菌中，接種 Lb. rhamnosus GG、Lb. delbrueckii subsp. bulgarics、B. breve 及 B. bifidum 之紅 豆乳於發酵第 30 小時，花青素含量可達 1.92~1.94 μmole/g，顯著高於接種其 他益生菌之紅豆發酵乳(p＜0.05)，較未發酵之紅豆乳增加近 2.9 倍，發酵時間 延長至 36 小時，其花青素含量會微幅增加，但與發酵 30 小時紅豆乳之花青素 含量相比，並無顯著差異(P＞0.05)，經過發酵 42 小時後紅豆發酵乳花青素含 量開始呈現下降趨勢(圖 3.6.)。紅豆乳分別接種不同益生菌，經過 37℃、60 小 時發酵後，花青素含量仍有 1.51~1.82 μmole/g，顯著高於未經發酵之紅豆乳(p

＜0.05)。

環境中的pH值是影響食品發酵重要的環境參數之一，其與微生物發酵過 程中植物化學物質的結構變化有關，許多研究顯示花青素在低pH值下較為穩 定(Hur et al., 2014)，紫甘薯蒸熟後與等比例水均質，加入10％的脫脂奶粉後滅 菌製成紫甘薯乳，花青素含量約為5 μmole/100 g，分別接種Lb. acidophilus、Lb.

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gasseri、Lb. delbrueckii subsp. lactis，於37℃發酵24小時後，花青素含量增加至 16.8~17.5 μmole/100 g，顯著高於未經發酵的紫甘薯乳(P＜0.01)，這是因為發 酵過程中有機酸含量增加，pH值降低，提供酸性及有利於花色素苷以flavylium

gasseri、Lb. delbrueckii subsp. lactis，於37℃發酵24小時後，花青素含量增加至 16.8~17.5 μmole/100 g，顯著高於未經發酵的紫甘薯乳(P＜0.01)，這是因為發 酵過程中有機酸含量增加，pH值降低，提供酸性及有利於花色素苷以flavylium