實驗方法

一、LTH1-116-1 ( cephalochromin ) 的配製

乃利用一種台灣產的真菌 Cosmospora vilior Strain # 89051501，進行 發酵技術大量增殖後抽提純化而得。發酵過程如下 : 先將取得的芽孢植 入 1 公升的 Erlenmeyer flasks 中，並在其中加入 10 g Bacto^TM Malt Extract ( Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA ) 和 500 毫升的 去離子水。整個發酵的過程將在 25 ~ 30 ºC 下持續進行 30 天。發酵收 成後的菌絲離心收集使用甲醇進行抽提，利用回收的甲醇反覆進行 3 次 抽提。甲醇抽提液最後進入真空濃縮至乾燥。接著，乾燥的殘餘物再用 甲醇溶解後使用 Sephadex LH - 20 column ( 3 cm i.d. × 65 cm ) 跑

HPLC，以甲醇當溶媒在流速 2.5 ml / min 下沖提。每一個區分物 ( 約 18 ml ) 均使用 EtOAc / acetic acid / H₂O ( 85 : 10 : 10, v/v/v ) 作為展開 液利用 TLC 檢查其成分，並用波長為 254 nm 的紫外光照射檢查具相 似呈色基團的化合物。最後分離純化出 LTH1-116-1 ( purity > 95 % )。此 化合物結構上屬於phenolic dimmer. Bis ( naphtha-γ-pyrone ) 衍生物。從 先前學者的研究報告指出，cephalochromin 是從 Cephalosporium sp.

( PRL 2070 ) 被分離純化出來，並因此命名為 cephalochromin[17-19]。其 分子式、結構式以及分子量圖示如 ( Fig. 1 )。

純化乾燥的藥品，精秤至小數點後兩位。將重量 ( gram ) 除以該藥 品的分子量 518，得到純化所得的莫耳數 ( mol )。再根據所得莫耳數以 適當體積的 DMSO 稀釋，調配成 20 mM 的 stock solution 後分裝置於 -20 °C 冰箱儲存備用。

二、細胞株培養

鼻咽癌細胞株 ( HONE-1，NPC-TW01 )，腸癌細胞株 ( HCT-116 )，

腎癌細胞株 ( A498 ) 皆培養在 MEM / EBSS medium 添加 10 % fetal calf serum 和 1 % penicillin-streptomycin-glutamine 中。血癌細胞株

( CCRE-CEM，Jurkat )，肺癌細胞株 ( NCI-H661 ) 培養在 RPMI medium 1640 添加 10 % fetal bovine serum 和 1 %

penicillin-streptomycin-glutamine 中。所有細胞株皆培養在 37 °C 飽和水 氣且含有 5 % CO₂ 的培養箱中。

(一)、培養液的配製

每配製 1 公升的 medium 分別需在 MEM / EBSS medium 和 RPMI medium 中添加 2.2 gm 和 2.0 gm 的 sodium bicarbonate。並 調整 pH 至 7.2。配製好的 medium solution 需以 0.2 μm 的

VacuCap^® 過濾分瓶後，室溫靜置 3 週後移入 4 °C 冰箱備用。

(二)、EDTA-trypsin 的配製

Component Weight

NaCl 8 gm

KCl 0.4 gm

Glucose 1 gm

NaHCO₃ 0.35 gm

Phenol red 0.005 gm

Trypsin 0.5 gm

EDTA 0.2 g

Dissolve in D₂-H₂0 to 1 L

pH 需調整至 7.2 ~ 7.3 之間。以 0.2 μm 的 VacuCap^® 過濾，

並置於 -20 °C 儲存備用。

(三)、PBS 的配製

Component Weight

NaCl 80 gm

KH2PO4 2.4 gm

Na₂HPO₄ 14.4 gm

KCl 2 gm

Dissolve in D₂-H₂O to 10 L

調整 pH 值至 7.4，分瓶後，使用高溫高壓滅菌鍋，40 分鐘滅 菌。待冷卻即可使用。

三、生長抑制試驗

在 96 孔盤中分別種入 100 μl 培養基中內含 HONE-1 ( 4,000 細胞 / 孔)，NPC-TW01 ( 2,500 細胞 / 孔)， CCRE-CEM ( 20,000 細胞 / 孔 )，Jurkat ( 20,000 細胞 / 孔) ，HCT-116 ( 4,000 細胞 / 孔 )，

NCI-H661 ( 4,000 細胞 / 孔 )，A498 ( 4,000 細胞 / 孔 )。37 °C 下培養 隔夜貼盤後，再加入50 μl 不同濃度之測試藥物的處理。待 72 h 後以 methylthiazoletetrazolium ( MTT ) 分析方法測定細胞活性。

MTT assay 是一種實驗室中常用的偵測目標細胞活性和增殖效果的 方法。在活的細胞粒腺體中，MTT 會被代謝還原成 formazan。Formazan 是一種藍紫色的不溶性物質。待欲檢測的時間點時，每個 well 中加入 15 μl MTT stock solution ( 5 mg / ml )，37 °C 培養 4 小時，讓細胞吸收 MTT 並在粒腺體中將之代謝還原，由於 formazan 是不溶性的物質，於 是 4 小時後再加入 75 μl MTT – lysis buffer，此緩衝液將會把不溶性 formazan 溶解並形成紫色的溶液。再經過 8 小時 37 °C 的培養後，以 ELISA reader 在 570 nm 的光源下測量吸光值。根據所測得吸光值扣除背景值 後，將欲分析的數值除以控制組的吸光值即可得知細胞活性的關係。

MTT - lysis buffer 的組成如下 :

Component Weight DMF

( dimethyl formamide ) 400 ml SDS

( sodium dodecyl sulfate ) 2.4 gm Dissolve in D2-H2O to 1 L

四、細胞凋亡分析方法 I - Annexin V / PI 染色分析法

細胞的偵測，本研究使用購自 BD Biosciences Pharmingen 的產品 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II。實驗的步驟根據廠商之使用 者手冊。在六孔盤中種約 1 X 10⁵ 的細胞。待檢查的時間點，收集所有 的細胞。先將 medium 及懸浮的細胞移至新的 5 ml 離心管中，以 PBS 清洗細胞 1 次。再將清洗後的 PBS transfer 到剛剛的離心管中，然後 以 1 ml EDTA-trypsin 處理，培養 37 °C 約 1 分鐘，使細胞懸浮並 transfer 收集到同一個離心管。在 4 °C 下離心 ( 200 X g ) 10 分鐘。傾 倒出上清液留下管底的細胞團塊。加入 100 μl 1 X binding buffer 使再次 懸浮，同時加入 5 μl FITC Annexin V and 5 μl 50 μg / ml propidium iodide。輕輕振搖，避光室溫中靜置 15 分鐘。再加入 400 μl 1 X binding buffer，一小時內以流式細胞儀分析。

五、細胞凋亡分析方法 II - Hoechst 33258 / Propidium Iodide 雙染法

六孔盤中先放入一片用酒精燈過火之無菌蓋玻片，種入少量的細 胞，37 °C 隔夜靜置貼壁後再視實驗設計加入藥品處理。待預定時間到 達時，先吸乾六孔盤中的培養基，加入2 ml propidium iodide 5 μg / ml，

37 ℃ 培養 1 小時。除去 propidium iodide 溶液，用 PBS 清洗一次，

吸乾。再以新鮮培養基配製的 Hoechest 33258 ( 20 μg / ml ) 的溶液 2 ml 加入培養皿中 37 °C 培養 15 分鐘。接著吸乾 Hoechest 33258 溶 液，並再以 PBS ( 2 ml ) 清洗一次，吸乾。最後以 4 % para-formadehyde ( 2 ml ) 在室溫下進行固定 30 分鐘。然後夾出蓋玻片置於載玻片之 上，蓋玻片周圍塗上指甲油風乾加以固定。然後再以螢光顯微鏡觀察之。

觀察propidium iodide 和 Hoechst 33258 染色時，所需的激發光各有 所不同。以propidium iodide 來說，要以綠光激發螢光，所放射的螢光 為紅光，波長為 620 nm。而對 Hoechst 33258 而言，要以 UV 紫外光來 激發，所放射的螢光為藍光，波長為 510 ~ 540 nm。

六、細胞週期分析

我們實驗所用的鼻咽癌細胞株皆為貼壁細胞，因此要進行細胞週期 分析前要收集所有的細胞，先用 2 ml PBS 清洗細胞。再加入 1 ml EDTA-trypsin，搖晃培養皿將細胞浸潤後，吸除多餘 EDTA-trypsin。然 後將培養皿放入37 °C 恆溫培養箱培養 2 - 3 分鐘，待細胞成懸浮狀，

輕敲培養皿並加入培養液中止 EDTA-trypsin 的作用。此時的細胞處於 非貼盤狀態，將細胞液收集至 5 ml 離心管中，在 4 °C 下以 300 X g

離心10 分鐘。傾倒出上清液留下離心管底部的細胞團塊，輕敲試管底 部使細胞團塊散開。最後加入 1 ml -20 °C 預冷凍的 75 % 酒精隔夜固 定。

在樣品上流式細胞儀前，酒精固定之樣品需先加入 3 ml PBS，4 °C 下 300 X g 離心 10 分鐘，傾倒出上清液留下離心管底下的細胞團塊。

輕敲離心管底部使團塊散開，再以 1 ml 之 0.1 % Triton-X 使其再懸 浮，靜置避光20 分鐘。使用 Triton-X 的目的在於在細胞壁上打洞以利 後續的染劑可以進入細胞內。然後在 4 °C 下 300 X g 再離心一次，10 分鐘。同樣離心後去除上清液，輕敲管壁散開細胞團塊，加入 0.5 ml propidium iodide 25 μg / ml 和 RNAse A 0.25 % ( w / v ) 處理並避光 30 分鐘。最後將細胞溶液過35 號篩網，即可以流式細胞儀分析。

從流式細胞儀 CellQuest pro 偵測所得的數據，我們使用 ModFit LT^TM for MAC 分析細胞週期分佈的變化。

七、蛋白質萃取

種約 1 X 10⁵ 的細胞於六孔盤中，經過隔夜 37 °C 的靜置貼盤培養 後，移除培養液。再加入預先配好濃度的藥品溶液培養液。待設定細胞 收集的時間，先用冰 PBS 沖洗細胞 2 次。再加入 0.3 ml protein lysis buffer。Protein lysis buffer 參考了之前研究者的配方[20-22]，我們實驗 室做了一些修正，其成分為 :

Component and final

concentration Stock concentration Volume

150 mM NaCl 4 M 375 μl

50 mM Tris-HCl (pH 7.4) 1 M 500 μl

1 % SDS 10 % 1000 μl

1 % Triton X-100 100 % 100 μl 1 mM PMSF 100 mM 100 μl

D₂-H₂O Dissolve to 10 ml

要注意的是 PMSF 是一種不可逆轉的 serine protease 抑制劑，必 需溶於 100 % DMSO。或無水的 methanol 或 isopropanol 中，否則容 易在含水溶液中水解。因此在需要溶解細胞之前，才加入 PMSF 以防

加入 protein lysis buffer 的細胞在式溫中先靜置 5~10 分鐘。接著 用 rubber policeman 將細胞輕輕刮下，然後收集裝進 eppendorf 中。插 冰靜置 1 小時候。以超音波震盪，目的是將 genomic DNA 打斷，在 插冰的狀態先震盪 5 秒後靜置 20 秒，再震盪 5 秒，接著放入離心機 以 12,000 X g 的轉速在 4 ℃ 下離心 15 分鐘後，收集上清液。 -20 ℃ 儲存備用。

八、蛋白質定量

抽取細胞蛋白質後，我們使用 bicinchoninic acid ( BCA ) 方法來分

析並定出細胞液中溶出蛋白質的含量。所使用的工具是從Thermo Scientific company 採購而得。定量的步驟根據 Thermo Scientific company 的使用者手冊。

檢量線的製作 : 取標準品白蛋白 1 mg/ml，取 0 μl，5 μl，10 μl，

15 μl，20 μl，25 μl 入 96 孔盤，分別再加入 25 μl，20 μl，15 μl，10 μl，

5 μl，0 μl 的二次蒸餾水。最後每孔再加入 BCA reagent 200 μl，在 37 °C 烘箱中靜置30 分鐘，再以 ELISA reader 測量 570 nm 光源下的吸光 值，並做出檢量線。根據檢量線我們定量出抽取檢品中所含的蛋白質含 量。

九、西方墨點法

取出欲分析量之蛋白溶液後，加入 1 / 3 體積之 4 X sample buffer，

然後放入 100 °C 水浴 5 分鐘，再移至室溫冷卻後進行 SDS-PAGE 分 析。水浴的主要目的是將蛋白質藉由加熱使其變性。

4 X sample buffer 成分含量如下 :

Component Content Final concentration

glycerol 4 ml 40 %

bromophenol blue 0.5 mg 0.4 % 0.5 M Tris pH 6.8 5 ml 250 mM

SDS 400 mg 4 %

β-mercaptoethonal 1 ml 10 %

Total D2-H2O 10 ml

蛋白質分離，SDS-PAGE 分為上膠 ( stacking gel ) 和下膠

( separating gel ) 兩個部份。分別為 stacking gel 和的 separating gel。

Separating gel ( pH 8.8 ) Total 12 ml

8 % 10 % 12.5 % 15 % 40 % Acrylamide / bis

solution 37.5：1 2.4 ml 3.0 ml 3.75 ml 4.5 ml 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 3.0 ml 3.0 ml 3.0 ml 3.0 ml APS ( 0.1 g / 10 ml ) 0.6 ml 0.6 ml 0.6 ml 0.6 ml

10 % SDS 120 μl 120 μl 120 μl 120 μl --- 混合均勻 ---

TEMED 5.0 μl 5.0 μl 5.0 μl 5.0 μl D2-H2O dissolve to 12 ml

4 % Stacking gel ( pH 6.8 ) 2.5 ml 5.0 ml 9.0 ml 40 % Acrylamide / bis

solution 37.5 : 1 0.25 ml 0.5 ml 0.9 ml 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 0.65 ml 1.3 ml 2.34 ml

APS ( 0.1 g / 10 ml ) 125 μl 250 μl 450 μl

10 % SDS 25 μl 50 μl 90 μl

--- 混合均勻 ---

TEMED 4.0 μl 8.0 μl 15.0 μl D2 H2O dissolve to 2.5 ml 5.0 ml 9.0 ml

一旦膠片已經聚合完畢，取出膠片並以 1 X Lamellae tank buffer 清 洗膠片以及已製型的 well，以便去除未聚合完全的 acrylamide。

將製備好的膠片架上跑膠台後，上層 stacking 端接上負電，下層靠 近 separating 端接上正電。以 1 X Lamellae tank buffer 淹沒覆蓋電極。

Running buffer 的製備，先配製 10 X Lamellae tank buffer 當做 stock solution，配製的成分比例如下:

10 X Lamellae tank buffer

Tris 30.285 g

Glycine 187.675 g

D₂-H₂0 To 1 L ( pH 8.3 )

pH 需調整為 8.3，置 4 °C 備用。

1 X lamellae tank buffer for use :

Volume ( ml ) Volume ( ml ) Volume ( ml ) 10 x lamellae tank buffer 20 40 50

10 % SDS 2 4 5

D2-H2O 178 356 445

Total 200 400 500

啟動電泳槽，70 V 約 40 分鐘做為 stacking stage，至 dye 被壓平同 在一樣的水平時，更換電壓 100 V 約 100 分鐘做為 separating stage，要 注意 dye front 不可跑出膠片的下緣。

同時，先準備新鮮配製的 transfer buffer，其配方如下 : Tris base 0.582 g

Glycine 0.292 g

SDS 0.1 g

D₂-H₂0 70 ml

Dissolve well

Methanol 30 ml

PVDF 膜要先以 100 % methanol 浸潤約 30 秒後浸泡於 transfer buffer 中備用。

濾紙亦先以 transfer buffer 浸泡 5 ~ 10 分鐘。

待 dye front 跑至接近膠片下緣時，停止電源。接著在 Transblot^® SD semi-dry transfer cell 上先鋪上 4 層事先以 transfer buffer 潤濕好的濾 紙，避免濾紙間有氣泡的產生，再鋪上 transfer buffer 浸潤的 PVDF 膜，再將膠片置於 PVDF 膜的上方，過程中仍要避面氣泡的產生，然後 在膠片上方再依序放上 4 層濾紙。輕蓋上 transfer cell 的蓋子，設定電 源供應器在 250 mA 下進行 40 分鐘的轉漬。

轉漬後的 PVDF 膜以含 5 % 脫脂奶粉的 TTBS 溶液阻絕膜上非 特異區域，室溫中振搖約30 分鐘。接著將 PVDF 膜浸潤在含一級抗體 ( 一級抗體的稀釋比例從 1 : 250 ~ 1 : 1,000 ) 及 5 % 脫脂奶粉的

TTBS 溶液中，4 °C 振搖約 4 小時後，以 TTBS-membrane washing solution 清洗，每 10 分鐘更換一次清洗液，連續 3 次。PVDF 膜清洗完 後，接著將之浸泡在含二級抗體的溶液中 ( 二級抗體的稀釋比例從 1 : 5,000 ~ 1 : 10,000 )，同樣 4 °C 振搖 2 小時後，再用 TTBS 清洗 30 分鐘，

每10 分鐘換一次清洗液。

TTBS-membrane washing solution 的配製 :

Stock concentration Working concentration Working Volume 1 M Tris ( pH 7.5 ) 20 mM 10 ml

4 M NaCl 500 mM 62.5 ml

Tween 20 0.1 % 500 μl

D2-H2O 427.5 ml

Total 500 ml

待最後一次清洗完畢後，加入新鮮配製冷光顯影劑 chemiluminescent HRP substrate ( Immobilon Western^® MILLIPORE)，使用冷光激發照相拍 攝蛋白表現情形 ( FUJI-LAS-4000 )，並使用 Multi Gauge ( Fugifilm company ) 的影像處理軟體進行分析。

十、RNA 萃取

我們從 NPC-TW01 和 HONE-1 兩株細胞株中分離出 total RNA；所

我們從 NPC-TW01 和 HONE-1 兩株細胞株中分離出 total RNA；所