討論

我們的實驗從藥物的篩選開始，首先會進行初步的篩選，使用 0 μM，

20 μM，50 μM 濃度的藥物進行初步的篩選，處理 A498 ( renal carcinoma )，

HCT116-1 ( colon carcinoma )，Hep3B ( hepatoma )，H661 ( lung carcinoma )，

NPC-TW01 ( nasalpharyngeal carcinoma ) 等 5 株不同部位的細胞株。每個濃 度都進行三重覆的實驗。初篩的結果算出的 IC₅₀ 如果有小於 10 μM 才會更 進一步縮小 dosing range。更進一步的 50 % 細胞抑制藥物濃度的實驗，起 始處理濃度降為 40 μM，並進行四倍的 serial dilution 依次稀釋為 10 μM，

2.5 μM，0.625 μM，0.156 μM 等五個濃度加上 0 μM 總共六個濃度梯度，經 過 MTT 處理後，由 ELISA reader 偵測 570 nm 的吸光值。扣除 blank 的 吸光值後，將無加藥的控制組當成 100 % 無抑制的狀態再去比較加藥後減少 吸光值達 50 % 以上者，使用內插的方式計算出抑制 50 % 相對應的濃度，

即是所謂的 IC50 。

根據 MTT 實驗，我們得到 cephalochromin 對各個細胞株的 IC50 分 別是 0.77 ± 0.41 μM ( NPC-TW01 )，1.18 ± 0.37 μM ( HONE-1 )，1.37 ± 0.69 μM ( CCRE-CEM )，1.77 ± 0.07 μM ( Jurkat )，2.21 ± 1.39 μM ( HCT-116 )，

2.51± 1.20 μM ( NCI-H661 )，12.01 ± 2.79 μM ( A498 ) ( Tab. 2 )。每個細胞株

果，鼻咽癌細胞株對 cephalochromin 比較敏感，因此比較低的藥物濃度即可 達到細胞生長抑制的效果。故以下的藥物細胞作用的機轉均以鼻咽癌細胞株 作為實驗的細胞株模式。

細胞增殖試驗的 MTT 實驗結果可能代表的結果有二：一是藥物引起 了細胞的死亡，也就是藥物對於細胞有毒殺的作用 ( cytotoxicity )；二是藥物 造成細胞停止增生，也就是藥物對細胞生長產生抑制作用 ( cytostatistic ) 。

細胞週期的分析，是藉由 propidium iodide 專門與細胞內的 DNA 結 合的特性，然後以流式細胞儀的雷射激發呈色，再由偵測其專屬散射波長 ( 562 ~ 588 nm ) 的 detector FL2 收集數據。2N 的位置認定為細胞週期的 G1

phase，4N ( 約 2 倍 2N 距離 ) 的位置認定為細胞週期的 G₂ ~ M phase，2N 到 4N 的區域認定為 S phase，而小於 2N 的區域認定是細胞碎片 sub-G₁。 從實驗中，至少需要 1 X 10⁴ 的細胞才能進行分析和判讀，所以分析的 細胞數量不能過少，否則無法分析。但也不能過多，因為過多細胞與細胞互 相接觸的話，會造成細胞間的 contact inhibition。Contact inhibition 的產生將 使細胞生長停滯，在流式細胞儀的偵測之下會發現有 G₁ accumulation 的情 形。

經過 24 h，48 h，72 h 不同濃度 cephalochromin 化合物處理 NPC cell。我們發現正常增殖中的細胞株 G₁ 的分佈約在 35 ~ 45 %，而經過藥物

處理過的細胞其 G1 分佈的比例有隨著劑量增加而增加的趨勢，例如 HONE-1 細胞經過 24 h 不同藥物濃度處理後，G₁ 分佈的比例從控制組的 40.46 % 增加到 16 μM 處理後的 51.39 % ( Fig. 5 )。不過，從數據中也發現，

濃度在 1 μM 和 2 μM 處理之下，藥物處理 24 h 對於 cell cycle 並沒有太 大的影響，到了 4 μM 的加藥組才和控制組的 G₁ 產生了些微升高的差距，

不過經過 48 h，72 h 後加藥組都出現了 G1 accumulaion 的情形，到了 72 h，所有的加藥組都出現 sub-G₁。為了有比較好的表現，往後的實驗都以 4 μM 和 8 μM 作為藥物理的濃度 ( 約相當於 4 倍和 8 倍的 IC₅₀ )。

從 cell cycle 分析除了發現有細胞週期 G1 phase 的停滯外，在 72 h 藥 物處理的細胞組，在分析圖上都出現明顯 sub-G₁。Sub-G1 的產生透露了一 個重要的訊息，就是細胞死亡。

細胞的死亡，可以分為壞死和凋亡[24]。兩者最主要的差別在於壞死的 細胞通常起因於組織的傷害，其特徵為細胞腫脹並爆裂，釋放出他們的細胞 內容物並造成周遭細胞的壞死反應通常在生物體內伴隨發炎反應的發生。而 凋亡的細胞則經由計畫性的細胞死亡，初期一連串的細胞型態學上的改變引 發細胞凋亡訊號的傳遞，瀕死的細胞會呈現細胞皺縮，DNA 濃聚並接著斷 裂的情形。最重要的是，細胞內容物並不會被釋放是細胞外間質中，它們將

並不會造成周邊細胞的大規模死亡引發發炎反應。因此經過 cephalochromin 處理的細胞所造成的死亡，我們檢測凋亡的特徵以便趨分細胞的死亡是由凋 亡或壞死所造成。

所以在實驗的設計上，我們使用了 Hoechst 33258 / propidium iodide 雙 染的方法以便檢測是否產生了凋亡的情形。另外，也使用 Annexin V-FITC apoptosis detection kit 來比較未處理藥物的控制組和加藥後的處理組在同時 間藥物濃度不同，產生 early apoptosis 的比例有何不同；同劑量不同時間下 又有何差異的表現。

從實驗的數據發現 ( Fig. 9 )，細胞株 HONE-1 在 cephalochromin 2 μM 濃度處理 24 h。Propidium iodide 在未加藥的控制組和加藥組的圖上看來並 沒有辦法進入細胞中 ( Fig. 9-a, d )，雖然在綠色螢光激發下仍無法呈現鮮紅 色螢光，所以細胞膜功能還在，表示細胞並未壞死。而 Hoechst 33258 則在 細胞膜功能還在時即可進入細胞中並和細胞中的DNA 結合，所以經 UV 激 發產生藍色螢光 ( Fig. 9-b, e )，此時稍可看見左上方的幾顆細胞的

chromosome 已有濃聚的情形產生。而最後疊圖 ( Fig. 9-c, f ) 更加確定 Hoechst 33258 ( + )，propidium iodide ( - )，所以 cephalochromin 將造成具有 apoptotic feature 的 chromosome condensation。

另外，從Annexin V-FITC apoptosis detection 的實驗中發現，藥物處理 24 h 後，未加藥的 Annexin V-FITC ( + )，propidium iodide ( - ) early

apoptosis 比例從控制組的 2.14 % 升高至 8 μM 處理的 5.21 % ( Tab. 3 )，雖 然 24 h 4 μM 的比例只有 3.01 %，不過和控制組相較之下還是增加了 50

%。同樣的情形在 48 h 時也是一樣，但在 8 μM 處理的這組則從 24 h 的 5.21 % 升高到 15.63 % ( Tab. 3 )。到了 72 h 更升高至 32.86 % ( Tab. 3 )。

從藥物處理濃度增加的情形和 early apoptosis 比例增加的情形看來，兩者似 乎有正向的相關關係。也就是 cephalochromin 處理的濃度越高，造成細胞 early apoptosis 的比例就越明顯增加。此外，從處理藥物時間和 early apoptosis 比例的關係來看，2 μM 的藥物處理和控制組相比雖然會造成細胞的死亡，

但效果並不明顯。4 μM 的藥物處理在前 48 h 也有一樣的結果，不過 72 h 後其早期凋亡的比例明顯的增高，顯示較低劑量的 cephalochromin 對細胞死 亡有 late response 的情形。而到了 8 μM 細胞 early apoptosis 的比例則呈倍 數的增加 ( Tab. 3 )。

從實驗中發現了一個問題，在每個控制組的 FL1 / FL2 中 ( Fig. 11 )，

右上角都有出現的 late apoptosis 的情形，判斷是由於我們使用的是貼盤的細 胞，因此在上流式細胞儀時，須以 EDTA-trypsin 處理讓細胞懸浮，但也有

滲入細胞當中所造成的結果。曾以 CellQuest pro 的軟體調整 FL1 和 FL2 的 compensation 仍得不到滿意的改善。

從 apoptosis detection 的實驗既然發現了藥物造成細胞死亡經由凋亡 所造成，接下來我們要研究凋亡的路徑為何?以及參予凋亡的蛋白質的表現情 形。目前有 2 個熟知的凋亡訊號傳遞鏈 ( Fig. 16 )，一是死亡受體路徑 ( the death receptor pathway )，又稱為外始路徑 ( extrinsic pathway )；另一是粒線 體路徑 ( the mitochondrea pathway )，又稱為內始路徑 ( intrinsic pathway )。

所以為了確認 cephalochromin 是經由內始或外始路徑造成細胞凋亡，

我們檢測了 NPC 細胞株蛋白質 caspase-8 和 caspase-9。結果發現 caspase-8 在 24 h 4 μM 的處理下有明顯的被啟動斷鏈的情形，反之，caspase-9 則看不 到這樣被斷鏈的情形。因為一般情形下，caspase activity 是不活化的，所以 一般是以 procaspase 的形式存在，當有訊號啟動，procaspase 就會被切斷而 活化。因此我們認為 cephalochromin 會啟動 caspase-8 而活化經由外始路徑 產生的凋亡。

為了確認這點，同時我們也檢測了 Fas / FasL 的表現。發現 Fas / FasL 的表現在控制組與藥物處理組有差異的表現 ( Fig. 19 )，也就是

cephalochromin 可能先與細胞外的 Fas / FasL 先結合，引導 Fas / FasL 的蛋

白質表現提升，然後啟動了 death receptor 下游的訊號傳遞鏈，因而觸動了 procaspase-8 活化斷鏈。

接著，我們預期活化後的 caspase-8 將會活化下游的 executioner procaspase-3 / -7，所以也用 caspase-7 antibody 來偵測 caspase-7 活化的情 形。在 full length caspase-7 的蛋白表現上有下降的情形，不過 cleavage form 的 caspase-7 並無太大的變化 ( Fig. 17-c )，這點或許我們還需持續再做確 認。如果能確認 caspase-3 / -7 是可以活化的，還要進一步檢測 late apoptosis marker : PARP 是否被活化斷鏈?這樣 cephalochromin 引導 apoptosis 的機轉 就可更完整。

從 cell cycle analysis 的數據說明了，經過 cephalochromin 的處理，會 造成鼻咽癌細胞株 G₁ phase acummulation，也就是造成所謂的 G₁ arrest。從 文獻上發現[25, 26]，會導致 G1 arrest 的機轉主要分為 p53-dependent 和 p53-independent。因此，p53 的表現與否，可以決定是否是 p53-mediate G₁ arrest 而引起的細胞凋亡。這個部份我們採用了西方墨點法，觀察經過化合 物處理過的細胞，其 p53 的表現量是否和未處理藥物的表現量有無差異。另 外，p53 的表現情形也和 Fas 有關[27, 28]，

但是，有文獻提到腫瘤細胞的 p53 基因常被突變。首先文獻上曾指出，

p53 具有較高表現是屬於常見的情形。也有文獻指出 NPC 的細胞株可能為 了生存的關係，在 p53 基因上的 codon 280 有 G → C 產生 transversions 的情形，所以造成 p53 的異變[31]，這或許是 p53 表現量高的原因。有文 獻指出 NPC-TW01 的 p53 功能是正常的[32]，不過也另有文獻研究指出 HONE-1 和 NPC-TW01 細胞株上的 p53 是突變的[33]，p53 突變將造成轉 錄因子的功能受到干擾抑制。p53 存在細胞質中是沒有作用的，當 p53 要有 作用時需型成四聚體。因此當這四聚體的 p53 都是 mutant type 時，p53 即 失去其轉錄的功能，但如果有二個以上的 p53 是完整的，則 p53 會呈現部 分的轉錄功能[34]。有文獻提到內生的突變 p53 和外生完整的 p53 同時在 於細胞質中時，p53 失去的轉錄功能會被反轉回來[35]。從實驗的結果發現，

雖然 p53 在控制組有高表現，不過經過化合物處理後的仍有明顯被提升的情 形 ( Fig. 14a )。綜此，後續我們會再針對實驗室所使用的細胞株 p53 狀態做 檢測，以便確認 p53 轉錄的報導基因是否可以活化而執行其轉錄的功能。

事實上除了檢查了 p53 蛋白質的部分，我們也檢查了 p53 independent G₁ arrest 相關的蛋白質 Cdc25A，結果如 ( Fig. 24 )。我們發現 Cdc25A 呈 現被 down-regulated。Cdc25A 是一種 dual-specific phosphetase，它的負調控 機轉一般是經由磷酸化的 Chk2 所抑制。不過我們從磷酸化的 Chk2 表現上 看不到 Chk2 有被活化的情形 ( Fig. 25 )。磷酸化後的 Chk2 即可抑制

Cdc25A 的去磷酸化作用因此始的下游的 cyclin E / Cdk2 複合體無法解離，

細胞無法從 G₁ phase 進入 S phase。所以造成所謂的 p53 independent G1 arrest ( Fig. 20 )。近期的研究發現[36]，Cdc25A 的負調控也可來自 p53，不 過這樣的調控是間接的，中間的機轉還未明確。因此我們推測 Cdc25A 的 dpwnregulation 可能是由 p53 活化的原因，但這也解釋了磷酸化的 Chk2 未 被提升的結果。除了 p53 蛋白質表現被提升，同時在基因層次的 p53 mRNA 經過 RT-PCR 的實驗也發現被提升的情形 ( Fig. 13 )。因此在蛋白質層次和 基因層次兩方面來說，p53 都有被啟動的情形。

p53 蛋白質既然被提升了，我們再利用西方墨點法偵測 p53 ser15 和 ser20 是經由哪個位置的胺基酸磷酸化所造成活化，發現 p53 在 ser20 的位

p53 蛋白質既然被提升了，我們再利用西方墨點法偵測 p53 ser15 和 ser20 是經由哪個位置的胺基酸磷酸化所造成活化，發現 p53 在 ser20 的位