結果 - 真菌二級代謝物 Cephalochromin 抑制鼻咽癌細胞相關機制之探討; Study on the Mechanisms of Anticancer Activity of a

一、抑制鼻咽癌細胞的增殖

實驗的結果顯示，cephalochromin 對許多腫瘤細胞株都有抑制細胞增生的效果，尤其是鼻咽癌細胞株 ( HONE-1 和 NPC-TW01 )。根據抑制細胞增殖實驗，我們利用MTT assay 的方法測量殘存細胞的粒腺體功能，在 570 nm 光源下偵測 formazan 的吸光值，定量藥物處理 72 h 後抑制 50 % 細胞增生 ( IC₅₀) 的有效濃度。得到其各別的 IC₅₀ 如 Tab. 2。其中 cephalochromin 對 NPC-TW01 的 IC50 是 0.77 ± 0.41 μM ( Fig. 2 )，對 HONE-1 的 IC50 是 1.18

± 0.37 μM ( Fig. 3 )。在我們實驗的所有細胞中，這兩株 NPC 細胞株亦是對 cephalochromin 處理後反應相對最敏感者。因此我們特別選用此兩株鼻咽癌細胞株做為實驗的細胞模式，對於 cephalochromin 的抗腫瘤機轉做進一步探討。

二、 G₁/ S 細胞週期停滯

由 cell-proliferation assay 的結果顯示，cephalochromin 的確會造成抑制細胞增生的作用。至於這個化合物是透過什麼方法，什麼機制達成細胞增生抑制的作用？首先，我們想要了解腫瘤細胞抑制作用是否會經由影響細胞週期的運作來促成細胞停止增生？如果的確造成了影響，此化合物究竟會造成

哪一個細胞週期停滯？因此我們利用 propidium iodide 染色來偵測細胞週期 DNA 改變的狀態，接著使用流式細胞儀進行實驗數據的收集。根據我們的數據顯示 HONE-1 細胞株分別經 cephalochromin 1 μM 藥物處理 24 ~ 72 小時後，細胞週期 G1 的堆積比例從 40.46 % 增加到 64.48 %，同時，S 期的比例從 46.75 % 下降至 31.86 %，G₂ ~ M 期的比例亦從 12.77 % 下降至 3.66 % ( Fig. 4 )。這說明 cephalochromin 會造成細胞有時間依賴性的 G1 停滯趨勢。同時我們發現在1 μM 的化合物處理濃度下，HONE-1 細胞株在 72 小時後出現了sub-G₁ 的情形。意指細胞產生死亡的現象。不過，對

NPC-TW01 而言，產生 sub-G1 的情形則較 HONE-1 來的晚，需經過 96 小時的化合物處理後，隨化合物處理濃度增加才會逐漸出現比例增加的 sub-G₁ ( Fig. 11 )，這樣的情形到了 120 h 的藥物處理後的增加比例更加明顯 ( Fig.

12 )。

更進一步，我們測試藥物是否跟產生細胞毒性而造成細胞停滯有任何劑量上的關聯性？

我們使用不同濃度的 cephalochromin 來處理細胞株 HONE-1 和

NPC-TW01。經過 24 h 後，從分析的數據得到細胞週期 G₁ 的分佈比例分別從 40.46 % 升高至 51.39 ％和 45.41 % 升高至 57.7 %，而 S phase 也同樣

經不同藥物濃度處理的細胞也同樣呈現 G1 堆積的情形 ( Tab. 3 )。這也證明了cephalochromin 同時造成藥物劑量依從性的 G₁ 停滯。

三、細胞型態學變化

為了確認cell-proliferation assay 細胞增生受到抑制的情形是由於凋亡路徑的引發或是壞死作用的引導。我們使用Hoechst 33258 和 propidium iodide

兩種染劑進行細胞雙染的實驗。兩種染劑均可標記細胞的DNA，其中的差異

在於Hoechst 33258 可以通過健康細胞的細胞膜進入細胞當中對細胞核和粒線體DNA 進行標記，而 propidium iodide 則無法穿透健康細胞之細胞膜。

根據實驗的結果，發現HONE-1 經過 cephalochromin 2 μM 處理 24 h 後，在電子顯微鏡下呈現了典型 chromosome condensation 的情形 ( Fig.

13 )。這個結果顯示 cephalochromin 的處理讓細胞出現了凋亡的徵兆，也意味著細胞的死亡可能由於凋亡的路徑而來。

四、凋亡現象的偵測

隨著凋亡徵兆的出現，利用偵測凋亡的工具 Annexin V-FITC apoptosis detection kit II 來評估細胞經由凋亡路徑造成細胞死亡的比例是否隨著化合物處理的時間與劑量而有所增加。

Annexin V 是一種細胞內蛋白質，和 apoptotic cell 翻轉細胞膜上的 PS ( phosphatidylserine ) 有很強的結合特性 ( Fig. 14 )，在 Annexin V 上接了一

個fluorescein isothiocyanate ( FITC ) 螢光基團。因此當細胞膜產生翻轉 phosphatidylserine 與 Annexin V 結合時，利用適當的雷射激發即可在流式細胞儀上偵測到螢光的波長約 521 nm ( FL1 )。

同時添加染劑 propidium iodide，它會與 DNA 結合。對一般正常的細胞而言，propidium iodide 無法穿透細胞膜進入細胞中與核醣核酸結合，只有在進行死亡中的細胞，其細胞膜的功能已失去，因此 propidium iodide 可以容易進到細胞中與核醣核酸結合。一旦 propidium iodide 和核醣核酸結合，它的螢光的強度可提高 20 ~ 30 倍，因此只要經過適當的雷射激發，即可在流式細胞儀上偵測到 562 ~ 588 nm ( FL2 ) 的螢光。

因此我們處理 Annexin V-FITC 和 propidium iodide 雙染的細胞，經由流式細胞儀的偵測，一般正常的細胞呈現 Annexin V-FITC ( - )、propidium iodide ( - )，early apoptotic 細胞呈現 Annexin V-FITC ( + )、propidium iodide ( - )，late apoptotic 細胞呈現 Annexin V-FITC ( + )、propidium iodide ( + )。

經過 Annexin V-FITC / propidium iodide 雙染偵測凋亡現象的實驗結果發現，不同劑量的 cephalochromin 造成了細胞染色 Annexin V-FITC ( + )，

%，48 h 的 1.04 % 到 15.63 %，72 的 4.75 % 到 32.86 % ( Tab. 4 )。同樣的，以同一濃度的藥物處理的細胞，經過 24 h 、 48 h 、和 72 h，Annexin V-FITC ( + )，propidium iodide ( - ) 比例亦隨時間增加而增加，以 8 μM 處理的細胞為例，其增加的比例由 24 h 的 5.21 % 升高到 72 h 的 32.86 %。

由實驗的數據發現，cephalochromin 所引起的細胞死亡是經由凋亡路徑的引發而來。

五、Caspase 系列蛋白質表現情形

根據細胞週期分析的結果，我們看到經過 HONE-1 和 NPC-TW01 分別經 72 小時 1 倍 IC₅₀ 藥品濃度和 96 小時藥物處理後，出現 sub-G₁。經由 Hoechst 33258 / propidium iodide 雙染，看到細胞形態上出現 chromosome condesation 的情形。p53 蛋白質表現在實驗數據上有被提升的情形。顯示出可能有某些凋亡的路徑牽涉其中，因此我們抽取不同時間處理的細胞碎片中的蛋白質，使用西方墨點法檢視影響細胞凋亡路徑的caspase 訊號傳遞鏈是否有被啟動，進而研究何種caspase 受到影響 ( Fig. 16 )。

首先我們看到經過不同藥物濃度處理後的細胞， caspase 8 的蛋白質表現量。我們發現隨著藥物濃度的增加，斷鏈的caspase-8，也就是被活化的 caspase-8 有被啟動的情形 ( Fig. 17A )。這說明 cephalochromin 造成細胞凋

亡的路徑可能是經由caspase-8 的活化所造成。

另外，caspase-9 蛋白質的表現，我們發現有被引導上升的趨勢，但是經

斷裂活化的caspase-9 並沒有相對的增加 ( Fig. 17B )。這是一個有趣的現象，

所以我們用 RT-PCR 來檢測 caspase-9 的基因層次是否有被提升。從 RT-PCR 實驗結果上看來 ( Fig. 18 )，caspase-9 的基因在加藥組中反而較控制組的來的少，顯示有被消耗的情形。

由 caspase-8 和 caspase-9 的蛋白質表現比較，我們推斷，cephalochromin 導致細胞凋亡的路徑是經由caspase-8 的活化而來。

進一步，我們也要來研究caspase 8 活化後的下游蛋白質表現情形，

caspase-3 / -7 以及 PARP 是否有被活化，如此一來才能確認 caspase-8 所引發的一連串訊號傳遞鏈引導凋亡的路徑。

從 caspase-7 的西方墨點法的實驗結果 ( Fig. 17C )，發現 full length 的 caspase-7 雖然在有加藥的情況下減少表現，不過，被切斷的 cleavage

caspase-7 並未看到明顯得提升。因此這個部分的結果需再做確認。

六、Fas / FasL 蛋白質表現情形

從 caspase-8 的活化情形，推測其活化結果可能是由上游的訊號傳遞而

果發現不論是 Fas 或者是 FasL 的蛋白質表現在兩株細胞株上均有被觀察到提升的情形 ( Fig. 19 )。

七、P53 基因以及蛋白質表現情形

因為從細胞週期實驗的分析，cephalochromin 造成了 G₁ 細胞週期的停滯，因此細胞停止的增殖。因此更進一步研究何種蛋白與 G₁/ S 停滯有關。

從很多研究報告發現，p53 可以調控細胞週期而影響腫瘤細胞的生長。因此，

我們針對 p53 蛋白質的變化做研究是否細胞週期的停滯與 p53 的參與有關？

我們利用西方墨點法來研究p53 蛋白質的表現情形，發現隨著藥物處理時間增加，p53 表現的濃度有呈現增加的趨勢 ( Fig. 22A )。所以 cell cycle arrest 可能是經由調控 p53，進而活化 p53-mediated cell signaling pathway 的結果。我們也使用 RT-PCR 檢查 p53 m-RNA 的變化。結果顯示經過處理的細胞其p53 的 m-RNA 的表現也將會被提升 ( Fig. 21 )。這個結果指出 p53 的引導不但在蛋白質層次被提升，而且在基因層次也被提升，而更可以確認，

p53 有被誘導增加的情形。

p53 的表現被提升的同時，活化的 p53 是否也被提升也是個重要的問題?

也就是磷酸化的 p53 是否有增加？p53 可被磷酸化的位置很多[23] ( Fig.

20 )，藉由西方墨點法，偵測 p53 ( ser15 ) 和 p53 ( ser20 ) 不同的磷酸化位

置中，是經由那個位置被磷酸活化。將有助於判斷 p53 的活化在訊號傳遞中所扮演的角色。結果發現，p53 磷酸化的位置，主要在 ser20 的位置 ( Fig.

22B )。

八、p53 下游蛋白質 p21 的表現情形

從 p53 在 ser20 的位置上被磷酸化而啟動的情形，推測 p53 下游的 p21 Cdk inhibitor gene 也會被活化而造成細胞的停滯。

因此利用西方墨點法來偵測 p21 的表現情形 ( Fig. 23 )。由結果發現經過 cephalochromin 4 μM 處理 24 h 後的細胞其 p21 的表現與控制組比較是有差異性的提升，但是 48 h 、 72 h p21 的表現就逐漸的下降了，這和 p53 ser20 磷酸化的表現是有出入的。

九、p53-independent G1 arrest 相關蛋白質表現

同時檢測了 p53-independent G₁ arrest 的相關蛋白質 Cdc25A。Cdc25A 是一種 dual-specific phosphotase，其作用為活化 Cycline / CDK complex，造成複合體的解離，使細胞週期繼續進行。實驗結果顯示 Cdc25A 經過化合物處理後，其蛋白表現量降低 ( Fig. 25 )。

另外我們也追蹤 Cdc25A 的上游蛋白 Chk2 的表現情形，由實驗結果顯

示 Chk2 的蛋白表現也下降 ( Fig. 26 )。

在文檔中真菌二級代謝物 Cephalochromin 抑制鼻咽癌細胞相關機制之探討; Study on the Mechanisms of Anticancer Activity of a Fungal Secondary Metabolite, Cephalochromin, in Nasopharyngeal Carcinoma Cells (頁 49-58)