實驗方法

ㄧ、芝麻酚於大鼠體內之代謝動力學

A. 以 Polyethylene glycol 400 (PEG 400) 配製芝麻酚溶液 (a) 低劑量組

a. 芝麻酚溶液之製備

精稱芝麻酚 67.0 mg，加入 PEG 400 15.0 mL，以超音波振盪 器振盪 10 分鐘，供大鼠口服用。

精稱芝麻酚 11.0 mg，加入 PEG 400 1.1 mL，以超音波振盪 器振盪 10 分鐘，以 0.22 μm 針頭濾膜過濾後，供大鼠靜脈注射 用。

b. 動物

雄性 Sprague-Dawley 大白鼠五隻，體重介於 400~520 g，實 驗前禁食 12 小時，自由給水，給藥後 3 小時再進食。

(b) 高劑量組

a. 芝麻酚標準溶液之製備

精稱芝麻酚 143.0 mg，加入 PEG 400 21.0 mL，以超音波振 盪器振盪 10 分鐘，供大鼠口服用。

精稱芝麻酚 28.0 mg，加入 PEG 400 1.4 mL，以超音波振盪

器振盪 10 分鐘，以 0.22 μm 針頭濾膜過濾後，供大鼠靜脈注射 用。

b. 動物

雄性 Sprague-Dawley 大白鼠七隻，體重介於 370~460 g，實 驗前禁食 12 小時，自由給水，給藥後 3 小時再進食。

c. 給藥與採血 1. 給藥

採交叉設計，低劑量組口服給予 30 mg/kg 芝麻酚及靜脈注 射 5.0 mg/kg 芝麻酚，一週後，兩組交叉給藥。高劑量組口服 給予 50 mg/kg 芝麻酚及靜脈注射 10.0 mg/kg 芝麻酚，一週 後，兩組交叉給藥。

2. 採血

給藥後 5、15、30、60、120、240、480、720 及 1440 分鐘 從心臟採血。給藥後一小時內時間點以心臟穿刺方式採血約 1.2 mL，其餘時間點採血約 0.8 mL。將血液檢品以 9860×g 高 速離心 15 分鐘，取上層血清，並貯存於 -30℃，俟後分析。

d. 血清檢品中芝麻酚及其結合態代謝物之定量

取血清檢品 150 μL，加 pH5.0 之緩衝溶液 50 μL、抗壞血 酸溶液 (200 mg/mL) 50 μL及 0.1N 鹽酸 50 μL，於試管振盪 器上充分混合，以乙酸乙酯 (含內標 6,7-dimethoxycoumarin 2.5 μg/mL)300 μL萃取，於試管振盪器上振盪 30 秒後，高速 離心 (9860×g) 5 分鐘，取乙酸乙酯層，氮氣吹乾後，以甲醇 50 μL溶解，取 20 μL供 HPLC 分析。以檢品中芝麻酚與內標之 波峰面積比值，代入檢量線方程式，求得檢品濃度。

2. 芝麻酚結合態代謝物之定量 (1) 硫酸結合態代謝物之定量

取血清檢品溶液 150 μL置於包覆鋁箔紙之玻璃試管內，

置於冰浴中，加入抗壞血酸溶液 (200 mg/mL) 50 μL及 sulfatase 溶液 (1000 units/mL 於 pH 5.0 之 acetate buffer) 50 μL，蓋上血清塞，於試管振盪器上充分混合，用針筒將試管 內之空氣抽出。置於 37℃之恆溫水槽反應 1 小時。反應後，

取出檢品，加入 0.1N 鹽酸 50 μL及乙酸乙酯 (含內標

6,7-dimethoxycoumarin 2.5 μg/mL)300 μL，再於試管振盪器上 振盪 30 秒後，高速離心 (9860×g) 5 分鐘，取乙酸乙酯層萃 取液，氮氣吹乾後，以甲醇 50 μL溶解，取 20 μL供 HPLC 分析。檢品中芝麻酚與內標之波峰面積比值，代入檢量線方

程式，求得檢品濃度。

將水解後之芝麻酚總濃度扣除自由態濃度即為 sulfate 之 濃度。

(2) 葡萄糖醛酸結合態代謝物之定量

取血清檢品溶液 150 μL置於包覆鋁箔紙之玻璃試管內，

置於冰浴中，加入抗壞血酸溶液 (200 mg/mL) 50 μL及 glucuronidase 溶液 (1000 units/mL 於 pH 5.0 之 acetate buffer) 50 μL，蓋上血清塞，於試管振盪器上充分混合，用針 筒將試管內之空氣抽出。置於 37℃之恆溫水槽反應 2 小 時。反應後，取出檢品，加入 0.1N 鹽酸 50 μL及乙酸乙酯 (含 內標 6,7-dimethoxycoumarin 2.5 μg/mL)300 μL，再於試管振 盪器上振盪 30 秒後，高速離心 (9860×g) 5 分鐘，取乙酸乙 酯層萃取液，氮氣吹乾後，以甲醇 50 μL溶解，取 20 μL供 HPLC 分析。檢品中芝麻酚與內標準之波峰面積比值，代入檢 量線方程式，求得檢品濃度。

將水解後之芝麻酚總濃度扣除自由態濃度即為 glucuronide 之濃度。

e. 高效液相層析之分析條件

層析管柱採用 Cosmosil C18 (5 m，150 ×4.6 mm)。移動相 由 0.1 % H3PO4和乙腈 (78:22) 組成。流速為 1.0 mL/min。檢測 波長為 290 nm。

f. 檢量線繪製

將芝麻酚以甲醇稀釋成系列濃度之標準溶液，分別加九倍體 積之空白血清，配置系列濃度之血清標準溶液，濃度如下：

40.0、20.0、5.0、2.5、1.3、0.3、0.2g/mL。取血清標準溶液 150 μL，依序加入 pH5.0 之緩衝溶液 50 μL及抗壞血酸溶液 (200 mg/mL) 50 μL，於試管振盪器上充分混合，加入 0.1N 鹽酸 50 μL 及乙酸乙酯 (含內標 6,7-dimethoxycoumarin 2.5 μg/mL)300

μL，於試管振盪器上振盪 30 秒後，高速離心 (9860×g) 5 分鐘，

取乙酸乙酯層萃取液，氮氣吹乾後，以甲醇 50 μL溶解，取 20 μL供 HPLC 分析。所得芝麻酚與內標準之波峰面積比值與各已 知濃度進行直線迴歸，求得檢量線之方程式。

g. 分析方法之確效 1. 精密度 (precision)

將各濃度之血清標準溶液，分別於同日內早、午、晚及連續 三日之異日間各進行一次層析，並以獲得之檢量線方程式求得

每次實測濃度。以三次同日內及三次異日間實測濃度分別求其 平均值 (mean)、標準偏差 (standard deviation, S.D.)及變異係數 (coefficient of variation, C.V.)。

2. 準確度 (accuracy)

三次同日內及三次異日間實測濃度與真正濃度間之相對誤 差 (relative error, R.E.)表示之。

3. 靈敏度 (sensitivity)

將芝麻酚血清標準溶液一再稀釋，直到其波峰為雜訊三倍之 濃度為偵測極限。

4. 回收率 (recovery)

將高、中、低濃度各指標成分之芝麻酚甲醇溶液，加入空白 血清中，得 20.0、5.0 及 1.25 μg/mL等濃度各三份，分析方法 同 ㄧ-A-d-1. 芝麻酚自由態之定量。 HPLC 所測得血清標準溶 液之波峰面積比值，代入檢量線方程式求得濃度，所得濃度除 以各已知濃度之百分率，即回收率。

回收率 = 實測濃度/理論濃度 × 100%

h. 數據分析

使用 WINNONLIN (version 1.1, SCI Software, Statistical Consulting, Inc., Apex, NC) 軟體之非室體模式 (noncompartment

model) 分析血藥濃度數據，以計算藥物動力學參數如下：

Tmax：到達最高血中濃度之時間 (min)

Cmax：藥物在血中之最高濃度 (nmol‧mL^-1 或 ng‧mL^-1) AUC0-t ：血中藥物濃度對時間之曲線下面積 (nmol‧min‧

mL^-1 或 ng‧min‧mL^-1) (非室體模式運用梯形法來計 算，不需任何假設即可輕易運算，又稱為零級動量曲線 下面積。)

MRT：藥物之平均滯留時間 (min)

B. 以蒸餾水配製芝麻酚溶液 (a) 單次給藥

a. 芝麻酚標準溶液之製備

精稱芝麻酚 111.0 mg，加入蒸餾水 18.0 mL，以超音波振盪 器振盪 10 分鐘，供大鼠口服用。

精稱芝麻酚 24.0 mg，加入蒸餾水 1.2 mL，以超音波振盪器 振盪 10 分鐘，以 0.22m 針頭濾膜過濾後，供大鼠靜脈注射用。

b. 動物

雄性 Sprague-Dawley 大白鼠六隻，體重介於 350~450 g，實 驗前禁食 12 小時，自由給水，給藥後 3 小時再進食。

(b) 多次給藥

a. 芝麻酚標準溶液之製備

精稱芝麻酚 120.0 mg，加入蒸餾水 18.0 mL，以超音波振盪 器振盪 10 分鐘後，供大鼠口服用。

b. 動物

雄性 Sprague-Dawley 大白鼠六隻，體重介於 350~450 g，實 驗中飼料及水正常供應。

c. 給藥與採血 1. 給藥

採交叉設計，單次給藥口服給予 50 mg/kg 芝麻酚；一週後，

俟藥物於體內代謝完畢，靜脈注射給予 10 mg/kg 芝麻酚。

多次給藥以大鼠口服給予 50 mg/kg 芝麻酚，每天三次，共六 次；再於第三天早上餵食第七次後，進行動力學實驗。

2. 採血

給藥後 5、15、30、60、120、240、480、720、1440 及 2880 分鐘從心臟採血。給藥後一小時內時間點以心臟穿刺方式採血約 1.2 mL，其餘時間點採血約 0.8 mL。將血液檢品以 9860×g 高

d. 檢量線繪製

將芝麻酚標準品以蒸餾水稀釋成系列濃度之標準溶液，分別加 九倍體積之空白血清，配置系列濃度之血清標準溶液，濃度如下：

200.0、100.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.3、0.6、0.3g/mL。

取血清標準溶液 150 μL，依序加入 pH5.0 之緩衝溶液 50 μL及抗 壞血酸溶液 (200 mg/mL) 50 μL，於試管振盪器上充分混合；加入 0.1N 鹽酸 50 μL及乙酸乙酯 (含內標 6,7-dimethoxycoumarin 2.5 μg/mL)300 μL，再於試管振盪器上振盪 30 秒後，高速離心

(9860×g) 5 分鐘，取乙酸乙酯層萃取液，氮氣吹乾後，以甲醇 50 μL 溶解，取 20 μL供 HPLC 分析。所得芝麻酚與內標之波峰面積比 值與芝麻酚濃度進行直線迴歸，求得檢量線之方程式。

e. 分析方法之確效

精密度、準確度、靈敏度、回收率確效方法同本節 ㄧ-A-g.

二、芝麻酚血清代謝物抗自由基活性之評估

(一) 芝麻酚血清代謝物清除 DPPH 自由基之活性評估 1. 溶液配製

(1) Sesamol 標準溶液配製

稱取 1.0 mg sesamol 標準品，以少量 PBS 溶解後，再以 PBS 定容至 10 mL。取適量儲備溶液，以 PBS 系列稀釋成 2.4、4.9、

9.8、19.5 及 39.0 μM 之芝麻酚標準溶液。

(2) 抗壞血酸溶液配製

稱取 1.4 mg 抗壞血酸，以少量 PBS 溶解後，再以 PBS 定容至 10 mL。取適量儲備溶液，以 PBS 系列稀釋成 2.4、4.9、9.8、19.5 及 39.0 μM 之抗壞血酸溶液。

(3) Sesamol sulfate/glucuronide 溶液之配製

Sesamol sulfate/glucuronide 係本實驗所製備。方法如本實驗室製 備代謝物步驟所述。分兩組進行前處理， A 組不經固相萃取、 B 組經固相萃取去除 sesamol 原形，定量其 sesamol sulfate 與

glucuronide 之濃度後，分別以 PBS 系列稀釋， A 組之 sulfate 與 glucuronide 濃度比例約為 147:1；B 組之 sulfate 與 glucuronide 比 例約為 162:1。

(4) 空白血清溶液之配製

空白血清溶液分為兩組，A 組不經固相萃取、 B 組經固相萃取去 除極性較低之內生性物質。以 PBS 稀釋成每 mL 相當於 1 mL 全血及 0.5 mL 之全血。

(5) 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)溶液之配製

稱取 9.858 mg 之 DPPH 溶於 10 mL MeOH，即 0.0025 M 之 DPPH solution。溶液需於實驗前新鮮配製。

2. 清除 DPPH 自由基活性之評估

分別取 950 L 芝麻酚結合態代謝物或芝麻酚標準溶液或抗壞血 酸溶液，加入 50L 之 DPPH 溶液，於渦旋振盪器輕搖混合後靜置 室溫 30 分鐘 (n=3)。以酵素免疫分析儀，於波長 517 nm 下測吸光 值。對照組以空白血清或 PBS 取代各檢品溶液。

3. 統計分析

以 one way ANOVA 與 Scheffe 事後檢定方法分析各組間之差異。

(二) 芝麻酚及其血清代謝物對 AAPH 誘導紅血球溶血之活性評估 1. 溶液配製

(1) Sesamol 標準溶液配製

稱取 33.8 mg sesamol 標準品，以少量 PBS 溶解後，再以 PBS 定容至 10 mL。取適量溶液，以 PBS 系列稀釋成 0.4、2.0、9.8、

48.8 及 244.0 μM 之芝麻酚標準溶液。

(2) 抗壞血酸溶液配製

稱取 43.0 mg 抗壞血酸，以少量 PBS 溶解後，再以 PBS 定容 至 10 mL。取適量之抗壞血酸溶液，以 PBS 系列稀釋成 0.4、2.0、

9.8、48.8 及 244.0 μM 之抗壞血酸溶液。

(3) Sesamol sulfate/glucuronide 溶液之配製

Sesamol sulfate/glucuronide 係本實驗所製備。方法如本實驗室製 備代謝物步驟所述。分兩組進行前處理， A 組不經固相萃取、 B 組經固相萃取去除 sesamol 原形，定量其 sesamol sulfate 與

glucuronide 之濃度後，分別以 PBS 系列稀釋， A 組之 sulfate 與 glucuronide 濃度比例約為 147:1；B 組之 sulfate 與 glucuronide 比 例約為 162:1。

(4) 空白血清溶液之配製

空白血清溶液分為兩組，A 組不經固相萃取、 B 組經固相萃取去

除極性較低之內生性物質。以 PBS 稀釋成每 mL 相當於 1 mL 全血及 0.5 mL 之全血。

(5) 2,2-Azobis(2-amidinopropane)hydrochloride (AAPH)溶液之配製 稱取 542.4 mg 之 AAPH 溶於 20 mL PBS，即 100 mM 之 AAPH solution。溶液於實驗前新鮮配製。

2. 大鼠紅血球懸浮液之製備

選用雄性 Sprague-Dawley 大白鼠，以心臟穿刺方式採血 18 mL 入含有 EDTA 之真空採血管中，經離心 (4000 rpm) 15 分鐘，去除上 層血漿與 buffy coat 後，加入 25 mL PBS 清洗血球，續離心 15 分鐘 並捨棄上清液，重複清洗血球計 5 次，最後得到堆積之紅血球 (packed erythrocytes)。將紅血球加入四倍體積之 PBS 復懸，即為 20%

選用雄性 Sprague-Dawley 大白鼠，以心臟穿刺方式採血 18 mL 入含有 EDTA 之真空採血管中，經離心 (4000 rpm) 15 分鐘，去除上 層血漿與 buffy coat 後，加入 25 mL PBS 清洗血球，續離心 15 分鐘 並捨棄上清液，重複清洗血球計 5 次，最後得到堆積之紅血球 (packed erythrocytes)。將紅血球加入四倍體積之 PBS 復懸，即為 20%