結果與討論

ㄧ、芝麻酚於大鼠體內之代謝動力學

為了解芝麻酚進入活體後之生物命運，本研究以大鼠為動物模式，進 行兩種途徑及兩種劑量之芝麻酚動力學研究，並探討水及 PEG 400 兩種 溶媒對芝麻酚代謝動力學之影響。文獻指出酚類化合物會於大鼠腸內經 phenol sulfotransferase 及 UGT1A 代謝為 sulfate 及 glucuronide 結合態產 物，經腎臟排泄 (Capel et al., 1972; Cassidy et al., 1984; Oddy et al., 1997;

Inoue et al., 1999)。本研究針對此兩類結合態代謝物進行分析方法之開 發。由於無法取得結合態代謝物之標準品，因而將血清檢品以 sulfatase 及 β-glucuronidase 分別水解成 sesamol，再以 HPLC 分析。水解條件經 預試驗決定， sesamol sulfate 及 glucuronide 之水解時間分別為 1 及 2 小時。利用乙酸乙酯分別萃取血清酶解前與酶解後之芝麻酚。以 0.1% 磷 酸與乙腈之混合液為移動相，每一個血清檢品可於 13 分鐘內完成分析。

層析圖如 Fig. 1 所示。

A. 以 PEG 400 溶解芝麻酚之代謝動力學

分析血清中芝麻酚之檢量線係以芝麻酚與內標波峰面積比值為 y 軸，芝麻酚濃度為 x 軸，經線性迴歸求得檢量線方程式。芝麻酚之檢量 線方程式為 y = 0.14899x - 0.00214 (r = 0.999)，濃度在 0.16g/mL 至 40.0g/mL 之範圍有良好線性關係。分析方法之精密度 (precision) 及準 確度 (accuracy) 如 Table 1 所示。同日內及異日間之變異係數 (coefficient of variation) 分別小於 8.7% 及 7.1%。血清內芝麻酚之回收率 (recovery) 為 96.6~97.4%，如 Table 2 所示。結果顯示分析系統之精密度、準確度及 回收率皆良好。最低定量極限 (LLOQ) 為 0.16 g/mL，可偵測極限 (LOD) 為 0.08 g/mL。

(a) 靜脈注射 5 mg/kg 及口服 30 mg/kg

靜脈注射 5 mg/kg 與口服 30 mg/kg 芝麻酚後，其血清中 sesamol、

sesamol sulfate 及 sesamol glucuronide 之濃度與平均濃度經時變化圖如 Table 3~5、Table 9~10 及 Fig. 2、Fig. 3 所示。結果顯示口服後，芝麻酚原 形分子之濃度低於可偵測極限。靜脈注射後 sesamol sulfate 及

glucuronide 之 Tmax分別為 6.0±3.7 及 15.0±11.6 min，； Cmax分別為 87.5±15.4 及 5.9±1.6 nmol/mL； AUC0-1440分別為 3341.7±660.2 及

243.6±77.6 nmol．min/mL； MRT 分別為 64.9±15.7 及 29.3±7.5 min。口

74.0±28.2 min； Cmax分別為 134.6±29.7 及 10.6±2.6 nmol/mL； AUC0-1440

分別為 19967.9±4434.8 及 1331.8±347.0 nmol．min/mL；

MRT 分別為 255.5±74.8 及 112.0±31.7 min。數據如 Table 6~7 及 Table 11~12 所示。靜脈注射後其 sesamol sulfate 之 Cmax及 AUC0-1440分別為 glucuronide 之 15 與 14 倍 (Table 8)；口服則為 13 與 15 倍 (Table 13)。

從上述結果顯示，無論以靜脈注射或口服投予芝麻酚，大多以結合 態代謝物 (sulfate/glucuronide) 存在於血清中，主要為 sesamol sulfate。

靜脈注射投予後，芝麻酚自由態僅於一小時內測得。

另外芝麻酚口服吸收率之計算，係以口服投予後之結合態代謝物血 藥面積之總和，與靜脈注射給藥後原形與結合態代謝物血藥面積之總和相 比，再經劑量校正後求得口服吸收率為 114%，如此高的絕對生體可用率 顯示芝麻酚於鼠體內之吸收良好。

口服吸收率計算公式如下所示：

Oral bioavailability =AUC(sesamol+conjugates) po/AUC(sesamol+conjugates) iv× Doseiv/Dosepo × 100%

(b) 靜脈注射 10 mg/kg 及口服 50 mg/kg

靜脈注射 10 mg/kg 及口服 50 mg/kg 給予芝麻酚後，血清中

sesamol、sesamol sulfate 及 sesamol glucuronide 之濃度與平均濃度經時變 化圖如 Table 14~16、Table 20~21 與 Fig. 4、Fig. 5 所示。靜脈注射後

sesamol sulfate 及 glucuronide 之 Tmax分別為 4.3±4.3 及 10.7±5.4 min；

Cmax分別為 127.0±20.0 及 27.8±11.6 nmol/mL； AUC0-1440分別為

6407.8±1080.2 及 776.7±241.3 nmol．min/mL； MRT 分別為 49.8±4.7 及 37.0±6.3 min。口服後 sesamol sulfate 及 glucuronide 之 Tmax分別為 24.3±16.1 及 140.7±65.2 min； Cmax分別為 162.8±30.9 及 7.6±1.6 nmol/mL； AUC0-1440分別為 27945.4±4216.4 及 1145.8±322.0 nmol．

min/mL； MRT 分別為 321.5±54.5 及 175.3±44.0 min。數據如 Table 17~18 與 Table 22~23 所示。靜脈注射後， sesamol sulfate 之 Cmax及 AUC0-1440

分別為 glucuronide 之 5 與 8 倍 (Table 19)；口服投予後為 21 與 24 倍，

且 sesamol sulfate 之 MRT 約為 glucuronide 之 2 倍，如 Table 24 所示。

結果顯示，以較高劑量芝麻酚投予時，亦主要以結合態代謝物存於血清 中，計算其口服吸收率為 92.6%，顯示吸收良好。

綜合以上兩種不同途徑、不同劑量芝麻酚之動力學研究結果顯示，

化學結構上具有酚基之芝麻酚幾乎以結合態形式代謝物

(sulfate/glucuronide) 存在於血清中，且硫酸結合態代謝物之血中濃度遠高 於葡萄糖醛酸結合態代謝物，可見硫酸結合態代謝物為芝麻酚之主要代謝 產物。

口服芝麻酚後，結合態代謝物之經時變化皆顯示有二次吸收，推測 有腸肝循環 (enterohepatic circulation)現象。口服吸收率以前述之公式計

算，口服兩種劑量之芝麻酚能得到極高之生體可利用率，推測可能與其結 合態代謝物之腸肝循環有關。

B. 以蒸餾水溶解芝麻酚之代謝動力學 (靜脈注射 10 mg/kg 及口 服 50 mg/kg)

另以蒸餾水為溶媒進行芝麻酚動力學研究，分析方法與前相同。利用 HPLC 方法，定量血清中之 sesamol、sesamol sulfate 及 sesamol

glucuronide。

口服投予後，一小時內於大鼠體內發現有芝麻酚原形分子之存在。分 析血清中芝麻酚之檢量線係以芝麻酚與內標波峰面積比值為 y 軸，芝麻 酚濃度為 x 軸，經線性迴歸求得檢量線方程式。芝麻酚之檢量線方程式 為 y = 0.09540x - 0.00153 (r = 0.998)，芝麻酚濃度在 0.16g/mL 至 200

g/mL 之範圍有良好線性關係，如 Table25 所示。血清中芝麻酚之回收率 (recovery) 為 93.8~103.2%，如 Table 26 所示。

靜脈注射 10 mg/kg 及口服 50 mg/kg 投予芝麻酚後，血清中

sesamol、 sesamol sulfate 及 sesamol glucuronide 之濃度與平均濃度經時 變化圖如 Table 27~29、 Table 34~36 與 Fig. 6、 Fig. 7 所示。其 sesamol、

sesamol sulfate 及 glucuronide 之 Tmax、 Cmax、AUC0-2880及 MRT0-2880等 參數分別列於 Table 30~32 及 Table 37~39。靜脈注射後 sesamol sulfate

之 Cmax分別為芝麻酚原形分子及 sesamol glucuronide 之 4 與 9 倍；

sesamol sulfate 之 AUC0-2880分別為芝麻酚原形分子及 sesamol

glucuronide 之 20 與 14 倍； sesamol sulfate 及 glucuronide 之 MRT0-2880

分別為芝麻酚原形分子之 5 與 4 倍 (Table 33)。口服 sesamol gucuronide 之 Tmax為芝麻酚原形分子之 3 倍； sesamol sulfate 之 Cmax分別為芝麻酚 原形分子及 sesamol glucuronide 之 4 與 11 倍； sesamol sulfate 之 AUC

0-2880分別為芝麻酚原形分子及 sesamol glucuronide 之 22 與 13 倍；

sesamol sulfate 之 MRT0-2880分別為芝麻酚原形分子及 sesamol

glucuronide 之 10 與 2 倍 (Table 40)。結果顯示，不論以靜脈注射或口服 投予芝麻酚，主要以芝麻酚結合態代謝物存在於血清中，主要為硫酸結合 態代謝物。另以前述公式計算得芝麻酚口服吸收率為 56%。

經比較兩種溶媒的動力學結果，顯示以 PEG 400 溶解芝麻酚時，血 中未檢出芝麻酚原形分子，僅有芝麻酚結合態代謝物存在；但以水溶解芝 麻酚時，給藥後之ㄧ小時內有芝麻酚原形分子存在。但相仿的是兩者都以 芝麻酚結合態代謝物循環於體內，且主要為硫酸結合態代謝物。因此芝麻 酚結合態代謝物的生物活性應比芝麻酚原形更值得注意。

比較大鼠靜脈注射 (10 mg/kg)或口服 (50 mg/kg)溶於兩種溶媒之芝 麻酚動力學參數，如 Table 41~42 所示。以蒸餾水為溶媒時，靜脈注射或 口服投予芝麻酚，其芝麻酚結合態代謝物之 AUC0-t皆顯著高於以 PEG

400 為溶媒者。

存在於腸胃道上皮細胞的酶包括 phenol transferase 、

UDP-glucuronosyltransferases (UGTs²)、 cytochrome P450 3A (CYP3A)及 P-glycoprotein 外排蛋白等 (Chowdhury et al., 1985; Watkins, 1997)。

CYP3A4 表現於小腸表皮細胞內，主導口服藥物於腸膜之首渡代謝

(Watkins, 1997)。 P-glycoprotein (P-gp)存於人類正常黏膜組織器官上，包括 肝臟、腦、腎臟、小腸表皮細胞等器官之 apical 端，屬於穿膜蛋白的一種，

與 ATP 結合排出油溶性及帶正電的藥物 (Thiebaut et al., 1987; Hunter et al., 1993; Gutmann et al., 1999)。 P-gp 會將代謝產物或是原形藥排入腸腔中而不 被吸收。由 Fig. 26 指出，藥物投予生物體內後，在腸內會經由 CYP3A4 轉 化為代謝產物，或其原形藥物經 P-gp 蛋白排出腸腔。芝麻酚經口服投予時，

CYP 3A4 會將其去烴基化而形成代謝產物 (Kumagai et al., 1991)。目前並無 芝麻酚為 P-gp 受質之文獻報導。文獻指出，非離子性界面活性劑 PEG 400 在腸內會抑制 CYP 3A4 (Watkins et al., 1997; Johnson et al., 2002)。然而以 PEG 400 為溶媒時，反而沒有芝麻酚原形分子，顯示 PEG 400 對 CYP3A4 之抑制無法解釋兩種溶媒間的差異。

Fig. 26

(Watkins et al., 1997)

芝麻酚以 PEG 400 及蒸餾水為溶媒皆呈現良好之生體可用率。接著 以多次投予方式探討芝麻酚於穩定狀態之動力學。經口服七次 50 mg/kg 芝麻酚後，其血清中 sesamol、sesamol sulfate 及 sesamol glucuronide 之 濃度與平均濃度經時變化圖如 Table 43~45 及 Fig. 8 所示。Sesamol、

sesamol sulfate 及 glucuronide 之動力學參數如 Table 46~48 所示。芝麻酚 長期給藥後 sesamol sulfate 之 Cmax、AUC0-2880、MRT0-2880明顯高於 sesamol 及 sesamol glucuronide，且達到統計上之意義，如 Table 49 所示，

顯示芝麻酚經長期口服後，大多以結合態代謝物存在於體循環中，以芝麻 酚硫酸結合態代謝物為主要代謝產物。

芝麻酚單次口服與多次口服之動力學參數比較，如 Table 50 所示。

結果顯示單次口服後芝麻酚原形分子之 Cmax及 AUC0-2880明顯高於多次 口服，多次口服给予芝麻酚後，原形分子的 Cmax與 AUC0-2880明顯低於 單次口服，推測可能原因為長期給予芝麻酚促進體內代謝酶之代謝，但硫 酸結合態代謝物及葡萄糖醛酸結合態代謝物之暴露，則兩種口服方式間無 明顯差異。

二、芝麻酚血清代謝物清除自由基活性之評估 (一) 芝麻酚血清代謝物清除 DPPH 之活性評估

DPPH 為一穩定自由基，已有體外研究利用 DPPH 評估芝麻及芝麻 酚之清除自由基活性 (Brand-Williams et al., 1995; Sanchez-Moreno et al., 1998; Espin et al., 2000; Joshi et al., 2005; Suja et al., 2004; 2005)，證實芝麻 酚具良好之抗自由基作用，但未有針對芝麻酚代謝物之活性評估。本實驗 欲暸解芝麻酚口服經體內代謝後，其代謝產物是否能有效清除自由基，並 比較芝麻酚原形分子與其代謝物間清除 DPPH 活性之差異。

本研究利用芝麻酚代謝物、芝麻酚及抗壞血酸溶液與 DPPH 反應，

並以空白血清及 PBS 為對照組，以波長 517 nm 偵測，結果如 Table 51~52 及 Fig. 9 所示，吸光值越低者表示清除 DPPH 的活性越高。結果 顯示，未經固相萃取前處理之芝麻酚血清代謝物 (含 sulfate/glucuronide 310M/2 M)與相同條件製備之空白血清比較，在生理濃度及一半之濃 度下，皆具清除自由基之活性，芝麻酚代謝物濃度越低，清除自由基的活 性越差 (Fig. 9-(a))。另一組芝麻酚血清代謝物經由固相萃取前處理，去除 極性較低之芝麻酚原形分子及其他血清中低極性物質，結果顯示芝麻酚代 謝物 (含 sulfate/glucuronide 190M/1 M)具清除自由基之活性；但隨著 濃度降低，則清除自由基之活性下降 (Fig. 9-(b))。由 Fig. 9-(a)(b)指出，

芝麻酚代謝物在生理濃度下具清除自由基之活性。本研究尚探討芝麻酚代

謝物清除自由基活性之濃度依存性，結果如 Table 53~54 及 Fig. 10 所 示。芝麻血清代謝物與空白血清比較，清除自由基之活性隨濃度的增加而 顯著增強，於生理濃度及 80%生理濃度下之抗自由基活性具統計意義。

謝物清除自由基活性之濃度依存性，結果如 Table 53~54 及 Fig. 10 所 示。芝麻血清代謝物與空白血清比較，清除自由基之活性隨濃度的增加而 顯著增強，於生理濃度及 80%生理濃度下之抗自由基活性具統計意義。