實驗方法

第二節 實驗方法

1. 鹽酸川芎嗪在血漿檢品之 HPLC 定量分析方法 A. HPLC 分析條件

層析管(Column) Merck LiChrospher 100 RP-18e column (125 x 4mm) endcapped, (5 μm)

保護管柱(Pre-column) Merck LiChrospher l00 RP-18 endcapped, (5 μm)

檢測波長 UV 280 nm 流速 1.0 ml/min 注入量 50 μl 分析時間 10 min

移動相 MeOH : H2O =50:50 內部標準品 7-hydroxycoumarin

B. 血漿檢品之前處理

精 確 量 取 血 漿 檢 品 200 μl 置 入 試 管 中 ， 加 入 20 μl 之 7-hydroxycoumarin 內部標準品，以試管振盪器振盪 30 秒充分混 合後，再加入1800 μl 乙腈，以試管振盪器振盪 60 秒充分混合後 使血漿中蛋白質沉澱。以離心機於4000 rpm 離心 20 分鐘後，以

微量吸管吸取上清液180 μl，注入 50 μl 於 HPLC 分析。

C. 檢量線之製作

以微量移液管精取空白血漿 180 μl，分別加入濃度 400 至 0.8 μg/ml 之 TMP HCl 溶液 20 μl 均勻混合，即得濃度為 40 至 0.08 μg/ml 之 標 準 血 漿 檢 品 液 。 再 加 入 濃 度 為 0.5 mg/ml 之 7-hydroxycoumarin 內部標準品 20 μl 以試管振盪器振盪 30 秒充 分混合後，再加入180 μl 乙腈，以試管振盪器振盪 60 秒充分混 合後，使血漿中蛋白質沉澱。以離心機於4000 rpm 離心 20 分鐘。

隨即以微量吸管吸取上清液180 μl 至小瓶(vial)中，注入 50 μl (可 以增加UV 檢測器再低濃度的零敏度) 於 HPLC 分析。由圖譜所 得之TMP HCL 與 7-hydroxycoumarin 波峰之面積比與理論濃度作 線性回歸以製作檢量線。

表4. 鹽酸川芎嗪標準濃度血漿檢品溶液之製備

A. 回收率試驗(Recovery)

鹽酸川芎嗪(TMP HCl)溶液分別添加在等體積的空白血漿和空白 溶液(water)中，目的在比較經血漿檢品之前處理步驟後檢出量之差 異。實驗步驟如同校正曲線製作中對檢品的處理過程。回收率可由下 列公式求得：

Plasma standard peak area ratio

Recovery(%) = --- ^╳ 100%

Methanol standard peak area ratio

B. 精確性(Accuracy)試驗

為了確認鹽酸川芎嗪(TMP HCl)定量方法的精確性，因此做同日內 (Intraday)及間日內(Interday)的精確性比較。

1. 同日內試驗(Intraday test)

以不同濃度之含鹽酸川芎嗪(TMP HCl)標準濃度血漿檢品，分別於 同一日的早上、中午 、晚上各取 20 μl 濃度為 400、200、2 μg/ml 之 TMP HCl 標準液，加入 180 μl 之空白血漿中，振盪 30 秒混合均勻，

即得濃度為40、20、0.2 μg/ml 之 TMP HCl 血漿檢品(n=3) ，計算各 個校正濃度之平均值(Mean)、標準偏差(S.D.)、變異係數(C.V.)。

2. 間日內試驗(Interday test)

以不同濃度之含TMP HCl 標準濃度血漿檢品，分別於不同天的早 上、中午、晚上各取20 μl 濃度為 400、200、2 μg/ml 之 TMP HCl 標 準液，加入180 μl 之空白血漿中，振盪 30 秒混合均勻，即得濃度為 40、20、0.2 μg/ml 之 TMP HCl 之血漿檢品(n=3) ，計算各個校正濃 度之平均值(Mean)、標準偏差(S.D.)、變異係數(C.V.)。

F. 靈敏度試驗(Sensitivity)

分析過程中，為找出能和背景濃度相區分的分析物最低濃度，將 依標準濃度血漿檢品製備方法，將其濃度重複稀釋至HPLC 可以偵測 的最低濃度，即標的物之訊號對雜訊之比值(S/N)為 3:1 時，稱為最低 可偵測濃度(Limit of Detection, LOD)。最低可定量濃度(Limit of Quantitation, LOQ)，依前述同檢量線製作，採標準濃度血漿檢品製備 方法，取六次檢品分析測其精準度。

G. 安定性試驗

(1) -30 ℃下鹽酸川芎嗪(TMP HCl)在家兔血漿中之安定性試驗 取20 μl 濃度為 400、200、100 μg/ml 之 TMP HCl 標準液，加 入180 μl 之空白血漿中，振盪 30 秒以混合均勻，即得濃度為 40、20、

10 μg/ml 之 TMP HCl 血漿檢品，將其分裝後置於-30℃的冷凍櫃中，

於第0、1、3、6、10、15、21 天分別取出 1 組檢品(n=3)。解凍後，

依血漿檢品之前處理方法處理後，以HPLC 分析，並紀錄濃度變化之 情形。

(2) 25 ℃下鹽酸川芎嗪(TMP HCl)在家兔血漿中之安定性試驗 取20 μl 濃度為 400、200、100 μg/ml 之 TMP HCl 標準液，加 入180 μl 之空白血漿中，振盪 30 秒以混合均勻，即得濃度為 40、20、

10 μg/ml 之 TMP HCl 血漿檢品，將其分裝後置於室溫 25 ℃下，於 第0、1、3、6、12、24、48 小時分別取出 1 組檢品(n=3)。依血漿檢

品之前處理方法處理後，以HPLC 分析，並紀錄濃度變化之情形。

2. 鹽酸川芎嗪(TMP HCl)在家兔體內之藥物動力學實驗

A. 實驗設計

取雄性家兔六隻，體重介於 3.0 至 4.5 公斤之間，每隻家兔以蛇床子 標準溶液靜脈注射投藥。實驗家兔之重量、給藥順序及劑量標示於下 表，每次給藥後至下次給藥，時間須相隔一週以上。

表5. IV 實驗家兔之體重(N=6)

Rabbit NO.

給藥劑量

NO.1 NO.2 NO.3 NO.4 NO.5 NO.6

20 mg/kg 4.0 3.9 4.0 3.3 3.4 3.8 Weight

(kg) 40 mg/kg 4.0 4.1 4.1 4.3 3.9 4.3

表6. 實驗家兔之劑量

一倍 二倍

鹽酸川芎嗪指

標成分注射液 20 mg/kg 40 mg/kg

B. 給藥法及檢品處理

IV 投予鹽酸川芎嗪

於實驗前，家兔先禁食 24 小時；實驗時，家兔先秤重紀錄實際 體重以便配製給藥劑量。將兩耳之毛剔除後關入限制籠內，接著以燈 泡照射兔耳使其兔耳血管擴張，再以酒精棉消毒並助血管擴張，隨即 插入靜脈置留針，將針塞(Injection plug)注滿肝素鈉溶液後，固定於 靜脈留置針上，每次採血後均由針塞注入25 I.U./ml 之肝素鈉溶液，

以防靜脈置留針內之血液凝固。

投藥前先抽取 1 ml 之空白血液。靜脈注射給藥時由另一耳投藥 後，分別於投藥後5、10、15、20、30、40、60、90、120、150、180、

210、240、270、300 分鐘由靜脈置留針之針塞抽取 1ml 血液，置於 真空採血管中，以4000 rpm 轉速離心 20 分鐘後取出上清液，隨即保 存於-30 ℃之冷凍櫃中。

PO 投予鹽酸川芎嗪

於實驗前，家兔先禁食 24 小時；實驗時，家兔先秤重紀錄 實際體重以便配製給藥劑量。將兩耳之毛剔除後關入限制籠內，接著 以燈泡照射兔耳使其兔耳血管擴張，再以酒精棉消毒並助血管擴張，

隨即插入靜脈置留針，將針塞(Injection plug)注滿肝素鈉溶液後，固 定於靜脈留置針上，每次採血後均由針塞注入25 I.U./ml 之肝素鈉溶 液，以防靜脈置留針內之血液凝固。

表7.口服投予鹽酸川芎嗪之家兔體重

Rabbit NO.

給藥劑量

NO.1 NO.2 NO.3 NO.4 NO.5 NO.6

Weight (kg)

50 mg/kg 4.0 3.9 4.0 3.3 3.4 3.8

投藥前先抽取 1 ml 之空白血液。口服給藥時以餵藥器由口腔避 開氣管進入胃部後投藥，分別於投藥後5、10、15、20、30、40、60、

80、100、120、150、180、210、240 分鐘由靜脈置留針之針塞抽取 1ml 血液，置於真空採血管中，以 4000 rpm 轉速離心 20 分鐘後取出 上清液，隨即保存於-30 ℃之冷凍櫃中。

血漿檢品之前處理，檢量線及分析條件均依前述方法操作，鹽酸 川芎嗪之濃度則由標準曲線經內插法推算而得。

C. 數據處理

各種給藥法所取得的血漿檢品經HPLC 法定量後，依據標準曲線 換 算 鹽 酸 川 芎 嗪(TMP HCl) 之 血 中 濃 度 數 據 後 ， 利 用 電 腦 程 式 WINNONLIN 計算，分別利用配適後的分室模式的藥物動力學理論來 計算相關的藥物動力學參數。