第四章 材料與方法 第一節 實驗材料
第三節 實驗方法
一、外觀性狀鑑別
以眼、鼻、口、手等感覺器官配合尺規工具觀察市售品檢體之形 狀、大小、氣味及顏色等，對藥材與飲片之性狀特徵鑑別。
二、顯微組織鑑別 (一) 標準藥材
利用組織切片法以顯微鏡觀察植物解剖和細胞學的形態特徵來 鑑定其基原
1、脫水滲蠟
將乾燥之藥材先以水浸漬，偶而用超音波震盪器震盪（Branson, Type-5210, USA），至藥材潤軟為止，以銳利刀片橫切藥材約大 小約0.5×0.5cm2之檢品，放入滲蠟盒中，移入脫水滲蠟機（Sakura, Tissue-Tek® VIP, Japan）進行脫水滲蠟，步驟如下：50%酒精（1 小時）→70%酒精（1 小時）→80%酒精（1 小時）→90%酒精（1 小時）→95%酒精（1 小時，2 次）→99.5%酒精（1 小時，2 次）
→Xylene（1 小時，2 次）→Paraffin（68℃溶融，2 次）。
2、石蠟包埋、切片、染色及封片
脫水滲蠟完成後，以石蠟包埋機（Thermolyne, Histo-Center II-N, USA）進行人工之石蠟包埋，再以滑動式切片機（Sakura, IVS-410, Japan）切成 6∼8µm 厚度之組織切片，將切片放置在載玻片上，
先放入烘箱（Eyela, NDO-450ND, Japan），在 45℃乾燥半小時，
之後進行人工之脫蠟染色，步驟如下：Xylene（30 秒，3 次）
→99.5%酒精（30 秒，3 次）→95%酒精（30 秒，2 次）→Hematoxylin
（6 分鐘）→水洗十分鐘→Eosin（2 分鐘）→95%酒精（15 秒，
2 次）→99.5%酒精（15 秒，3 次）→Xylene（15 秒，3 次）→
以自動封片機（Sakura, CoverAid, Japan）機器封片。將組織切片 放在光學顯微鏡（Nikon, E-400, Japan）下鏡檢，並紀錄及描述 組織特徵。Hematoxylin-Eosin 可將組織染呈紫紅色色調，此外，
亦可用Toluidine Blue 將組織染成淡藍深藍色。
(二) 、土茯苓、萆薢粉末鑑別
將藥材與飲片檢體粉碎之粉末，置於載玻片上，滴加 glycerin water (1：1)，再滴入少許碘化鉀試液，探針徐徐和粉末均勻混合，蓋 上蓋玻片，置於顯微鏡下鏡檢。
三、土茯苓、萆薢紫外光譜鑑別
1、稱取土茯苓、萆薢藥材 0.5g，加入 20mL 甲醇，超音波震盪 60 分鐘，過濾。
2、取濾液稀釋至適當濃度，於 200-400 nm 範圍內掃描。
四、薄層層析鑑別 (一) 木通、防己
1、馬兜鈴酸之檢測
(1) 對照標準品溶液之調製：取馬兜鈴酸標準品 2mg，加入甲醇 至10mL，供作對照標準品溶液。
(2) 檢液之調製：將木通與防己市售品研成粉末，取粉末 1.0g，
加入5mL 甲醇，超音波震盪 90 分鐘，過濾，供作檢液。
(3) 薄層層析條件
層析板：Silica gel 60 F254
展開溶媒：甲苯：醋酸乙酯：水：冰醋酸 (20：10：1：1 v/v) 上層溶液
點注量：5µL 展開距離：10 cm
(4) 檢出方法：於紫外光 254 nm、366nm 下檢測。
2、粉防己鹼之檢測
(1) 對照標準品溶液之調製：取粉防己鹼標準品 2mg，加入氯仿 至10mL，供作對照標準品溶液。
(2) 檢液之調製：將防己市售品研成粉末，取粉末 3.0g，加入 10mL 氯仿，超音波震盪 90 分鐘，過濾，供作檢液。
(3) 薄層層析條件
層析板：Silica gel 60 F254
展開溶媒：正己烷：乙酸乙酯：Dimethylamine(5：4：1 v/v) 點注量：5µL
展開距離：10 cm
(4) 檢出方法：於紫外光 254 nm 下檢測。
(二) 土茯苓、萆薢
1、Diosgenin、土茯苓薄層層析
(1) 檢液之調製：稱取藥材粉末 1.0g，加入 5mL 甲醇，超音波震 盪90 分鐘，過濾，供作檢液。
(2) 薄層層析條件
層析板：Silica gel 60 F254
展開溶媒：正己烷：乙酸乙酯 (9：1 v/v) 正己烷：乙酸乙酯 (4：1 v/v) 氯仿：甲醇：水(7：3：0.5 v/v) 點注量：5µL
展開距離：10 cm
(3) 檢出方法：各於可見光、紫外光 254 nm、366 nm 下檢測。
2、土茯苓藥材薄層層析：
(1) 檢液之調製：稱取藥材粉末 1.0g，加入 5mL 乙醇，超音波震 盪90 分鐘，過濾，供作檢液。
(2) 薄層層析條件
層析板：Silica gel 60 F254
展開溶媒：氯仿：甲醇：水(7：3：0.5 v/v) 點注量：5µL
展開距離：10 cm
(3) 檢出方法：於紫外光 366 nm 下檢測。
(1) 檢液之調製：稱取藥材粉末 1.0g，加入 5mL 乙醇，超音波震 盪90 分鐘，過濾，供作檢液。
(2) 薄層層析條件
層析板：Silica gel 60 F254
展開溶媒：氯仿：醋酸乙酯 (4：1 v/v) 點注量：5µL
展開距離：10 cm
(3) 檢出方法：噴 H2SO4：H2O(1：1)，105℃加熱 5 分鐘 於紫外光 366 nm 下檢測。
五、土茯苓顯色反應
(1) 檢液之調製：稱取土茯苓藥材粉末 1.0g，加入 5mL 乙醇，沸 水浴2 分鐘，過濾，供作檢液。
(2) 點注 5µL 於濾紙上待乾
(3) 檢出方法：於紫外光 366 nm 下檢測。
六、土茯苓濾液顯色反應
(1) 檢液之調製：稱取土茯苓藥材粉末 1.0g，加入 5mL 乙醇，沸 水浴 2 分鐘，過濾，
取 0.5 mL 加入一滴濃鹽酸，水浴 1 分鐘，觀察濾液顏色。