實驗方法

2.2.1 冷凍細胞活化

冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞 造成傷害，導致細胞之死亡。細胞活化後，約需數日，或繼代一至二 代，其細胞生長或特性表現才會恢復正常﹙例如產生單株抗體或是其 他蛋白質﹚。自液氮或乾冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，

由於熱脹冷縮過程，此時蓋子易鬆掉。取出冷凍管，立即放入 37℃

水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 3 分鐘內全部融化，以 70% 酒 精擦拭保存管外部，移入無菌操作台內。取出解凍之細胞懸浮液，緩 緩加入有培養基之培養容器內 (稀釋比例為 1:10，混合均勻，放入 CO2 培養箱培養。在解凍培養後隔日更換培養基。

2.2.2 細胞冷凍保存

欲冷凍保存之細胞應在生長良好﹙log-phase﹚且存活率高之狀態 下，約為80％-90％緻密度。注意冷凍保護劑之品質。DMSO 應為試 劑級等級，無菌且無色﹙以0. 22 micron FGLP Telflon 過濾或是直接 購買無菌產品﹚，以 5~10 ml 小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解 凍。冷凍保存之細胞濃度：5~10×10⁶ cells/ml。冷凍保護劑濃度為 10％ DMSO。冷凍前一日前更換半量或全量培養基，觀察細胞生長 情形。配製冷凍保存溶液（使用前配製）：將 DMSO 加入新鮮培養基

中，最後濃度為 5％，混合均勻，置於室溫下待用。取少量細胞懸浮 液（約 0. 1 ml）計數細胞濃度及凍前存活率。離心，去除上清液，加 入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1-5×10⁶ cells/ml，混合均勻，

分裝於已標示完全之冷凍保存管中，1 ml/vial。冷凍保存方法：冷凍 管置於4℃ 10 分鐘、-20℃ 30 分鐘、-80℃ 16-18 小時 （或隔夜），

最後以液態氮槽長期儲存。

2.2.3 細胞培養

實驗所使用的細胞株

2.2.3.1 人類單核球白血病細胞 HL-CZ (human promonocytic leukemia cells)

培養條件：RPMI-1640 (Rosewell Park Memorial Institute, HyClone) 10

％ FBS (fetal bovine serum)、Penicillin

-Streptomycin solution (HyClone)，250 ug/ml Amphotericin (Sigma)，置 於 5％ CO2、37℃恆溫培養箱。

2.2.3.2 人類肺腺癌細胞 A549 (human lung carcinoma cell)

培養條件：DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium)

10％ FBS (fetal bovine serum)、Penicillin-Streptomycin solution

(HyClone)，250 ug/ml Amphotericin (Sigma)，置於 5％ CO2、37℃恆 溫培養箱

2.2.3.3 狗腎細胞 MDCK (Madine Darby canine kidney)

培養條件：DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium)

10％ FBS (fetal bovine serum)、Penicillin-Streptomycin solution

(HyClone)，250 ug/ml Amphotericin (Sigma)，置於 5％ CO2、37℃恆 溫培養箱。

2.2.4 病毒的增幅放大

流行性感冒病毒 (IAV) 利用貼附細胞 MDCK 當作病毒的宿主細 胞。當MDCK 細胞長到單層八九分滿時，將培養液置換為不含胎牛 血清、2 ％trypsin 的 DMEM，加入 IAV 使其感染 MDCK 細胞，34℃

恆溫培養箱培養。病毒感染2-3 天後觀察細胞是否有細胞病理形態 (Cytopathoc effect, CPE)產生，待細胞 CPE 達 80％以上，收集含病毒 之培養液，離心 3000rpm；10 分鐘以去除細胞碎屑，上清液以每管 0.5 ml 分裝，並儲存於-80℃並以病毒蝕斑測其病毒價數。

2.2.5 病毒蝕斑(plaque assay)

A 型流感病毒(IAV PR8 strain)利用貼腹細胞 MDCK 當作病毒的 宿主細胞。當MDCK 細胞再 6-well plate 長到單層八九分滿時，將培 養液置換為不含胎牛血清、2 ％trypsin 的 DMEM，加入序列稀釋病 毒液 IAV 200 ul (兩重複)，34℃、5％ 恆溫培養箱培養，每 15 分鐘

清搖 6-well plate 使病毒液散布均於。作用一小時後加入覆蓋液(3％

洋菜膠agarose 以 1：9 的比例混合不含胎牛血清、2 ％trypsin 的 DMEM)每格 2 ml，34℃、5％ 恆溫培養箱培養，72 小時後加入奈酚 藍黑染色劑染色 12 小時，以水柱沖掉覆蓋液並晾乾，依稀釋倍數計 數病毒效價以 pfu/ml (plaque forming unit/ml)表示。

2.2.6 細胞週期分析

病毒感染細胞－流式細胞儀（Flow Cytometry Assay）

實驗步驟：準備A549 & HL-CZ 細胞 1×10⁶ 個/well，將培養基置換 為不含胎牛血清、0.5％ trypsin 的 DMEM，後加入 2 ul 20 ng/ml、1ul 200 ng/ul rhTRAIL (recombinant human TRAIL)以及感染 IAV

(MOI= 1)，分別作用 24, 48 小時後，將細胞以 trypsin 打下 (A549) 及 磷酸鹽溶液 PBS (Phosphate buffer saline) 清洗離心 (1200rpm，3 分 鐘) 2 次，去除多餘的 PBS。加入 2-3ml 70％酒精進行細胞固定，放 置在-20℃冰箱存放。將細胞取出離心 1200rpm，3 分鐘，之後去除上 清液，再加入 1X PBS 將殘留的酒精洗淨，再離心 1200rpm，3 分鐘，

去除多餘上清液，加入 propidium iodide（PI）染劑 (25μl PI（1mg/ml）， 0.5μl RNase（10mg/ml）於 500μl PBS 中)視細胞數多寡而定。移至 Falcon 管，37℃避光靜置 30 分鐘後，使用流式細胞儀測定結果。

原理：Propidium iodide (PI)；是一種螢光染劑，可專一性的鍵結核酸

而廣泛應用於流式細胞儀的技術中，正常情況下的細胞細胞膜為持完 整，使PI 無法穿透細胞之細胞膜，故可以併入其他實驗 (如：可與 FITC 標記的 Annexin V、抗體)共同偵測，凋亡細胞或細胞內特定蛋 白的含量) 或其他染劑共同使用，評估細胞存活狀態。將細胞以酒精 打洞固定後，PI 進入細胞內可與核酸鍵結，利用流式細胞儀 (Flow cytometry FACS) 偵測產生的螢光強弱，則可以反映細胞內 DNA 倍 體的含量。

2.2.7 Annexin V-FITC & PI 染色

本實驗使用 Annexin V-FITC apoptosis detection kit I (BD)

實驗步驟：準備A549 & HL-CZ 細胞 1×10⁶ 個/well，將培養基置換 為不含胎牛血清、0.5％ trypsin 的 DMEM，後加入 2 ul 20 ng/ml、1ul 200 ng/ul rhTRAIL (recombinant human TRAIL)以及感染 IAV (MOI=

1)，分別作用 24, 48 小時後，將細胞以 trypsin 打下 (A549) 及磷酸 鹽溶液 PBS (Phosphate buffer saline) 清洗 (離心 1200rpm，5 分鐘) 2 次。去除多餘的PBS，再用 1× Binding Buffer 緩衝液製成 1×10⁶ cell/ml 的懸浮液。各取樣 100 ul 細胞懸浮液於 Falcon 式管中。加 入適量體積的Annexin V 與核酸染料：螢光標記 Annexin V-FITC 5 ul、PI 核酸染料 5ul。輕搖混勻，室溫下避光靜置作用 15 分鐘。各 個試管中分別加入 1× Binding Buffer 緩衝液 400 ul。於一個小時

內，使用流式細胞儀測定結果。

原理：細胞凋亡早期細胞膜會發生改變，Phosphotidyl Serine (PS) 磷 脂從細胞膜內轉移到細胞膜外，Annexin V 是一種 Ca++依賴的磷脂結 合蛋白，具有 PS 專一結合的特性，可做為探針來檢測暴露再細胞膜 表面的PS。然而 PS 轉移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可能發生 在壞死的細胞上。

早期凋亡細胞對所有用於細胞活性鑑定的染料 (如 PI) 有抗染性，壞 死細胞則不能。細胞膜損傷的細胞，其DNA 可與 PI 結合而產生紅 色螢光；而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色螢光產生。因此早期 細胞凋亡細胞，並不會與PI 作用，所以沒有紅色螢光序號產生；正 常細胞與此相似。

2.2.8 活性氧化物測定(ROS)

實驗步驟：準備A549 細胞 1×10⁶ 個/well，將培養基置換為不含胎 牛血清、0.5％ trypsin 的 DMEM，感染 IAV (PR8) MOI= 1 作用 24 小時後，每間隔 30 分鐘加入 1ul 200 ng/ul rhTRAIL (recombinant human TRAIL)，2 小時後，將各個時間點細胞以 trypsin 打下及磷酸 鹽溶液 PBS (Phosphate buffer saline) 清洗 (離心 1200rpm，5 分鐘) 2 次。去除多餘的PBS，加入 DCFH-DA 染劑 (1 μl DCFH-DA（10μΜ）

於500μl PBS 中) 視細胞數多寡而定。移至 Falcon 管，37℃避光反應

30 分鐘後，使用流式細胞儀測定結果。

原理：免疫細胞進行需氧性滅菌過程中，會在細胞內啟動一連串的氧 化還原反應，而產生一些氧化代謝物 (Oxidative Metabolites)，如 H2O2、O2- 自由基。可藉由 DCFH-DA 染劑，滲透細胞膜特異性的追 蹤評估ROS 的生成量。DCGH-DA 會被細胞內的乙醯酯酶

(acetylcholinestases) 去乙醯化 (deacetylated) 成非螢光性的 DCFH，

然而DCFH 會在細胞內被 H2O2氧化成具螢光性質的 DCF，並聚集在 粒線體中，因此散發出的螢光則可反映出細胞內H2O2的含量

2.2.9 粒線體膜電位測定(MMP)

實驗步驟：準備A549 細胞 1×10⁶ 個/well，將培養基置換為不含胎 牛血清、0.5％ trypsin 的 DMEM，後分別加入 2 ul 20 ng/ul、4 ul 20 ng/ul、6 ul 20ng/ul、1ul 200 ng/ul rhTRAIL (recombinant human TRAIL) 以及感染 IAV (PR8) MOI= 1，分別作用 24 小時後，將細胞以 trypsin 打下及磷酸鹽溶液 PBS (Phosphate buffer saline) 清洗離心

(1200rpm，3 分鐘) 2 次，去除多餘的 PBS。加入 DioC6 染劑 (10μl DioC6

（400μΜ）於 500μl PBS 中) 視細胞數多寡而定。移至 FACS 管，37℃

避光反應30 分鐘後，使用流式細胞儀測定結果。

原理：DioC6 (3,3’-Dihexyloxacarbocyanine iodide)，為綠色螢光 (green fluorescent)之陽離子親脂性染劑 (cationic dye)；又稱為細胞膜電位探

針。可穿透細胞膜、專一性的結合並累積在細胞粒線體中，DioC6 在 細胞內外的分佈可反應出細胞膜內外的電位差，藉由其螢光強度的改 變就可顯示細胞膜電位改變的情形。在不需要固定細胞或其他處理的 情況下可以即時、快速的偵測活細胞內粒線體膜電位。粒線體功能不 良 (mitochondria dysfunction) 通常伴隨在早期細胞凋亡時，因此細胞 膜電位的改變也因此當作早其凋亡偵測上的指標。

2.2.10 細胞 RNA 抽取(extraction of cell total RNA)

細胞 RNA 萃取實驗使用 PureLink TM Micro-to-Mini Kit Total RNA Purification System (invitrogen)。

先準備A549 細胞 1×10⁶ 個/well，將培養基置換為不含胎牛血清、

0.5％ trypsin 的 DMEM，後加入 1ul 200ng/ul rhTRAIL (recombinant human TRAIL)以及感染 IAV (PR8) MOI= 1，分別作用 0, 24, 48 小時 後，將細胞以 trypsin 打下及磷酸鹽溶液 PBS (Phosphate buffer saline) 清洗三次，換為1. 5 ml 微量離心管，離心 2000 g； 5 分鐘，去除上 清液。各加入 0.3 ml 含 1％ 2-Mercaptoethonal 的 RNA Lysis buffer (2-Mercaptoethonal：RNA Lysis solution = 1：100)，用空針 syring 數 次後，離心 2600 g；5 分鐘取上清液，加入新的 1.5 ml 微量離心管中。

加入與上清等體積的 70％ ethanol 混合均勻，加入 spin cartridge 中 (spin cartridge 已經去 RNase 處理，拿取要在 flow 中進行)，離心

12000 g；2 分鐘去下層液。加入 Wash Buffer I 0.7 ml 離心 12000 g；

2 分鐘去下層液 (重複兩次)，Wash Buffer II 0.5 ml 12000 g；2 分鐘去 下層液 (重複兩次)。最後再離心 12000 g；2 分鐘，去除殘留的 Wash Buffer II。將 colum 換至新的微量離心管，加入 RNase-free Water 30 ul，靜置 5 分鐘後，離心 12000 g；2 分鐘。萃取出來的 RNA 先轉 cDNA，剩餘的 RNA 放置 - 80℃冰箱保存。

2.2.11 病毒 RNA 抽取(extraction of virus RNA)

病毒 RNA 萃取實驗使用 QIAamp○^R Viral RNA Mini Kit (QIAGEN)先 準備A549 & HL-CZ 細胞 1×10⁶ 個/well，將培養基置換為不含胎牛 血清、0.5％ trypsin 的 DMEM，後加入 1ul 200ng/ul rhTRAIL (recombinant human TRAIL)以及感染 IAV (PR8) MOI= 1，分別作用 0, 24, 48, 72 小時後，各別收取病毒液保存 –80℃冰箱保存。解凍保 存於 –80℃冰箱各個時間點 IAV (PR8)病毒液，取 140 ul 病毒液加入 含有1％ carrier RNA 的 AVL 560 ul，震盪 15 秒鐘；靜置室溫(15-25℃) 下10 分鐘。加入 (96-100％) 酒精，震盪 15 秒鐘；靜置室溫(15-25℃) 下15 分鐘。加入 spin cartridge 中 (spin cartridge 已經去 RNase 處 理，拿取要在 flow 中進行)，離心 6000 g (8000 rpm)；3 分鐘去下層 液。加入 AW1 solution 500 ul 離心 6000 g (8000 rpm)；3 分鐘去下層 液，AW2 solution 500 ul 離心 6000 g (8000 rpm)；3 分鐘去下層液。

最後在離心 6000 g (8000 rpm)；3 分鐘，去除殘留的 AW2 solution。

將colum 換至新的微量離心管，加入 AVE buffer 60 ul，靜置 5 分鐘 後，離心 6000 g (8000 rpm)；2 分鐘。萃取出來的 RNA 先轉 cDNA，

剩餘的RNA 放置 - 80℃冰箱保存。

2.2.12 逆轉錄酶-聚合酶連鎖反應(RT-PCR)

逆轉錄酶-聚合酶連鎖反應(RT-PCR)實驗使用 Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen)

2,2,12,1 Virus RNA

解凍保存於 -80℃ 冰箱的 IAV RNA，測量 OD260值以定量RNA，將 IAV RNA 的含量調整至 5ug，加入 RNase free water 將體基調整至 11 ul。在 PCR 反應器上，以 55℃加熱 15 分鐘。加入 10mM dNTP 混 合液 1 ul 與 5mM IAV forward primer 1 ul，後放置 65 ℃作用 10 分 鐘。插入冰上，依序加入5 倍的第一股反應緩衝液 (20mM Tris-HCl ph= 7.5，0.1mM EDTA，0.01％(V/V)NP-40，50％(V/V)glycerol 100mM MgCl2) 4 ul，0.1 mM Dithiothreitol (DTT) 2 ul，放置 42 ℃中平衡溫度。

2 分鐘後加入 1 ul 的逆轉錄酵素 SS III RT 200 U/ul，42 ℃中反應 80 分鐘進行第一股互補DNA(cDNA)合成。

2.2.12.2 Cell total RNA

解凍保存於 -80℃ 冰箱的細胞 RNA，測量 OD260值以定量RNA，將 細胞RNA 的含量調整至 5ug，加入 RNase free water 將體基調整至 11

ul。在 PCR 反應器上，以 55℃加熱 10 分鐘。加入 10mM dNTP 1 ul 與 Oligo dT primer (0.5 ug/ul) 1 ul，後放置 65 ℃作用 15 分鐘。插入 冰上，依序加入5 倍的第一股反應緩衝液 (20mM Tris-HCl ph= 7.5，

ul。在 PCR 反應器上，以 55℃加熱 10 分鐘。加入 10mM dNTP 1 ul 與 Oligo dT primer (0.5 ug/ul) 1 ul，後放置 65 ℃作用 15 分鐘。插入 冰上，依序加入5 倍的第一股反應緩衝液 (20mM Tris-HCl ph= 7.5，