TRAIL 促使 A 型流感病毒感染 A549 細胞之細胞凋亡分子機制

第三章、結果

3.2 TRAIL 促使 A 型流感病毒感染 A549 細胞之細胞凋亡分子機制

3.2.1 rhTRAIL 蛋白對 A 型流感病毒感染之 A549 及 HL-CZ 細胞活

性氧化物(ROS)產之影響

為了比較，rhTRAIL 對 A 型流感病毒感染之 A549 細胞加速誘導細胞凋亡，是否和ROS 產生有關。將感染 A 型流感病毒之 A549 及 HL-CZ 細胞，依不同時間點 (0 min、30 mins、60 mins、90 mins、120 mins) 分別給予 rhTRAIL 100 ng/ml，經 DCF-DA 特異性染色，觀察 ROS 生成的情形。(圖 11) 實驗結果，隨作用的時間增加，A 型流感病毒感染之A549 ROS 有上升的趨勢，在第 90 分鐘達到最高峰，隨之而逐漸下降。結果顯示，rhTRAIL 加速引發 A 型流感感染之細胞凋亡訊息的啟動路徑，和ROS 的產生有關。

3.2.2 rhTRAIL 蛋白對 A 型流感病毒感染之 A549 及 HL-CZ 細胞粒

線體膜電位(MMP)之影響

分別給予感染 A 型流感病毒之 A549 及 HL-CZ 細胞不同濃度(0 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml、60 ng/ml、100 ng/ml)的 rhTRAIL，作用 24 小時後，經 DiOC6 特異性染色，觀察膜電位變化的情形。若粒線體膜電位降低，則DiOC6 染劑結合較少，由此來檢測 A 型流感病毒感染之A549 細胞粒線體膜電位是否會因 rhTRAIL 的作用後產生變化，進而加速誘導細胞凋亡作用的發生。(圖 12) 結果顯示，當給以 A 型病毒感染之 A549 細胞不同濃度 rhTRAIL 蛋白，作用 24 小時後，

可發現隨濃度增加，A 型病毒感染之 A549 細胞粒線體膜電位逐漸下降。結果顯示，rhTRAIL 會加速引發 A 型流感感染之細胞凋亡訊息的啟動，導致膜電位的下降。

3.2.3 利用即時定量聚合酶連鎖反應分析 rhTRAIL 蛋白對 A 型流感

病毒感染的 A549 細胞之凋亡機制基因表現的影響

為了觀察，rhTRAIL 是否會影響 A 型流感病毒凋亡機制相關基因的表現。A 型流感病毒感染之 A549 細胞，給予 100 ng/ml rhTRAIL，

分別作用24 及 48 小時後，抽取細胞 total RNA，以 Real-time PCR 觀察凋亡相關基因表現的影響。(圖 14)為 ΔCt 值 =目標值(target) - Ct GAPDH；(圖 15)為 2^{- ΔΔCt} = 2 ^{– (ΔCt 24h}^、48h – Ct 0h)，24 及 48 小時測量數值

扣除0 小時測量數值。實驗結果，經病毒感染之細胞在 rhTRAIL 作用48 小時後，相較於僅有病毒感染之細胞，可發現凋亡相關的基因 AIF、caspase 3、caspase 8、caspase 9、Endo G，基因表現，mRNA 的表現量上升。結果顯示，rhTRAIL 促進 A 型流感病毒感染之 A549 細胞凋亡路徑基因的表現，選擇性加速被感染之細胞走向凋亡的途徑。

3.2.4 rhTRAIL 蛋白對 A 型流感病毒感染的 A549 細胞之凋亡蛋白表

現的影響

觀察 rhTRAIL 是否會影響 A 型流感病毒凋亡機制相關蛋白的表

現。A 型流感病毒感染之 A549 細胞，給予 100 ng/ml rhTRAIL，分別作用24 及 48 小時後以 trypsin 使細胞懸浮後，以 1200 rpm 離心 3 分鐘，將沉澱的細胞加入 lysis buffer，再以西方墨點法檢測蛋白的表現。

(圖 16)實驗結果，經 A 型流感病毒感染之細胞在 rhTRAIL 作用 48 小時後，可發現凋亡相關的蛋白caspase 3、caspase 8、caspase 9 表現量上升。結果顯示呼應即時定量聚合酶連鎖反應的結果，rhTRAIL 促進 A 型流感病毒感染之 A549 細胞凋亡路徑蛋白表現，選擇性加速被感染之細胞走向凋亡的途徑。

3.3 TRAIL 引發 A 型流感病毒感染 A549 細胞凋亡反應，對 A 型流感 病毒複製的影響

3.3.1 利用即時定量聚合酶連鎖反應觀察，rhTRAIL 蛋白的作用對 A

型流感病毒複製的影響(細胞外病毒顆粒)

rhTRAIL 引發 A 型流感病毒感染之細胞，加速走向細胞凋亡機制，是否會對於A 型流感病毒的複製造成影響。A 型流感病毒感染之A549 細胞，給予 100 ng/ml rhTRAIL，分別收集 24、48、72 小時後細胞培養液，抽取病毒RNA，以 Real-time PCR 測量 A 型流感病毒Matrix (M)蛋白核醣核酸(RNA)的表現量。(圖 17)實驗結果，A549 細胞的確可以幫助A 型流感病毒的複製，隨著時間點的增加 12、24、

48 小時，A 型流感病毒 Matrix mRNA Ct 值逐漸下降，表示 Matrix mRNA 表現量上升，病毒顆粒增加。而當給以 A 型流感病毒感染之 A549 細胞 TRAIL 蛋白，其中 12 至 24 小時數據顯示，TRAIL 蛋白加速A 型流感病毒的複製， 48 小時後，可發現 Matrix mRNA Ct 值上升，Matrix mRNA 表現量下降，病毒複製被抑制。rhTRAIL，加速 A 型流感感染之細胞走向凋亡途徑，且抑制A 型流感病毒在宿主細胞內複製。

3.3.2 利用病毒蝕斑觀察，rhTRAIL 蛋白的作用對 A 型流感病毒複製

的影響(細胞外病毒顆粒)

rhTRAIL 引發 A 型流感病毒感染之細胞，加速走向細胞凋亡機制，是否會對於A 型流感病毒的複製造成影響。A 型流感病毒感染

之A549 細胞，給予 100 ng/ml TRAIL，分別收集 0、12、24、48 小時後細胞培養液，序列稀釋後感染MDCK 細胞， 48 小時後計數產生的病毒蝕斑，依序列稀釋倍數計算病毒效價。(圖 18)結果顯示，A 型流感病毒經由12 至 24 小時的潛伏期後，在 24 至 48 小時釋放至細胞外。而當我們病毒感染同時給以TRAIL 蛋白作用，可觀察到病毒顆粒的釋放由原本的24 至 48 小時，提早到 12 至 24 小時，其釋放病毒顆粒的幅度隨著給予TRAIL 蛋白濃度的提高而增加。然而，24 至 48 小時抑制病毒複製的能力，亦隨著給予 TRAIL 蛋白濃度的提高而增加。

3.3.3 利用即時定量聚合酶連鎖反應及西方墨點法觀察，rhTRAIL 蛋

白對於 A 型流感病毒蛋白在細胞內複製的影響(細胞內病毒顆粒) rhTRAIL 引發 A 型流感病毒感染之細胞，加速走向細胞凋亡機制，是否對於細胞內A 型流感病毒蛋白的複製造成影響。A 型流感病毒感染之A549 細胞，給予 100 ng/ml rhTRAIL，分別收集 24、48 小時後的細胞，抽取細胞內total RNA 及蛋白，以 Real-time PCR 及 Western blot 測量 A 型 Nucleoprotein (NP)蛋白及核醣核酸(RNA)的表現量。(圖 19)結果顯示病毒感染細胞後，病毒蛋白 NP mRNA 在細胞內表現隨時間24、48 小時增加。然而，當我們病毒感染同時給予 TRAIL 蛋白作用，可觀察到病毒蛋白 NP mRNA，在 24 小時表現量

高於僅有病毒感染之細胞，但是48 小時的表現量卻低於僅有病毒感染之細胞。TRAIL 的作用前期，可幫助細胞內病毒蛋白基因的表現，

由於促使受病毒感染細胞凋亡，使細胞內病毒蛋白的表現受阻。

3.4 環孢靈素(Cyclosporine A)與 TRAIL 作用，對 A 型流感病毒感染 之 A549 細胞凋亡反應及 A 型流感病毒複製的影響。

3.4.1 利用流式細胞儀分析，Cyclosporin A 及 rhTRAIL 的作用下，

對 A 型流感病毒感染之 A549 細胞週期 Sub-G1 影響

將A549 細胞培養至 6 well 中，於培養液中分別加入 IAV PR8 (m.o.i=0.2) 、100 ng/ml rhTRAIL(rhT)、Cyclosporin A(Cs A) 5uM，八組不同組合: (1) Mock(2) Cs A(3) rhT(4) Cs A+rhT(5) IAV(6) IAV+Cs A(7) IAV+rhT(8) IAV+Cs A+rhT，48 小時之後將細胞收下，經由 PI 染色處理後利用流式細胞儀分析細胞週期。(圖 20)Sub-G1 細胞分佈百分比，正常A549 細胞：0.4％；Cs A 作用細胞：1.4％；rhT 作用的細胞：0.4％；rhT 及 Cs A：3.2％；IAV 感染的細胞：4.6％；IAV 及 Cs A：2.8％；IAV 及 rhT：8％；IAV、rhT、Cs A 三者作用細胞：16.4

％。結果間接證明 Cyclosporin A 與 TRAIL 的作用下，更加速了受 A 型流感病毒感染之細胞，走向細胞凋亡途徑。

3.4.2 利用 Annexin V-FITC 特異性染色檢測，rhTRAIL 蛋白與

Cyclosporin A 作用，對 A 型流感病毒感染之 A549 細胞凋亡分析

(圖 21) 凋亡細胞分佈 Q4 百分比，正常 A549 細胞：2.7％；Cs A 作用細胞：2.2％；rhT 作用的細胞：1.8％；rhT 及 Cs A：10.8；IAV 感染的細胞：3.7％；IAV 及 Cs A：3.6％；IAV 及 rhT：8.8％；IAV、rhT、

Cs A 三者作用細胞：24.6％。結果直接證明 Cyclosporin A 與 TRAIL 的作用下，更加速了受A 型流感病毒感染之細胞，走向細胞凋亡途徑。

3.4.3 利用即時定量聚合酶連鎖反應觀察，rhTRAIL 蛋白與

Cyclosporin 的作用對 A 型流感病毒複製的影響(細胞外病毒顆粒)

time PCR 測量各個時間點 Ct 值(圖 22A)，觀察細胞外病毒顆粒的釋放，了解IAV 複製的情形。(圖 22B)在 24 小時的結果顯示，當 Cyclosporin A 單獨與 A 型流感病毒感染之細胞作用，本身就可以抑制A 型流感病毒的複製。若同時給予 A 型流感病毒感染細胞 TRAIL 蛋白及Cyclosporin A，在 24 小時被 Cyclosporin A 抑制的病毒則有回升的趨勢，但是仍然低於TRAIL 所促進病毒複製的病毒價數。48 小時結果，被Cyclosporin A 抑制的病毒價數回升，同時給予 A 型流感病毒感染細胞TRAIL 蛋白及 Cyclosporin A，病毒價數仍然低於 TRAIL 所促進病毒複製的病毒價數。

第四章、討論

A 型流感病毒的感染，引發宿主細胞免疫機制的啟動，一些免疫

細胞如Macrophage、plasmacytoid dendritic cell (pDC)、CD 8⁺及 CD 4⁺ T cell 會產生 TRAIL 蛋白，迫使遭受感染的細胞走向程序性的死亡途徑 (Apoptosis)，抑制病毒的複製生長，避免病情的擴散。本研究討論主要探討TRAIL 蛋白使 A 型流感病毒感染細胞加速凋亡反應機制，以及TRAIL 蛋白對 A 型流感病毒複製的影響情形。

4.1 rhTRAIL 對不同細胞株感受性的差異及誘導凋亡程度的不同 為了觀察 rhTRAIL 對 A 型流感病毒感染之細胞所引起的細胞凋亡，本實驗我們利用人類肺癌細胞 A549 及前單核球細胞 HL-CZ，將實驗後細胞以PI 及 Annexin V 染色，利用流式細胞儀測量測量結果。

發現，rhTRAIL 皆可促進 A 型流感病毒感染之 A549 及 HL-CZ 細胞凋亡，但是引起凋亡的程度有所差異。試圖比較A549 及 HL-CZ 兩個不同細胞株，細胞週期Sub-G1 的變化(圖 3、8)以及早期凋亡指標 Annexin V 細胞的百分比(圖 5、10)，可發現當 A 型流感病毒感染時，

TRAIL 對於 A549 細胞的敏感性會大於 HL-CZ 細胞；易引起細胞凋亡反應。有文獻指出，人類器官組織中以肺臟、脾臟及前列腺，可以偵測到富含TRAIL 蛋白的表現(Wiley, Schooley et al. 1995)^[2]，並且可

經由干擾素(interferon)的刺激下所誘發。TRAIL 可經由 autocrine (自我接收自我所分泌的激素)及 paracrine (接收由別的細胞所分泌之激素)的方式與接受器結合，引發細胞凋亡程式(Nagao, Nakajima et al.

1999)^[55]。另外，我們利用即時定量聚合酶連鎖反應，發現正常情況下A549 細胞中 TRAIL 及 TRAIL 接受器 DR4、DR5 基因表現會比 HL-CZ 細胞來的活躍。接著我們以不同效價 A 型流感病毒，分別感染A549 細胞及 HL-CZ 細胞，以西方墨點法分析細胞內 TRAIL 蛋白的表現量，可發現在A549 細胞中 TRAIL 蛋白的表現量會大於

HL-CZ。以上種種的原因，可能是促使受病毒感染之 A549 細胞，對於TRAIL 蛋白感受性大於受病毒感染之 HL-CZ 細胞。因此，我們利用A549 細胞來探討往後的的實驗。

4.2 rhTRAIL 蛋白的作用，使 A 型流感病毒感染細胞 mRNA DR5、

Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9 現量上升

之前所提到的，A 型流感病毒的感染，會誘導宿主細胞啟動免疫

在文檔中 TRAIL促進A型流感病毒感染細胞之細胞凋亡研究; TRAIL Enhances Apoptosis of Influenza A Virus Infected Cells (頁 51-94)

第三章、 結果

3.2 TRAIL 促使 A 型流感病毒感染 A549 細胞之細胞凋亡分子機制

第四章、討論

第三章、結果