細胞凋亡(apoptosis)之研究

1.3.1 細胞壞死與細胞凋亡

細胞死亡之方式約略可分為二大類：細胞壞死（necrosis）及細 胞凋亡（apoptosis）。細胞壞死常見於一些急性的物理性或化學性的 傷害，進而造成細胞質與胞器之間的滲透壓不平衡，並導致細胞膜膨 脹破裂、細胞核和胞器瓦解、染色質被隨機切成不規則的碎片、細胞 內物質釋出，會誘導血液內淋巴球清除此類細胞碎片，因而引發一連 串 的 細 胞 發 炎 反 應 ， 最 後 導 致 整 個 區 域 的 細 胞 壞 死 。

“細胞凋亡”，是於 1972 年由 Kerr 等人根據觀察實驗所提出並將其 定義(Kerr, Wyllie et al. 1972)^[19]。目前已知細胞凋亡為一種單一細胞受 到刺激後，主動經由多種細胞內組成（cellular organosms） 來進行的 系統性自戕反應（systematic self-destruction）。其特徵包括：細胞萎 縮、染色質濃縮（chromatin condensation）、染色質在核中呈現邊緣化 現象，細胞內的DNA 被核酸內切酶以 180~200 bp 為單位切成小片 段並可在 DNA 電泳膠上形成 DNA 規則片段化的階梯狀（DNA ladder），以及凋亡小體 (apoptotic body) 的產生(Brown, Sun et al.

1993; Samali, Gorman et al. 1996)^{[20, 21]}。當凋亡小體產生後，此細胞即 被 鄰 近 細 胞 吞 噬 而 較 不 引 起 發 炎 反 應(Vaux and Strasser 1996;

Kroemer, Dallaporta et al. 1998)^{[22, 23]}。

1.3.2 細胞凋亡之意義

細胞凋亡與細胞壞死最明顯的差異是不會造成組織的發炎反 應。因此細胞凋亡才可以在生物中扮演調控生理機能這樣的角色。（1）

個體發育時的可塑性（developmental plasticity）及挑選最適細胞（the fittest cells）：發育學的一個通則是在某個組織形成時，一開始往往製 造數量過多的細胞，繼而再依據某種需求準則來選擇最後留存的功能 細胞。（2）細胞凋亡是塑造個體及器官形態的機制：例如人類發育時 尾椎消失、腸胃消化道的行成、到昆蟲的蛻變(metamorphosis)

等等的一切形態的形成。（3）原狀恆定(homeostasis)：個體要保持著 細胞數必須經由細胞增殖與細胞凋亡二大動力來平衡。最明顯的例子 可見於血液系統，血液細胞的細胞增殖與細胞凋亡可依其所需要的生 長因子與介白質存在與否來決定；此時生長因子與介白質(interleukin) 就是扮演著存活因子的角色。（4）殺死危險性細胞：細胞凋亡在保護 生物個體的安全上，是一項極為重要的防護鎖。例如當生物個體中某 些細胞遭受環境傷害或病毒感染時而啟動凋亡程式(Elmore 2007)^[24]。

1.3.3 細胞凋亡的過程與訊息傳遞路徑

雖然細胞凋亡的現象早就在 1972 年就被提出，但是其分子內的 調控機制卻直到近年來才漸漸被了解。細胞凋亡主要過程可以分為三 個 階 段(Igney and Krammer 2002)^[25]： 第 一 階 段 為 起 始 階 段 (Initiation)，在此階段細胞受到刺激後開始啟動死亡起始訊號；第二 階段為作用階段(Effector)，在此階段中包含許多蛋白及核酸內切的活 化(Kumar and Harvey 1995)^[26]，其酵素與受質之間的作用造成細胞外 觀變化及 DNA 的碎裂；第三階段為降解階段(Degradation)，此時細 胞已形成凋亡小體，並被鄰近細胞經由吞噬作用而清除。而在細胞凋 亡 之 訊 息 傳 遞 方 面 ， 目 前 主 要 分 為 內 源 性(intrinsic) 和 外 源 性 (extrinsic)兩大路徑：前者為細胞內產生壓力(stress)或受到傷害，促使 粒腺體釋出 cytochrome c(Green and Reed 1998)^[27]，導致 Apaf-1、

Caspase-9 與 Caspase-3 的活化，此為內生性細胞凋亡路徑之一，另 外粒線體也會釋放 endo-G、AIF，並且這兩者會進入到細胞核中使 DNA 斷裂分解；至於後者則為死亡受體（death receptor）與受質的 結合，如 Fas ligand，且活化 Caspase-8 與 Caspase-3 (Ashkenazi and Dixit 1998)^[28]。而具有天門冬胺酸胺(aspartate)專一性的光胺酸蛋白

（Cysteine proteases，Caspases）均參與此兩大路徑(Thornberry and Lazebnik 1998)^[29]。

1.3.4 Caspase 與細胞凋亡

對於細胞凋亡的了解最早是來自於對線蟲（Caenorhabdistis elegant）控制其細胞死亡 ced 基因方面之研究。Ced-3 和 ced-4 是促 進細胞凋亡的基因（pro-apoptotic genes），而 ced-9 則為抑制細胞凋 亡的基因（anti-apoptotic genes）。這些蛋白酶皆為半胱胺酸蛋白酶，

可在專一性的天冬胺酸位置切割其受質，故稱之為 caspase（cysteinly aspartase）。

依執行功能可將caspase 分為三類(Thornberry and Lazebnik 1998) ^[29] : (a) Inflammatory caspases: caspase 1、4、5、11、13、14

(b) Effector caspases: caspase 3、6、7

(c) Initiator caspases: caspase 2、8、9、10、12

在細胞中 Caspase 通常以不活化前驅物(zymogen)存，當細胞表面接

受器接收到凋亡訊息(如 TNF-α)或者受到刺激，促使粒線體釋出 cytochrome c 後將會活化 initiator caspase，接著活化 effector caspase 啟動凋亡機制。Caspase-3 是 effector caspase 的一員，當其活化後會 使數種蛋白受質失去活性，例如：PARP 被 caspase-3 切割後即喪失 DNA 修補功能(Tewari, Quan et al. 1995)^[30]；Lamin A 為核膜蛋白，

一 旦 被 caspase-3 分 解 則 DNA 易 受 損 害 ， 有 利 凋 亡 進 行 ； ICAD(inhibitor of caspase activated deoxyribonuclease)是 CAD(caspase activated deoxyribonuclease)的抑制蛋白，當被 caspase-3 作用後即無 法抑制 CAD，而 CAD 則會活化下游之 effector caspase(Chowdhury, Tharakan et al. 2008)^[31]。

另外有關細胞凋亡的發生大致上可分為內源性(intrinsic)和外源性 (extrinsic)兩種路徑。在外源性凋亡路徑方面，當 Fas Ligand 或 TNF 與細胞膜上的受器（即 Fas receptor 及 TNFR-1）結合時，會將 pro-caspase-8 活化為 caspase-8，接下來即為 caspase-3 及-6 依序被活 化(Earnshaw, Martins et al. 1999)^[32]；在內源性凋亡路徑方面，細胞內 由不同因子引發的死亡訊息可促使粒線體的通透性發生改變而使 cytochrome c 由粒線體中釋放到細胞質(Liu and Vakharia 2006)^[33]， cytochrome c 再與 ATP 共同結合到 Apaf-1 ， 使得 Apaf-1 的結構改 變 ， 讓 Apaf-1 的 CARD （ caspase-recruitment domain ） 能 與

pro-caspase-9 上的 CARD 結合， 將 pro-caspase-9 活化為 caspase-9，

進而活化下游的caspase-3、-7(Li, Nijhawan et al. 1997; Hu, Benedict et al. 1999; Saleh, Srinivasula et al. 1999)^[34-36]。因此在細胞凋亡發生時，

Caspase-3、8、9 都會明顯的被活化。

1.3.5 粒線體膜電位(MMP)與細胞凋亡關係

在二十億年前，細胞以及細菌的祖先處於共生狀態，一起面對生 存的壓力。此後細菌演化成粒線體，而細胞則開始了多細胞的演化之 路。有許多證據指出，當初細菌進入細胞內時，不僅將產生能量的能 力帶入細胞，提供細胞生長、活動、分化之能量；另一方面也將目前 認為是細胞凋亡的基因帶入細胞內，例如與Bcl-2 家族相似的基因 CED-9 (C. elegans)，這些 Bcl-2 家族的結構與功能都與一些細菌毒素 相似(如 diphtheria toxin 和 colicins)，並且 Bcl-2 家族許多蛋白都會結 合在粒線體的膜上，並且能在粒線體膜上形成許多孔洞(如 BAX)，這 些孔洞的形成會造成粒線體間質釋放出cytochrome c 和

apoptosis-inducing factor (AIF)去活化 caspases 而引起一連串細胞凋 亡的現象發生(Green and Reed 1998; Liu and Vakharia 2006)^{[27, 33]}。 而調控這些粒線體內容物的釋放，一般認為與粒線體上的粒線體過渡 性通透孔(mitochondrial permeability transition pore：MPTP)有關，它 包含了兩大部分：

一是在粒線體內膜與 adenine nucleotide translocator (ANT) 相關之蛋 白質；另一是在外膜的蛋白質 (包括了 porin, voltage-dependent anion channel, VDAC)。打開此一通道會造成粒線體內膜兩側陽離子電位 (H+ gradient)消失、粒線體膜電位下降、粒線體基質(matrix)滲透壓增 高，造成粒線體漲大，外膜漲破之後cytochrome c 和 caspase-inducing factors (AIF) 釋 放 到 細 胞 質 中 造 成 細 胞 凋 亡 (Green and Reed 1998)^[27]。在研究粒線體過渡性通透孔過程中發現，許多抑制粒線體 過渡性通透孔打開的化合物可以抑制細胞凋亡的發生，這些研究更證 明了粒線體膜電位的改變對於細胞凋亡之重要性。因為，粒線體膜電 位喪失不但是細胞凋亡的一個重要指標，更是調控此一機轉之非常重 要的關鍵，抑制膜電位喪失通常可以進一步抑制下游凋亡路徑。

1.3.6 內質網壓力(ER stress)與細胞凋亡之關係

內質網(ER)是細胞內主要蛋白質合成、折疊、儲存鈣離子及鈣離 子訊息傳導的主要場所，醣蛋白的醣基修飾 (glycosylation) 也是在此 進行。當合成的蛋白質未折疊(unfolded)、錯誤折疊(misfolded)在內質 網裡堆積，或是蛋白質醣基化的過程被抑制，氧化壓力（oxidative stress）產生，都會破壞了內質網的正常功能， 造成所謂的內質網壓 力(Gething and Sambrook 1992; Pahl and Baeuerle 1995)^{[37, 38]}。然而，

細胞感受到內質網壓力後，會促使某些伴護蛋白(chaperons)的表現提

高，幫助新合成的蛋白質摺疊成可以正確的構型，例如:葡萄糖調蛋 白78 (glucose regulated protein 78, GRP78) 在內質網壓力下會被大量 表現出來以調節細胞生理(Momoi 2004)^[39]，因此許多實驗都以GRP78 表現是否提高當作指標，來偵測是否有內質網壓力的產生。而近年的 研究中發現，內質網壓力造成的凋亡也與粒線體之調控有關(Egger, Madden et al. 2007)^[40]。在研究中發現，當內質網受到壓力後，會調控 下游蛋白酶體 (proteasome)活性，而且此類蛋白酶體會針對抗凋亡 Bcl-2 家族蛋白作降解，使這些抗凋亡蛋白無法繼續抑制促凋亡蛋白 如Bax、Bak 之活性，最後影響粒線體膜電位，造成細胞凋亡。

此外，若是內質網壓力持續累積也會造成細胞走向凋亡。Caspase 12 就是內質網壓力所誘導的細胞凋亡中特定活化的Caspase，會進一步 活化下游細胞質中的Caspase，但目前機制尚未清楚(Urano, Wang et al.

2000)^[41]。事實上，病毒感染宿主細胞有時也會產生內質網壓力，進 而引發細胞凋亡，例如:腺病毒的 E3/19k 蛋白(Pahl, Wang et al.

1996)^[42]、流行性感冒病毒的 Hemagglutinin (HA)(Braakman, Hoover-Litty et al. 1991)^[43]、HBV truncated middie HB surface

antigen(Meyer, Caselmann et al. 1992)^[44]等蛋白都被發現在細胞中大量 表現，會在內質網中堆積而導致內質網壓力而造成凋亡。