第三章 材料與方法
第三節 實驗方法
壹、 樣品製備
乾燥黃芩 1.7 公斤，在室溫下以乙醇萃取兩次，每次五天，萃取物經減壓濃縮 後剩下殘留物為52.4 公克，再經正丁醇和乙酸乙酯進行分配萃取(partition)，得到 兩種Butanol 和 EtOAc 粗萃物。再將 EtOAc 粗萃物以管柱層析法分離，並經 HPLC
更進一步的純化，分離出七個化合物FL1-FL7。
◎由中國醫藥大學都竹傳統藥物研究中心郭悅雄講座教授實驗室進行
黃芩 Butanol 粗萃物、EtOAc 粗萃物以 DMSO(dimethyl sulfoxide, Sigma,
#D2650)回溶樣品成 10mg/mL 之 stock，FL1-FL7 以 DMSO(dimethyl sulfoxide, Sigma,
#D2650)回溶樣品成 30mM 的 stock 溶液。
貳、 細胞培養
一、人類單核球細胞 (Human acute monocytic leukemia, THP-1)
以 RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY, US) 培養細胞，含 2 μM L-glutamin, 4.5 g/L glucose, 10 μM HEPES, 1.0 mM sodium pyruvate (Sigma)、10%
fetal bovine serum (Gibco)、0.05 mM 2-mercaptoethanol (Sigma)以及 1%的抗生素 Antibiotic- Antimycotic (Gibco)，內含 penicillin G sodium 100 units/mL, streptomycin sulfate 100 μg/mL, amphotericin B 250 ng/mL，培養液儲存於 4oC 冰箱。
二、細胞解凍活化
從液態氮筒取出細胞後，迅速移至 37oC 水浴槽解凍，待完全融化後，將細胞 懸浮液加入已加好24 mL 培養液之 75T flask 中，輕搖混勻後放入 37oC，5%二氧
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化碳的細胞培養箱中培養，並於解凍培養後隔日更換培養液。
三、細胞繼代
將培養於 75 T flask 中的 THP-1 細胞液移至離心管，放入離心機以 1000rpm，
25oC 離心 5 分鐘後去除上清液，加入適量的新鮮培養液混合均勻，將細胞以 1:4
至1:8 的比例繼代，之後置於 37oC，5% CO2的細胞培養箱中培養，約兩到三天更 換一次培養液。
四、細胞冷凍保存
冷凍細胞之濃度以 1×106 cells/mL 為佳，將細胞懸浮液移至滅菌過的離心管中，
以1000 rpm，25oC 離心五分鐘之後去除上清液，加入以 7% DMSO (Dimethyl sulfoxide, Sigma)與 93%新鮮培養液配製而成的細胞冷凍保存液混合均勻，將欲冷
凍之細胞懸浮液各1 mL 分裝至冷凍管中，再以 parafilm 封存後先將冷凍管放在保
麗龍盒中置於-80oC 冰存 overnight，之後移到液態氮桶中保存。
五、細胞數目計算
活細胞會排斥 Trypan Blue (Sigma, USA) 染劑，只有死細胞會被染成深藍色，
故以顯微鏡 (Nikon, Tokyo, Japan) 計算血球計數盤上的亮點，可得知細胞之相對 存活率。取20μl 稀釋過之細胞懸浮液與 Trypan Blue 染劑對半稀釋，以血球計數盤
計算四大格總數，除以4 乘以稀釋倍數再乘以 104可得該取樣細胞液之密度
(cells/mL)。
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參、
痤瘡桿菌 (Propionibacterium acnes, BCRC10723)培養
一、 實驗菌株：
本實驗所使用之痤瘡桿菌 (Propionibacterium acnes, P. acnes) (BCRC10723)，
購買自新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，是由人類臉部痤瘡患 部所分離出來之菌株。
二、 新購入乾燥菌株之開封與活化
以沾有 75%酒精之棉花擦拭外管後於火焰上加熱外管之尖端，滴數滴無菌水 於加熱處使外管破裂，以硬棒敲破尖端，再取出隔熱纖維紙和內管，以滅菌過的
鑷子取出內管之棉塞，用無菌吸管吸取0.3~0.5 mL 的培養液滴入內管，使乾燥菌
體溶解至均勻懸浮，並取0.1~0.2 mL 的菌體懸浮液滴入平板培養基的邊緣附近，
以四區劃線法接種於平板培養基，經過厭氧培養、菌種活化，分離純化後得到的 單一菌落再以培養液培養24~72 小時，加入 20%的甘油冰存於-80oC。
三、培養液及平板培養基製備
取18.5 g Brain heart infusion (BHI) broth (Becton, Dicksinson and company, U.S.A)溶於 500 mL 的去離子水中，置於殺菌釜以溫度 121oC、壓力 1.2 kg/cm2滅 菌30 分鐘，待培養液冷卻後加入以 0.2 μm filter 過濾之無菌葡萄糖溶液，培養液
最終葡萄糖濃度為1%。配製好的培養液置於 4oC 保存，實驗時於水浴槽回溫至 37
oC。
平板培養基製備方式為配製培養液時同時加入 7.5 g 的 agar 粉末(Difco
Laboratories, Detroit, MI, USA)，置於殺菌釜以溫度 121oC、壓力 1.2 kg/cm2滅菌30 分鐘，略微降溫後於無菌操作台內加入以0.2 μm filter 過濾之無菌葡萄糖溶液(最終
葡萄糖濃度為1%)，混和均勻後分裝至培養皿內並以 UV 燈照射待其凝固，凝固後
將平板培養基倒置保存於4 oC。
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四、菌種解凍活化與厭氧培養
將冷凍在-80oC 的痤瘡桿菌 (BCRC 10723) 取出，加入 10 mL 含 1% Glucose 的BHI broth 培養液中，於 37oC 的厭氧缸培養 48 小時，48 小時後取 2mL 的菌液 加入fresh BHI broth 培養液，置於 37oC 的厭氧缸培養 24 小時，從其中用接種環取
約3 圈菌液塗於平板培養基培養 24 小時，後續實驗即使用從平板培養基上取下之
菌株。厭氧缸中放置兩包產氣厭氧包(BBL GasPack; Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA)，根據實驗情況汰換。
五、菌種凍存
痤瘡桿菌經上述步驟解凍兩天、活化一天後，取出 1~2 loop 以四區劃線法接
種於平板培養基，置於37oC 的厭氧缸培養 24 小時，24 小時後勾取平板培養基上
之單離菌落約1~2 loop，加入 8 mL 含 1% glucose 的 BHI broth 培養液中，於 37oC 的厭氧缸培養24 小時後再加入 2 mL glycerol 混勻後，每 0.5 mL 分裝成一管，冰 存於-80oC。
肆、 細胞存活率測定－MTT assay
MTT (3-(4, 5-dimethyl thiazol -2-yl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide) 為黃色 化合物，會與活細胞粒線體中的琥珀酸脫氫酶 (Succinate dehydrogenase) 反應，
MTT 結構中的 tetrazolium 環被琥珀酸脫氫酶破壞，使 MTT 還原成紫色的 formazan結晶(圖3-8)，formazan的生成量與活細胞的數目成正比(Mosmann, 1983)。
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將 THP-1 cells (2 × 106 cells/mL)種於 96-well plate 中，每 well 含有 100 μL 的細
胞液，實驗組分別加入100 μL 不同濃度的實驗樣品溶液，控制組則加入 100 μL 的
細胞培養液，置於37oC，5% CO2的細胞培養箱中培養24 小時。24 小時後，每 well 加入 50 μL 的 MTT 溶液於細胞培養箱中反應 2 小時。移去上清液後，每 well 加入含0.04 N HCl 的 Isopropanol 將紫色結晶溶出，利用 ELISA reader 讀取 550nm 之吸光值。實驗組與控制組之吸光值經計算後，可求得細胞存活率，公式如下：
細胞存活率(%)＝實驗組之吸光值 / 控制組之吸光值×100%
伍、 in vitro 抑制 IL-1β、IL-8 生成之活性評估－ELISA assay
本實驗使用 heat-killed P .acnes (BCRC 10723)刺激 THP-1 cells，使 THP-1 cells
產生促發炎的細胞激素。IL-1β 和 IL-8 主要由單核球、巨噬細胞等免疫細胞分泌，
是一種促發炎細胞激素，具有化學趨化作用，能吸引嗜中性球至患部吞噬外來病
原，造成患部細胞浸潤及發炎反應，本研究使用IL-1β 和 IL-8 作為指標，評估黃
芩Butanol、EtOAc 粗萃物及 FL1-FL7 化合物的抗發炎活性，並運用具有抗發炎作 用的藥劑：luteolin 作為本實驗的正對照組。
一、P. acnes 處理 1. live P. acnes
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取一滅菌過之微量離心管秤重，加入從平板培養基取下的 P. acnes，秤得的重量扣 除離心管空重後可得 P. acnes 重量，實驗用不含抗生素之 RPMI 配製成 40 mg/mL 的stock solution。
2. heat-killed P. acnes
取一滅菌過之微量離心管秤重，加入從平板培養基取下的 P. acnes，置於 100℃水
浴加熱30 分鐘，使 P. acnes 死亡，取出放涼秤重，秤得的重量扣除離心管空重後
可得 P. acnes 重量。實驗用不含抗生素之 RPMI 配製成 40 mg/mL 的 stock solution，
再用超音波震盪機震盪30 分鐘。
二、不同處理方式 P. acnes 誘導 THP-1 細胞產生 IL-8 蛋白質的關係 將THP-1 cells 以 2 × 106 cells/mL 的密度種於 96-well plate 中，每 well 含有 100 μL 的細胞液，之後加入100 μL 含有 P. acnes +含抗生素培養液、P. acnes +不含抗生 素培養液、heat killed P. acnes +不含抗生素培養液，置於 37oC，5% CO2的細胞培
養箱中共培養24 小時後收集上清液，之後使用市售套組分析 IL-8 的含量。
三、Heat-killed P. acnes 誘導 THP-1 細胞產生 IL-1β、IL-8 蛋白質 將 THP-1 cells 以 2 × 106 cells/mL 的密度種於 96-well plate 中，每 well 含有 100 μL 的細胞液，之後加入 100 μL 含有 heat-killed P. acnes [200 μg/mL，M.O.I.=75，
換算方式如下]的 Butanol、EtOAc 粗萃物、FL1-FL7、luteolin 溶液，控制組加入 100 μL 不含 P. acnes 的 PRMI 培養液，置於 37oC，5% CO2的細胞培養箱中共培養 24 小時後收集上清液，之後使用市售套組分析 IL-1β、IL-8 的含量。
◎M.O.I.(Multiplicity of Infection)病毒感染倍數，指環境中一顆細胞受到多少顆病 菌感染(細菌數量/細胞數量)：實驗使用 P. acnes 200μg/mL 以培養液稀釋法(Broth
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Dilution Method)，得到菌液濃度為 7.5×107 CFU/mL，而 THP-1 cells 密度為 1×106 cells/mL，換算後 M.O.I.為 75
四、ELISA 實驗步驟 1. ELISA IL-1β
以市售ELISA kit 分析 THP-1 cells 所產生的 IL-1β 蛋白質濃度，依照產品步驟 說明書進行實驗：將100 μL 的 coating solution 加入 96-well ELISA plate 中，置於 4 oC 中 coating 16 到 18 小時。移除 coating solution，以 wash buffer 清洗三次後，
加入assay buffer blocking 一小時，blocking 結束後甩乾 assay buffer，每 well 分別 加入50 μL 不同濃度的 IL-1β standard solution 和稀釋過的細胞上清液，以及 50 μL 的assay buffer D，反應 2 小時。2 小時後以 wash buffer 清洗 3 次，再加入 100 μL 的detection antibody solution，反應 1 小時。之後加入 100 μL avidin-HRP solution 反應30 分鐘，再以 wash buffer 清洗 3 次後，各加入 100 μL Substrate Solution F 呈 色反應(放置於暗處)20 分鐘，最後加入 50 μL 2N H2SO4終止反應，以ELISA reader
偵測450 nm 之吸光值。吸光值越高代表上清液中含有越高濃度的 IL-1β，將吸光
值代入標準曲線換算出濃度後，再乘上上清液之稀釋倍數即為THP-1 cells 實際產
生之IL-1β 的含量，單位以 pg/mL 表示。
2. ELISA IL-8
以市售 ELISA kit 分析 THP-1 cells 所產生的 IL-8 蛋白質濃度，依照產品步驟 說明書進行實驗如上所述。
五、IC50的計算
以 P. acnes 刺激組(FoL100)的抑制百分率為 0％，求各濃度抑制百分率(％)為
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多少。
抑制百分率(％) = [ 1 –( Psample- Pblk)/( PFoL100 - Pblk)] x 100%
PFoL100：給予200μg/mL Heat killed P. Acnes(M.O.I.=75)刺激下，THP-1 細胞 cytokines 生成量
Pblk：在無任何刺激下，THP-1 細胞 cytokines 生成量
Psample：P. acnes 與各濃度樣品存在下，THP-1 細胞 cytokines 生成量
將各濃度樣品之抑制百分率與其濃度作圖(用 sigmaplot12.0 軟體的 standard curve
作圖)，並以內插法求抑制百分率為 50％時的樣品濃度，即為 IC50。
陸、 in vivo 抗發炎活性評估
參考Nakatsuji 等人(2009)於文獻中建立的動物實驗模式，將 P. acnes 活菌注射 在ICR 小鼠耳朵皮下組織中引起發炎反應，實驗組則注射含有 P. acnes 與 FL1-FL7，
評估FL1-FL7 的 in vivo 抗發炎效果。
一、實驗動物
本實驗使用的動物為 6 周大的 ICR 公鼠，購買自台大動物中心，給予市售 chow diet 及飲水，自由進食適應 3 天後分組進行實驗。
二、菌液配製
根據預實驗測定 600 nm 吸光值下菌液的相對活菌數，以無菌的 1X PBS 將活 化的 P. acnes 調整濃度至 6 ×109 CFU/mL。
吸光值與菌液濃度對照：
72 小時活化 OD 600nm CFU/mL
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BCRC10723 1.1 約6×109
三、樣品配製
FL1-FL7 於細胞實驗中能抑制 IL-1β 和 IL-8 生成，因此進一步探討 FL1-FL7 之 in vivo 抗發炎效果。FL1-FL7 stock solution 以 DMSO(dimethyl sulfoxide, Sigma,
#D2650)回溶樣品成 40μg/mL，再以無菌之 1X PBS 稀釋至實驗濃度：20 μg per 10 μL。
四、注射方式
將小鼠以乙醚麻醉之後使用0.3 mL 的胰島素針抽取實驗樣品與菌液後進行注
射，注射時以棉花棒撐起小鼠耳朵，以大約20～30 度的角度入針，入針後緩緩將
10 μL 菌液與樣品(表 3-1)注入耳朵皮下組織，如有水泡隆起即代表注射成功。
表3-1 動物實驗 A 分組 (刺激時間點測試)
兩耳皆注射同樣樣品 注射之樣品
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(1) 犧牲與組織採樣：
樣品及菌液注射後依不同實驗分組時間點以乙醚犧牲小鼠。犧牲後剪下小鼠 耳朵並使用微測徑器(Mitutoyo, Kanagawa, Japan)測量耳朵厚度，並計算抑制率(%
inhibition)。
耳朵厚度增加百分比＝實驗組之耳朵厚度／控制組之耳朵厚度 × 100%
耳朵厚度增加百分比＝實驗組之耳朵厚度／控制組之耳朵厚度 × 100%