黃芩萃取物及其組成分抑制痤瘡丙酸桿菌誘導之發炎反應
85
0
0
全文
(2) 謝誌 感謝上帝！終於完成這本論文了！首先要感謝我的指導老師吳文惠老師，謝 謝您給予我研究上許多的幫助和教導！跟著您在做人處事各方面都學到了很多。 再來要謝謝蔡帛蓉老師！謝謝您讓我可以加入實驗室中，在研究和做人處事各方 面，常常給予我許多的指導和協助。還要感謝我的口委葉松鈴老師，謝謝您撥空 協助修改論文和給予許多寶貴的意見！另外也要感謝郭悅雄老師提供實驗樣品！ 感謝黃文程學長教導實驗上的技術，並給予許多的幫助和傳授經驗。謝謝雅 欣學姊在實驗技術的指導！謝謝吳家的銘穗學姊、美玲常常關心我，也給我很多 的幫助！謝謝我的同學芝翎、彥如、琇雯、勤巧、紫綺、雅雯，不管是你們給予 我的協助，還是彼此的鼓勵打氣！謝謝鈴宣在實驗上的協助！還要謝謝雅菱、虹. 、. 浩庭、佩紋、涓含、家芸、怡婷、渝珊 ~ 可以跟你們一同打氣和努力，也常常給 予我幫助！ 謝謝我的小組~立砥家、撲浪和教會的弟兄姊妹！謝謝你們常常為我代禱！也 幫我打氣和給我鼓勵！最後一定要謝謝我最親愛的家人，辛苦您們了！常常為我 擔心，又要陪我聊天，一起禱告！感謝上帝讓我有這三年的學習！還在我身邊安 插了這麼多天使，謝謝在這段時間所有參與過我生命的人們！. 「願一切尋求你的，因你高興歡喜，願那些喜愛你救恩的，常說，當尊耶和華為 大。」(詩 40:16) 2.
(3) 中文摘要 痤瘡桿菌(Propionibacterium acnes)是痤瘡等發炎疾病的重要因子，會刺激單核 球等細胞分泌大量促發炎細胞激素 IL-1β、IL-8，造成發炎反應。黃芩是一種傳統 中草藥，在中醫合併其他藥物用來治療痤瘡，其主要活性成分有 Baicalin、baicalein、 wogonin 和 oroxylin A，具有抗發炎、抑制腫瘤生成等效果。 本研究以痤瘡桿菌刺激人類單核球細胞(THP-1)為發炎模式，先測試黃芩正丁醇、 乙酸乙酯(EtOAc)粗萃物的抗發炎效果，發現黃芩 EtOAc 粗萃物及其所含有的七種 黃酮類化合物 oroxylin A、wogonin、7-O-methylwogonin、skullcapflavone II、5,7, 4'-trihydroxy-8-methoxyflavone、5,6,2'-trihydroxy-7,8-dimethoxyflavone 和 ganhuangenin，均可顯著抑制 IL-1β 和 IL-8 分泌。其中 wogonin 效果最佳，抑制 IL-1β 和 IL-8 分泌之 IC50 分別為 4.9μM、8.7μM，其次為 5,7,4'-trihydroxy-8-methoxyflavone 抑制 IL-1β 和 IL-8 分泌之 IC50 為 11.3μM 和 10.2μM。之後以小鼠耳朵注射痤瘡桿菌模式，檢測耳朵厚度和組織均質液 IL-1β、 IL-6 和 TNF-α 濃度，發現七個化合物皆可抑制耳朵發炎和腫脹現象且抑制三種細 胞激素的分泌。 綜合而論，黃芩萃取物和其活性成分能有效抑制痤瘡桿菌引起的發炎反應， 具改善痤瘡潛力. 關鍵字：痤瘡、黃芩、抗發炎、介白素-1β、介白素-8. iii.
(4) Abstract Propionibacterium acnes (P. acnes), the main pathogenic bacteria of acne vulgaris, stimulates IL-1β and IL-8 secretion in immunocytes. Radix Scutellariae (SB) is a common Chinese medicinal herb in Asia, having been used to treat acne. Our research evaluated the effects of SB extracts and its components on inflammation in THP-1 cells stimulated by P. acnes. The results showed that the ethylacetate (EtOAc) extract of SB significantly inhibited P. acnes induced IL-1β and IL-8 secretion. Seven compounds, oroxylin A, wogonin, 7-O-methylwogonin, skullcapflavone II, 5,7, 4'-trihydroxy-8-methoxyflavone, 5,6,2'-trihydroxy-7,8-dimethoxyflavone, and ganhuangenin, isolated from SB EtOAc extract inhibited IL-1β and IL-8 secretion. Among them, wogonin had the best effect with IC50 of 4.9μM and 8.7μM for IL-1β and IL-8, respectively. Next was 5,7,4'-trihydroxy-8-methoxyflavone with IC50 of 11.3μM and 10.2μM for IL-1β and IL-8, respectively. Subcutaneous injection of P. acnes into mouse ears increased ear thickness, and levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α in ear homogenates. Each of the 7 compounds simultaneously injected with P. acnes reduced the ear thickness and the production of these 3 cytokines. In summary, EtOAc extract of SB and its seven components significantly inhibit P. acnes induced inflammation, and may improve acne vulgaris.. Key words: Acne vulgaris, Radix Scutellariae, wogonin, anti-inflammatory, IL-1β, IL-8. iv.
(5) 目錄 中文摘要 ......................................................................................................................... iii 目錄 .................................................................................................................................. v 圖目錄 ............................................................................................................................ vii 第一章 緒論 .................................................................................................................... 1 第一節 研究動機 .................................................................................................... 1 第二節 研究目的 .................................................................................................... 2 第二章 文獻探討 ............................................................................................................ 3 第一節 痤瘡桿菌與發炎 ........................................................................................ 3 壹、 痤瘡與痤瘡桿菌 .................................................................................... 3 貳、 痤瘡桿菌和發炎反應 ............................................................................ 6 參、相關細胞激素 .......................................................................................... 8 第二節 痤瘡的治療 .............................................................................................. 10 第三節 實驗材料 .................................................................................................. 12 壹、 黃芩(Huangqin; Radix Scutellariae ) ................................................... 12 第三章 材料與方法 .............................................................................................. 16 第一節 實驗架構 .......................................................................................... 16 第二節 研究材料 .................................................................................................. 17 壹、 藥品與試劑 .......................................................................................... 17 貳、 儀器設備 .............................................................................................. 21 第三節 實驗方法 .................................................................................................. 22 壹、 樣品製備 .............................................................................................. 22 貳、 細胞培養 .............................................................................................. 22 參、 痤瘡桿菌 (Propionibacterium acnes, BCRC10723) 培養 ................ 24 v.
(6) 肆、 細胞存活率測定－MTT assay ............................................................ 25 伍、 in vitro 抑制 IL-1β、IL-8 生成之活性評估－ELISA assay .............. 26 陸、 in vivo 抗發炎活性評估 ...................................................................... 29 柒、統計分析 ................................................................................................ 34 第四章 結果 .................................................................................................................. 35 第一節 in vitro 抗發炎作用 ................................................................................. 35 壹、 細胞存活率測定(MTT) ....................................................................... 35 貳、 抑制 IL-1β、IL-8 生成之活性評估(ELISA assay) ............................ 38 第二節 in vivo 抗發炎活性評估 .......................................................................... 52 第五章 討論 .................................................................................................................. 62 第一節 黃芩粗萃物 in vitro 抗發炎活性評估 ................................................... 62 第二節 FL1-FL7 的 in vitro 和 in vivo 抗發炎活性評估 ................................... 63 第三節 結論 .......................................................................................................... 66 第六章 參考文獻 .......................................................................................................... 67 . vi.
(7) 圖目錄 圖 2-1 痤瘡的致病機制 ................................................................................................... 4 圖 2-2 P. acnes 造成粉刺形成的機制 ............................................................................ 5 圖 2-3 P. acnes 參與發炎的可能機制和相關因子 ........................................................ 7 圖 4-1 以 MTT 方法測試不同濃度之黃芩 Butanol 和 EtOAc 粗萃物處理 THP-1 cell 之細胞存活率 ................................................................................................................ 35 圖 4-2 MTT 方法測試不同濃度之黃芩 EtOAc 粗萃物分離之黃酮類化合物 FL1-FL7 處理 THP-1 cell 之細胞存活率 .................................................................................... 37 圖 4-3 P. acnes(200μg/mL)以不同處理方式誘導 THP-1 細胞生成 IL-8 ................... 39 圖 4-4 黃芩 Butanol 粗萃物抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-1β cytokines 生成 ................................................................................................................ 40 圖 4-5 黃芩 Butanol 粗萃物抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-8 cytokines 生成 ................................................................................................................ 41 圖 4-6 黃芩 EtOAc 粗萃物抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-1β cytokines 生成 ................................................................................................................ 42 圖 4-7 黃芩 EtOAc 粗萃物抑制 heat-killed P. acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-8 cytokines 生成 ................................................................................................................ 43 圖 4-8 FL1-FL7 抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-1β cytokines 生成 44 圖 4-9. FL1-FL7 抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-8 cytokines 生成. ........................................................................................................................................ 45 圖 4-10 黃芩 Butanol 和 EtOAc 粗萃物抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-1β cytokines 生成效果(% 抑制率和 IC50) .............................................................. 46 圖 4-11 黃芩 Butanol 和 EtOAc 粗萃物抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-8 cytokines 生成效果(% 抑制率和 IC50) ................................................................ 47 vii.
(8) 圖 4-12 FL1-FL7 抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-1β cytokines 生成效 果(% 抑制率和 IC50) .................................................................................................... 49 圖 4-13 FL1-FL7 抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-8 cytokines 生成效 果(%抑制率和 IC50) ...................................................................................................... 51 圖 4-15 不同時間點 PBS 和 P. acnes 注射小鼠耳朵後組織均質液的 IL-1β cytokines 生成情形 ........................................................................................................................ 54 圖 4-16 不同時間點 PBS 和 P. acnes 注射小鼠耳朵後組織均質液的 IL-6 cytokines 生成情形 ........................................................................................................................ 55 圖 4-17 P. acnes 及 FL1-FL7 注射後 12 小時小鼠耳朵的外觀變化情形................. 56 圖 4-18、FL1-FL7 對 P. acnes 誘發 ICR 小鼠耳朵腫脹發炎之影響 ........................ 57 圖 4-19 FL1-FL7 對於 P. acnes 注射 12 小時後小鼠耳朵組織均質液的 IL-1β cytokines 生成情形 ........................................................................................................................ 59 圖 4-20 FL1-FL7 對於 P. acnes 注射 12 小時後小鼠耳朵組織均質液的 IL-6 cytokines 生成情形 ........................................................................................................................ 60 圖 4-21 FL1-FL7 對於 P. acnes 注射 12 小時後小鼠耳朵組織均質液的 TNF-α cytokines 生成情形 ........................................................................................................ 61 . viii.
(9) 表目錄 表 2-1 黃芩主要活性成分介紹 .................................................................................... 13 表 2-2 黃芩 EtOAc 粗萃物分離之 FL1~FL7 介紹 ..................................................... 14 表 3-1 動物實驗 A 分組 (刺激時間點測試) ............................................................... 30 表 3-2 動物實驗 B 分組 ................................................................................................ 31 表 4-1 FL1-FL7 抑制 P. acnes 誘發 ICR 小鼠耳朵腫脹發炎之效果(% 抑制率) ..... 58 表 5-1 FL1-FL7 抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-1β 和 IL-8 cytokines 分泌的 IC50 .................................................................................................................... 63 . ix.
(10) 第一章 緒論 第一節 研究動機 超過 80%的人在青春期或成年早期都曾患有痤瘡(Acne vulgaris)，大多數會痊 癒，少數會留下疤痕或是色素沉澱。痤瘡桿菌的大量增生、角質細胞異常、皮脂 大量分泌和發炎反應為其成因。 黃芩(Radix Scutellariae)，是目前被中醫使用治療痤瘡的傳統中草藥。研究發 現其有抗菌、抗發炎等功效，目前已發現幾個黃芩中主要的活性成分，baicalein(5, 6, 7-trihydroxy-8-methoxyflavone)、baicalin(baicalein 7-O-glucuronide)和 wogonin(5,7-dihydroxy-8-methoxyflavone) (Lai et al., 2001)。 這些化合物被發現有抗發炎、抗氧化、抗腫瘤等功效，研究發現 baicalein 可 抑制 cisplatin 誘導腎損傷的 MAPKs 和 NF-κB 的作用(Sahu et al., 2015);在一用 LPS 刺激微膠細胞(microglia)研究中發現，wogonin 可以抑制細胞激素 TNF-α、IL-1 和 促發炎的轉譯因子 NFκ-B(Piao et al., 2004)。 故本研究希望能探討黃芩萃取物和其中分離之黃酮類化合物抗 P. acnes 誘導 之發炎的效果。. 1.
(11) 第二節 研究目的 本篇研究使用黃芩正丁醇和乙酸乙酯(EtOAc)粗萃物及從 EtOAc 粗萃物中分 離的七個黃酮類化合物 oroxylin A、wogonin、7-O-methylwogonin、skullcapflavone II、5,7, 4'-trihydroxy-8-methoxyflavone、5,6,2'-trihydroxy-7,8-dimethoxyflavone 和 ganhuangenin，並以抑制 heat-killed P. acnes 誘導人類單核球細胞(THP-1 cell)細胞 化學趨化激素 IL-1β 和 IL-8 生成為指標，篩選出能夠減少 IL-1β 和 IL-8 生成之黃 酮類化合物，再以 P. acnes 誘導之動物模式探討其抗發炎效果，期盼能找出七個黃 酮類化合物中最有效的成分。. 2.
(12) 第二章 文獻探討 第一節 痤瘡桿菌與發炎 壹、 痤瘡與痤瘡桿菌 一、 痤瘡(Acne vulgaris) 痤瘡(Acne vulgaris)是一種常見的慢性皮膚發炎疾病，大多數人在青春期或成 年早期都曾受其影響。症狀是在臉部、胸部、背部和肩膀生成粉刺(comedos)、丘 疹(papules)、膿皰(pustules)等。痤瘡的成因主要為下列四項因子互相影響，其一是 細菌在毛囊皮脂腺的感染，特別是痤瘡桿菌(Propionibacterium acnes, P. acnes )， 其二是角質生成異常造成粉刺的形成，再來是由全身或局部性雄性素導致過多的 皮脂分泌，最後是 P. acnes 引起的發炎反應。確切的機制尚未明瞭，目前已知微粉 刺最先形成，之後轉變為粉刺、丘疹和膿皰，起因為雄性素刺激皮脂大量分泌並 影響毛囊過度角質化，除了上述，相關促發炎細胞激素也會大量增加，而 P. acnes 的移生作用會啟動先天性免疫和發炎反應，痤瘡的詳細致病流程見圖 2-1。 痤瘡對於患者造成的影響可能是暫時的容貌變醜，但也可能會留下永久的疤 痕，而不適當或未及時的治療對患者也可能會有心理方面深遠的傷害(Perman & Lucky, 2014)。. 3.
(13) 雄性素刺激 IGF 生成. 皮脂細胞. 毛囊角質細胞. IL-1α、IL-6、IL-8、 TNF-α 增加 大量增生 皮脂大量分泌. 大量增生 過度角質化 微小粉刺生成 P. acnes 生成物 P. acnes 移生 + 化學趨化分子. IL-1α 增加. 1.CD4 淋巴細胞 2.TH17 細胞 3.PMNs 4.巨噬細胞/DCs. 游離脂肪酸. 粉刺 - 開放性 - 閉鎖性. 丘疹 膿皰 結節. 痤瘡 圖 2-1 痤瘡的致病機制 備註： IGF：胰島素生長因子、DC：樹狀細胞、IL：介白素、PMN：多 形核細胞、TNF：腫瘤壞死因子 (HPM Gollnick, 2015) 4.
(14) 二、 痤瘡桿菌 痤瘡桿菌(P. acnes) 是一種親脂性的兼性厭氧格蘭氏陽性菌，存在於皮膚的毛 囊管、口腔、腸胃道和生殖器管道中，對於痤瘡的形成扮演重要角色。除了上述， P. acnes 也是攝護腺、人工關節、手術植入物、椎間盤和眼部等處發炎的主要微生 物(Yu et al., 2015)。P.acnes 生存在毛囊和皮脂腺中，代謝皮脂產生游離脂肪酸， 皮膚上的 P.acnes 會生成短鏈脂肪酸進而抑制 S. aureus 和 Streptococcus pyogenes 等病原菌的入侵(Tomida et al., 2013)，另外其可生成丙酸並分泌細菌素，像是硫肽， 這些物質可抑制 S. aureus 和其他治病菌的生長 (Brown et al., 2009; Shu et al., 2013)。 研究發現在痤瘡病人臉部無感染的皮膚區域給予 P. acnes，會造成發炎和膿包 的形成，而將 P. acnes 注射到角質核細胞中，會造成其破裂和發炎反應的發生，這 些證據顯示 P. acnes 為痤瘡的關鍵致病因子(Tanghetti, 2013)。P. acnes 會釋放游離 脂肪酸，並刺激 IGF-1 和 IL-1α 等生成，使粉刺生成，詳細機制如圖 2-2。 P. acnes 分泌脂解酶將三酸 甘油酯分解為游離脂肪酸 P. acnes 卟啉(porphyrins)誘 導角鯊烯(squalene)氧化 P. acnes. 增加角質細胞生成 IL-1α. 粉刺. 角質細胞異常增生 和分化 增加角質上皮細胞的 IGF-1 和 IGF-1R 表現量 圖 2-2 P. acnes 造成粉刺形成的機制 (Shaheen & Gonzalez, 2013) 5.
(15) 貳、 痤瘡桿菌和發炎反應 當身體受到外來微生物入侵，白血球從血管中浸潤到受傷組織，對抗外來微生 物及清除損壞細胞，引起一連串的免疫反應，發炎反應是其中重要一環，急性發 炎發生在受到感染期間，而慢性發炎則可能發展為發炎疾病。在急性發炎期由嗜 中性白血球主導，而慢性發炎則為巨噬細胞等白血球。 單核球(monocyte)是巨噬細胞的前驅物，參與在皮膚發炎中，其受到刺激會進 入皮膚中並分化為巨噬細胞，是一種抗原呈現細胞。巨噬細胞在發炎初期，會被 活化並有消滅病原體的能力，研究發現其會誘導超過 400 種基因，以消滅細菌和 分泌相關細胞激素或趨化素來調節相關細胞功能(Valledor et al., 2010)。 大量的 P. acnes 聚集生長造成單核球細胞分泌促發炎細胞激素 IL-1β、IL-8 和 TNF-α(Vowels et al., 1995)，藉由調控 TLRs(toll-like receptors)來影響這些細胞激素 的生成(Jugeau et al., 2005)，TLRs 參與在宿主對抗細菌、寄生蟲、真菌等外來微生 物抗原的先天性免疫反應中(Kim et al., 2002; Netea et al., 2004)，可活化巨噬細胞和 使其凋亡而引起發炎反應(Into et al., 2004; Lopez et al., 2003)。在人類單核球細胞 (THP-1)中，TLR2 藉由 MyD88、Fas 相關蛋白和 caspase-8 誘導 NF-κB 的活化和 自體凋亡(Aliprantis et al., 1999)。 在角質細胞中，P. acnes 會釋放蛋白酶到胞外活化 PAR-2 (protease-activated receptor-2)增進促發炎細胞激素的轉譯作用，包括 IL-1α、IL-8 和 TNF-α，還有一 些基質金屬蛋白酶(MMPs)和 LL37(唯一知道的人類 cathelicidin 抗菌胜肽)。這些資 料顯示 P. acnes 除了透過活化 TLRs，也藉由活化 PAR-2 途徑引起發炎反應(S. E. Lee et al., 2010)。其他相關影響發炎因子詳見圖 2-3。. 6.
(16) 圖 2-3 P. acnes 參與發炎的可能機制和相關因子 活化補體. 細胞和體液性免疫. 促角質細胞、單核球細胞 和皮脂細胞生成細胞激素 和化學趨化物. TLR2 和 TLR 4 的活化和作用. 分泌酵素至胞外. P. acnes. 促進嗜中性白血球和 單核球分泌相關細胞 激素或化學趨化物. 發炎反應. 促皮脂和角質細 胞生成 hBD2. Christie-AtkinsMunch-Peterson 因子. 促角質細胞生成 ROS (Shaheen & Gonzalez, 2013). 7.
(17) 參、相關細胞激素 IL-8、IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等促發炎細胞激素在發炎反應中扮演重要角色，活 化相關白血球的浸潤作用，增加發炎反應，詳細說明入下：. 一、Interleukin-8 (IL-8)： IL-8 是一個 CXC 種類趨化素(chemokine)，會和 CXCR1、CXCR2 結合(Robert C. Hoch, 1996)。在痤瘡扮演重要角色，會吸引嗜中性白血球(neutrophils)到發炎的 毛囊中，釋放溶小體酵素使毛囊上皮細胞破裂，並釋放更多相關促發炎細胞激素 加劇發炎反應。臨床研究比較健康和痤瘡病人患部皮膚的基因表現，發現相較於 前者痤瘡病患的 IL-8 在所有比對基因中為最高，以免疫染色法分析健康人皮膚中 幾乎沒有 IL-8，而痤瘡病人皮膚的毛囊發炎等處則聚集大量的 IL-8(Tanghetti, 2013)。. 二、Interleukin-1β (IL-1β)： 在痤瘡病人患部皮膚中，發現大量的 IL-1β，研究發現 P. acnes 會活化 NLRP3-inflammsome(The NOD-like receptor family, pyrin domain–containing protein 3)和 caspase-1，使 IL-1β 大量分泌(Kistowska et al., 2014)，NLRs 是一群重要的細 胞溶質模式識別受體，可檢測微生物分子和危險訊號並引起發炎和抗菌反應(Qin et al., 2014)。IL-1β 會活化在痤瘡部位的 Th17 細胞(IL-17A positive T cells)和樹突細 胞，刺激相關細胞激素的釋放，IL-17 是嗜中性白血球活化和趨化的關鍵因子，並 可促進角質細胞、內皮細胞、單核球和纖維母細胞生成相關促發炎細胞激素 IL-6、 TNF-、IL-1、PGE2、NO 等相關化學趨化物(Melnik, 2015)。因此 IL-1β 可以做為痤 瘡治療的一種指標，抑制其分泌或生成可改善痤瘡或相關皮膚發炎疾病。. 8.
(18) 三、Interleukin-6 (IL-6)： IL-6由嗜中性白血球、單核球/巨噬細胞、內皮細胞等產生，研究發現P. acnes 刺激小鼠巨噬細胞經由TLR-2路徑會產生IL-6(Kim et al., 2002)，而在痤瘡上皮組織 中，也發現大量的IL-6(Dréno, 1996)。動物實驗發現，IL-6可活化內皮細胞並使其 分泌IL-8和MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1)，趨化嗜中性白血球和單核球 /巨噬細胞，加劇發炎反應(Gabay, 2006)。. 四、Tumor necrosis factor- α (TNF-α)： TNF-α主要由單核球/巨噬細胞分泌，可趨化嗜中性白血球、單核球到感染部 位，並活化這些細胞將病原菌消滅。並和GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)一起參與在Langerhans細胞的成熟和移動以及淋巴結T細 胞的抗原呈現，造成早期毛囊的T細胞的浸潤(Antiga et al., 2015)。P. acnes會藉由 TLR2活化角質細胞或單核球細胞生成TNF-α(Bakry et al., 2014)。. 9.
(19) 第二節 痤瘡的治療 常見治療痤瘡的藥物為去角質藥(keratolytics)、抗生素、A 酸(retinoids)和荷爾 蒙，過氧化苯(Benzoyl peroxide)為常見的去角質藥物，可降低粉刺形成(去角質)和 抗菌，副作用為皮膚接觸過於敏感、刺激性、過度乾燥和紅斑等(Seth & Mishra, 2015)；四環素(Tetracylines)是臨床上第一線治療痤瘡的抗生素藥物，可以減少 P. acnes 而降低發炎反應，副作用為光毒性、腸胃不適和暫時性顱內壓升高； Isotretinoin 是 A 酸的一種，可以降低皮脂腺的大小和分泌，並調節角質細胞的成 熟(Ellis & Krach, 2001)，也可藉由降低 TLR2 路徑的促發炎細胞激素分泌來抑制 P. acnes 的作用(Dispenza et al., 2012)，常見 A 酸治療的副作用類似於維生素 A 過 多的症狀(暫時性的顱內壓上升、噁心、嘔吐等)，其他症狀像是唇炎、結膜乾燥症、 鼻出血；含雌激素的口服避孕藥為常用荷爾蒙治療藥物，一般會合併黃體素使用， 雌激素藉由抑制下視丘促性腺激素來降低卵巢產生雄性素，而黃體素則可預防因 雌激素過多而造成子宮內膜癌的風險(Harald Gollnick et al., 2003)，副作用為突破性 出血、噁心、嘔吐和乳房脹痛。 除了上述方式，中醫會依照個人體質及成因來治療痤瘡，口服、外用或合併 使用，常用於治療之中草藥像是生桑皮、黃芩、黃連等(黄清平, 2004)。. 10.
(20) 圖 2-1 痤瘡的機制和藥物治療 (Seth & Mishra, 2015). 11.
(21) 第三節 實驗材料 壹、 黃芩(Huangqin; Radix Scutellariae ). (Shang et al., 2010) 黃芩，為脣形科黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的乾燥根，性寒味苦，具有 清熱瀉火、解毒止血和安胎的功效，產地為中國河北、陝西、內蒙古、日本、韓 國和俄羅斯。黃芩中包含超過30種的黃酮類化合物。其藥理活性包括抗發炎、抗 氧化、抗菌、抗腫瘤、抗病毒等(Bauer & Xiao, 2011)。黃芩被中醫用來治療痤瘡， 以口服或外敷方式合併黃連、黃柏等中藥一起使用。 黃芩具有抗菌的能力，研究發現可抑制多種念珠菌屬(candida species)的生長 (Seneviratne et al., 2008)。國內也有人發現黃芩可以抑制 P. acnes 的生長(鄭景峯, 2005)。黃芩萃取物也可抗發炎，Yoon 等人發現黃芩水萃物可抑制以 LPS 誘導 Raw264.7 細胞生成的促發炎 NO、IL-6、IL-10、IL-12(Yoon et al., 2009)。 黃芩主要活性成分為：Baicalin、Baicalein、Wogonin、Oroxylin A、Scutellarin， 詳細介紹如表 2-1(備註：Wogonin 和 Oroxylin A 為實驗樣品，在表 2-2 介紹) 本實驗使用黃芩 Butanol 和 EtOAc 粗萃物和從 EtOAc 粗萃物分離的黃酮 化合物 oroxylin A、wogonin、7-O-methylwogonin、Skullcapflavone II、5,7, 4'-trihydroxy-8-methoxyflavone、5,6,2'-trihydroxy-7,8-dimethoxyflavone 和 Ganhuangenin (以 FL1-FL7 代稱)，其結構、抗發炎文獻資料如表 2-2。. 12.
(22) 表 2-1 黃芩主要活性成分介紹 俗名 Baicalin 黃芩苷. 化學式. 化學結構. Baicalein-7-O-glucuronide. 功能. 參考文獻. 抗腫瘤 抗發炎 抗氧化 抗菌 抗病毒. (Li-Weber, 2009) (Bao Qun Li a, 2000) (Waisundara et al., 2009) (Cushnie et al., 2003). 抗腫瘤. (Li-Weber, 2009) (Shen et al., 2003) (Kang et al., 2012) (Chan et al., 2011) (Johari et al., 2012) (Li et al., 2013) (S. Wang et al., 2011) (Hong & Liu, 2004) (Su et al., 2014) (Sun et al., 2015). (Franky L. Chana, 2000) Baicalein 黃芩苷元. 5,6,7-trihydroxyflavone. Scutellarin. Scutellarein-7-O-glucuronide. 抗發炎 抗氧化 抗菌 (Franky L. Chana, 2000) 抗病毒 抗腫瘤 抗發炎 抗氧化 抗菌 抗病毒 (X. Chen et al., 2006). 13.
(23) 表 2-2 黃芩 EtOAc 粗萃物分離之 FL1~FL7 介紹 化合物 化學式. 俗名. 化學結構. FL1. 5,7-dihydroxy-6-methoxyflavone. oroxylin A 木蝴蝶素 A. FL2. 5,7-Dihydroxy-8-methoxyflavone. wogonin 漢黃芩素. FL3. 5-hydroxy-7,8-dimethoxyflavone. 7-O-Methylwogonin. FL4. 5,6'-dihydroxy-6,7,8,2'-tetramethoxyflavone. Skullcapflavone II. 14. 抗發炎機制. 參考文獻. 抑制 LPS 誘導 巨噬細胞 NFκB 的活化 來下降 iNOS 和 COX-2 的表現 在 TPA 誘導小 鼠耳朵發炎模 式中，抑制 TNF-α 和 COX-2 的表現 抑制 LPS 誘導 巨噬細胞 NFκB 的活化 並降低 TNF-α、IL-6、. (Y.-C. Chen et al., 2000). (Chi et al., 2003). (Chao et al., 2010). MIP-2 在一 OVA 誘導 (Jang et al., 過敏性氣喘小 2012) 鼠模式中，藉由 抑制 Th2 細胞 激素分泌等，降.
(24) 低反應 FL5. 5,7, 4'-trihydroxy-8-methoxyflavone. (-). (-). (-). FL6. 5,6,2'-trihydroxy-7,8-dimethoxyflavone. (-). (-). (-). FL7. 5,7,2',5'-tetrahydroxy-8,6'-dimethoxyflavone. Viscidulin III Ganhuangenin. (-). (-). 備註：(-)為無相關資料，FL5- FL7 研究發現有抗病毒、抗氧化等作用. 15.
(25) 第三章 材料與方法 第一節 實驗架構 黃芩萃取物. Butanol 粗萃物. EtOAc 粗萃物. FL1-FL7. 抗發炎活性測試. 抗發炎活性測試. in vivo. 抑制 P. acnes 引 起之小鼠耳朵 發炎反應. Heat-killed P. acnes-stimulated THP-1 cells IL-1β, IL-8 secretion. 測量腫脹厚度. IL-6, IL-1β, TNF-α secretion. 16.
(26) 第二節 研究材料 壹、 藥品與試劑 一、. 樣品來源. 黃芩 Butanol、EtOAc 粗萃物和 FL1-FL7 由中國醫藥大學都竹傳統藥物研究中 心郭悅雄講座教授實驗室提供。. 二、. 細胞與培養液. THP-1 細胞株(BCRC 60430)購自新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研 究中心，本細胞株源自急性單核球白血病患者。. 細胞培養液： 1.. RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY, US). 2.. 10% fetal bovine serum, FBS (Gibco). 3.. 0.05 mM 2-mercaptoethanol (Sigma). 4.. Antibiotic- Antimycotic (Gibco),含 penicillin G sodium 100 units/mL, streptomycin sulfate 100 g/mL, amphotericin B 250 ng/mL. 5.. Sodium pyruvate (Sigma). 6.. Dimethyl sulfoxide, DMSO (Sigma). 三、. 細菌與培養基. 痤瘡桿菌 (Propionibacterium acnes, P. acnes) (BCRC10723)，購買自新竹食品工業 發展研究所生物資源保存及研究中心，是由人類臉部痤瘡患部所分離出來之菌 株。. 1.. Brain heart infusion broth, BHI (Difco, Detroit, MI, USA) 17.
(27) 2.. Glucose (Sigma). 3.. Agar 粉末(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA). 4.. 產氣厭氧包 BBL GasPak systems (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA). 四、細胞存活率測定 1.. Trypan Blue (Sigma). 2.. 3-(4,5-dimethyl thiazol -2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, MTT (Sigma). 3.. Hydrochloric acid, HCl (Sigma). 4.. Isopropanol (J.T. Baker). 五、抗發炎活性評估實驗 (一) 免疫酵素分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 1.. Human IL-8 ELISA kit (431056, BioLegend, SanDiego, USA) (1) Human IL-8 ELISA MAXTM Capture Antibody (200X) (2) Human IL-8 ELISA MAXTM Detection Antibody (200X) (3) Human IL-8 Standard (4) Avidin-HRP (1000X) (5) Substrate Solution C (6) Coating Buffer A (5X) (7) Assay Diluent A (5X). 2.. Human IL-1β ELISA kit (437006, BioLegend, SanDiego, USA) (1) Human IL-1β ELISA MAXTM Capture Antibody (200X) (2) Human IL-1β ELISA MAXTM Detection Antibody (200X) (3) Human IL-1β Standard (4) Avidin-HRP (1000X). 18.
(28) (5) Substrate Solution F (6) Coating Buffer A (5X) (7) Assay Diluent A (5X) (8) Assay Buffer D 3.. 10X PBS： 藥品. 需要量. NaCl. 80 g. KCl. 2g. Na2HPO4. 14.4 g. KH2PO4. 2.4 g. 溶於 1000 mL DD water 中，pH 值＝7.0～7.3。 4.. 2N H2SO4. 5.. Wash Buffer: 藥品. 需要量. Tween 20 (J.T. Baker). 1 mL. 溶於 2000 mL PBS(1X)中，pH 值＝7.4。. 六、抗發炎活性評估實驗 in vivo (一) 小鼠耳朵組織均質 1.. 電動研磨器(Power Masher II, 891300, Nippi, Japan). 2.. 研磨管 BioMasher III(320302, Nippi, Japan). 3.. RIPA lysis and extraction buffer (786-490, G-Biosciences, St. Louis, USA). 4. 100mM PMSF (KC-407, Imgenex, USA) (二)免疫酵素分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA). 19.
(29) 1.. Mouse IL-6 ELISA kit ( BioLegend, SanDiego, USA) (1) Mouse IL-6 ELISA MAXTM Capture Antibody (200X) (2) Mouse IL-6 ELISA MAXTM Detection Antibody (200X) (3) Mouse IL-6 Standard (4) Avidin-HRP (1000X) (5) Substrate Solution A (6) Substrate Solution B (7) Coating Buffer A (5X) (8) Assay Diluent A (5X). 2.. Mouse IL-1β ELISA kit (432606, BioLegend, SanDiego, USA) (1) Mouse IL-1β ELISA MAXTM Capture Antibody (200X) (2) Mouse IL-1β ELISA MAXTM Detection Antibody (200X) (3) Mouse IL-1β Standard (4) Avidin-HRP (1000X) (5) Substrate Solution D (6) Coating Buffer A (5X) (7) Assay Diluent A (5X) (8) Assay Buffer D. 3.. Mouse TNF-α ELISA kit (430903, BioLegend, SanDiego, USA) (1) Mouse TNF-α ELISA MAXTM Capture Antibody (200X) (2) Mouse TNF-α ELISA MAXTM Detection Antibody (200X) (3) Mouse TNF-α Standard (4) Avidin-HRP (1000X) (5) Substrate Solution A (6) Substrate Solution B 20.
(30) (7) Coating Buffer A (5X) (8) Assay Diluent A (5X) 4.. Assay Buffer D. 5.. 10X PBS. 6.. 2N H2SO4. 7.. Wash Buffer. 七、抗發炎活性實驗用純品 1. Luteolin (Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA). 貳、 儀器設備 1. 細胞計數器(hemacytometer, Sigma) 2. 倒立式顯微鏡 (Nikon, Tokyo, Japan) 3. 離心機(Hettich, Tuttlingen, Germany) 4. 無菌操作台(LIAN SHEN) 5. 二氧化碳培養箱(Thermo Co., Waltham, MA, USA) 6. ELISA reader (Biotek Instruments, Winooski, VT, USA). 21.
(31) 第三節 實驗方法 壹、 樣品製備 乾燥黃芩 1.7 公斤，在室溫下以乙醇萃取兩次，每次五天，萃取物經減壓濃縮 後剩下殘留物為 52.4 公克，再經正丁醇和乙酸乙酯進行分配萃取(partition)，得到 兩種 Butanol 和 EtOAc 粗萃物。再將 EtOAc 粗萃物以管柱層析法分離，並經 HPLC 更進一步的純化，分離出七個化合物 FL1-FL7。 ◎由中國醫藥大學都竹傳統藥物研究中心郭悅雄講座教授實驗室進行 黃芩 Butanol 粗萃物、EtOAc 粗萃物以 DMSO(dimethyl sulfoxide, Sigma, #D2650)回溶樣品成 10mg/mL 之 stock，FL1-FL7 以 DMSO(dimethyl sulfoxide, Sigma, #D2650)回溶樣品成 30mM 的 stock 溶液。. 貳、 細胞培養 一、人類單核球細胞 (Human acute monocytic leukemia, THP-1) 以 RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY, US) 培養細胞，含 2 μM L-glutamin, 4.5 g/L glucose, 10 μM HEPES, 1.0 mM sodium pyruvate (Sigma)、10% fetal bovine serum (Gibco)、0.05 mM 2-mercaptoethanol (Sigma)以及 1%的抗生素 Antibiotic- Antimycotic (Gibco)，內含 penicillin G sodium 100 units/mL, streptomycin o. sulfate 100 μg/mL, amphotericin B 250 ng/mL，培養液儲存於 4 C 冰箱。. 二、細胞解凍活化 從液態氮筒取出細胞後，迅速移至 37oC 水浴槽解凍，待完全融化後，將細胞 o. 懸浮液加入已加好 24 mL 培養液之 75T flask 中，輕搖混勻後放入 37 C，5%二氧 22.
(32) 化碳的細胞培養箱中培養，並於解凍培養後隔日更換培養液。. 三、細胞繼代 將培養於 75 T flask 中的 THP-1 細胞液移至離心管，放入離心機以 1000rpm， o. 25 C 離心 5 分鐘後去除上清液，加入適量的新鮮培養液混合均勻，將細胞以 1:4 o. 至 1:8 的比例繼代，之後置於 37 C，5% CO2 的細胞培養箱中培養，約兩到三天更 換一次培養液。. 四、細胞冷凍保存 冷凍細胞之濃度以 1×106 cells/mL 為佳，將細胞懸浮液移至滅菌過的離心管中， o. 以 1000 rpm，25 C 離心五分鐘之後去除上清液，加入以 7% DMSO (Dimethyl sulfoxide, Sigma)與 93%新鮮培養液配製而成的細胞冷凍保存液混合均勻，將欲冷 凍之細胞懸浮液各 1 mL 分裝至冷凍管中，再以 parafilm 封存後先將冷凍管放在保 o. 麗龍盒中置於-80 C 冰存 overnight，之後移到液態氮桶中保存。. 五、細胞數目計算 活細胞會排斥 Trypan Blue (Sigma, USA) 染劑，只有死細胞會被染成深藍色， 故以顯微鏡 (Nikon, Tokyo, Japan) 計算血球計數盤上的亮點，可得知細胞之相對 存活率。取 20μl 稀釋過之細胞懸浮液與 Trypan Blue 染劑對半稀釋，以血球計數盤 計算四大格總數，除以 4 乘以稀釋倍數再乘以 104 可得該取樣細胞液之密度 (cells/mL)。. 23.
(33) 參、 痤瘡桿菌 (Propionibacterium acnes, BCRC10723) 培養 一、 實驗菌株： 本實驗所使用之痤瘡桿菌 (Propionibacterium acnes, P. acnes) (BCRC10723)， 購買自新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，是由人類臉部痤瘡患 部所分離出來之菌株。. 二、 新購入乾燥菌株之開封與活化 以沾有 75%酒精之棉花擦拭外管後於火焰上加熱外管之尖端，滴數滴無菌水 於加熱處使外管破裂，以硬棒敲破尖端，再取出隔熱纖維紙和內管，以滅菌過的 鑷子取出內管之棉塞，用無菌吸管吸取 0.3~0.5 mL 的培養液滴入內管，使乾燥菌 體溶解至均勻懸浮，並取 0.1~0.2 mL 的菌體懸浮液滴入平板培養基的邊緣附近， 以四區劃線法接種於平板培養基，經過厭氧培養、菌種活化，分離純化後得到的 單一菌落再以培養液培養 24~72 小時，加入 20%的甘油冰存於-80oC。. 三、培養液及平板培養基製備 取 18.5 g Brain heart infusion (BHI) broth (Becton, Dicksinson and company, U.S.A)溶於 500 mL 的去離子水中，置於殺菌釜以溫度 121oC、壓力 1.2 kg/cm2 滅 菌 30 分鐘，待培養液冷卻後加入以 0.2 μm filter 過濾之無菌葡萄糖溶液，培養液 最終葡萄糖濃度為 1%。配製好的培養液置於 4oC 保存，實驗時於水浴槽回溫至 37 o. C。 平板培養基製備方式為配製培養液時同時加入 7.5 g 的 agar 粉末(Difco. Laboratories, Detroit, MI, USA)，置於殺菌釜以溫度 121oC、壓力 1.2 kg/cm2 滅菌 30 分鐘，略微降溫後於無菌操作台內加入以 0.2 μm filter 過濾之無菌葡萄糖溶液(最終 葡萄糖濃度為 1%)，混和均勻後分裝至培養皿內並以 UV 燈照射待其凝固，凝固後 將平板培養基倒置保存於 4 oC。. 24.
(34) 四、菌種解凍活化與厭氧培養 將冷凍在-80oC 的痤瘡桿菌 (BCRC 10723) 取出，加入 10 mL 含 1% Glucose 的 BHI broth 培養液中，於 37oC 的厭氧缸培養 48 小時，48 小時後取 2mL 的菌液 加入 fresh BHI broth 培養液，置於 37oC 的厭氧缸培養 24 小時，從其中用接種環取 約 3 圈菌液塗於平板培養基培養 24 小時，後續實驗即使用從平板培養基上取下之 菌株。厭氧缸中放置兩包產氣厭氧包(BBL GasPack; Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA)，根據實驗情況汰換。. 五、菌種凍存 痤瘡桿菌經上述步驟解凍兩天、活化一天後，取出 1~2 loop 以四區劃線法接 種於平板培養基，置於 37oC 的厭氧缸培養 24 小時，24 小時後勾取平板培養基上 之單離菌落約 1~2 loop，加入 8 mL 含 1% glucose 的 BHI broth 培養液中，於 37oC 的厭氧缸培養 24 小時後再加入 2 mL glycerol 混勻後，每 0.5 mL 分裝成一管，冰 存於-80oC。. 肆、 細胞存活率測定－MTT assay MTT (3-(4, 5-dimethyl thiazol -2-yl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide) 為黃色 化合物，會與活細胞粒線體中的琥珀酸脫氫酶 (Succinate dehydrogenase) 反應， MTT 結構中的 tetrazolium 環被琥珀酸脫氫酶破壞，使 MTT 還原成紫色的 formazan結晶(圖3-8)，formazan的生成量與活細胞的數目成正比(Mosmann, 1983)。. 25.
(35) 將 THP-1 cells (2 × 106 cells/mL)種於 96-well plate 中，每 well 含有 100 μL 的細 胞液，實驗組分別加入 100 μL 不同濃度的實驗樣品溶液，控制組則加入 100 μL 的 o. 細胞培養液，置於 37 C，5% CO2 的細胞培養箱中培養 24 小時。24 小時後，每 well 加入 50 μL 的 MTT 溶液於細胞培養箱中反應 2 小時。移去上清液後，每 well 加入含 0.04 N HCl 的 Isopropanol 將紫色結晶溶出，利用 ELISA reader 讀取 550nm 之吸光值。實驗組與控制組之吸光值經計算後，可求得細胞存活率，公式如下： 細胞存活率(%)＝實驗組之吸光值 / 控制組之吸光值×100%. 伍、 in vitro 抑制 IL-1β、IL-8 生成之活性評估－ELISA assay 本實驗使用 heat-killed P .acnes (BCRC 10723)刺激 THP-1 cells，使 THP-1 cells 產生促發炎的細胞激素。IL-1β 和 IL-8 主要由單核球、巨噬細胞等免疫細胞分泌， 是一種促發炎細胞激素，具有化學趨化作用，能吸引嗜中性球至患部吞噬外來病 原，造成患部細胞浸潤及發炎反應，本研究使用 IL-1β 和 IL-8 作為指標，評估黃 芩 Butanol、EtOAc 粗萃物及 FL1-FL7 化合物的抗發炎活性，並運用具有抗發炎作 用的藥劑：luteolin 作為本實驗的正對照組。. 一、P. acnes 處理 1. live P. acnes 26.
(36) 取一滅菌過之微量離心管秤重，加入從平板培養基取下的 P. acnes，秤得的重量扣 除離心管空重後可得 P. acnes 重量，實驗用不含抗生素之 RPMI 配製成 40 mg/mL 的 stock solution。 2. heat-killed P. acnes 取一滅菌過之微量離心管秤重，加入從平板培養基取下的 P. acnes，置於 100℃水 浴加熱 30 分鐘，使 P. acnes 死亡，取出放涼秤重，秤得的重量扣除離心管空重後 可得 P. acnes 重量。實驗用不含抗生素之 RPMI 配製成 40 mg/mL 的 stock solution， 再用超音波震盪機震盪 30 分鐘。. 二、不同處理方式 P. acnes 誘導 THP-1 細胞產生 IL-8 蛋白質的關係 將 THP-1 cells 以 2 × 106 cells/mL 的密度種於 96-well plate 中，每 well 含有 100 μL 的細胞液，之後加入 100 μL 含有 P. acnes +含抗生素培養液、P. acnes +不含抗生 o. 素培養液、heat killed P. acnes +不含抗生素培養液，置於 37 C，5% CO2 的細胞培 養箱中共培養 24 小時後收集上清液，之後使用市售套組分析 IL-8 的含量。. 三、Heat-killed P. acnes 誘導 THP-1 細胞產生 IL-1β、IL-8 蛋白質 將 THP-1 cells 以 2 × 106 cells/mL 的密度種於 96-well plate 中，每 well 含有 100 μL 的細胞液，之後加入 100 μL 含有 heat-killed P. acnes [200 μg/mL，M.O.I.=75， 換算方式如下]的 Butanol、EtOAc 粗萃物、FL1-FL7、luteolin 溶液，控制組加入 o. 100 μL 不含 P. acnes 的 PRMI 培養液，置於 37 C，5% CO2 的細胞培養箱中共培養 24 小時後收集上清液，之後使用市售套組分析 IL-1β、IL-8 的含量。. ◎M.O.I.(Multiplicity of Infection)病毒感染倍數，指環境中一顆細胞受到多少顆病 菌感染(細菌數量/細胞數量)：實驗使用 P. acnes 200μg/mL 以培養液稀釋法(Broth 27.
(37) Dilution Method)，得到菌液濃度為 7.5×107 CFU/mL，而 THP-1 cells 密度為 1×106 cells/mL，換算後 M.O.I.為 75. 四、ELISA 實驗步驟 1.. ELISA IL-1β 以市售 ELISA kit 分析 THP-1 cells 所產生的 IL-1β 蛋白質濃度，依照產品步驟. 說明書進行實驗：將 100 μL 的 coating solution 加入 96-well ELISA plate 中，置於 o. 4 C 中 coating 16 到 18 小時。移除 coating solution，以 wash buffer 清洗三次後， 加入 assay buffer blocking 一小時，blocking 結束後甩乾 assay buffer，每 well 分別 加入 50 μL 不同濃度的 IL-1β standard solution 和稀釋過的細胞上清液，以及 50 μL 的 assay buffer D，反應 2 小時。2 小時後以 wash buffer 清洗 3 次，再加入 100 μL 的 detection antibody solution，反應 1 小時。之後加入 100 μL avidin-HRP solution 反應 30 分鐘，再以 wash buffer 清洗 3 次後，各加入 100 μL Substrate Solution F 呈 色反應(放置於暗處)20 分鐘，最後加入 50 μL 2N H2SO4 終止反應，以 ELISA reader 偵測 450 nm 之吸光值。吸光值越高代表上清液中含有越高濃度的 IL-1β，將吸光 值代入標準曲線換算出濃度後，再乘上上清液之稀釋倍數即為 THP-1 cells 實際產 生之 IL-1β 的含量，單位以 pg/mL 表示。. 2.. ELISA IL-8 以市售 ELISA kit 分析 THP-1 cells 所產生的 IL-8 蛋白質濃度，依照產品步驟. 說明書進行實驗如上所述。. 五、IC50 的計算 以 P. acnes 刺激組(FoL100)的抑制百分率為 0％，求各濃度抑制百分率(％)為 28.
(38) 多少。 抑制百分率(％) = [ 1 –( Psample- Pblk)/( PFoL100 - Pblk)] x 100% PFoL100：給予 200μg/mL Heat killed P. Acnes(M.O.I.=75)刺激下，THP-1 細胞 cytokines 生成量 Pblk：在無任何刺激下，THP-1 細胞 cytokines 生成量 Psample：P. acnes 與各濃度樣品存在下，THP-1 細胞 cytokines 生成量 將各濃度樣品之抑制百分率與其濃度作圖(用 sigmaplot12.0 軟體的 standard curve 作圖)，並以內插法求抑制百分率為 50％時的樣品濃度，即為 IC50。. 陸、 in vivo 抗發炎活性評估 參考 Nakatsuji 等人(2009)於文獻中建立的動物實驗模式，將 P. acnes 活菌注射 在 ICR 小鼠耳朵皮下組織中引起發炎反應，實驗組則注射含有 P. acnes 與 FL1-FL7， 評估 FL1-FL7 的 in vivo 抗發炎效果。. 一、實驗動物 本實驗使用的動物為 6 周大的 ICR 公鼠，購買自台大動物中心，給予市售 chow diet 及飲水，自由進食適應 3 天後分組進行實驗。. 二、菌液配製 根據預實驗測定 600 nm 吸光值下菌液的相對活菌數，以無菌的 1X PBS 將活 化的 P. acnes 調整濃度至 6 ×109 CFU/mL。 吸光值與菌液濃度對照： 72 小時活化. OD 600nm. 29. CFU/mL.
(39) BCRC10723. 1.1. 約 6×109. 三、樣品配製 FL1-FL7 於細胞實驗中能抑制 IL-1β 和 IL-8 生成，因此進一步探討 FL1-FL7 之 in vivo 抗發炎效果。FL1-FL7 stock solution 以 DMSO(dimethyl sulfoxide, Sigma, #D2650)回溶樣品成 40μg/mL，再以無菌之 1X PBS 稀釋至實驗濃度：20 μg per 10 μL。. 四、注射方式 將小鼠以乙醚麻醉之後使用 0.3 mL 的胰島素針抽取實驗樣品與菌液後進行注 射，注射時以棉花棒撐起小鼠耳朵，以大約 20～30 度的角度入針，入針後緩緩將 10 μL 菌液與樣品(表 3-1)注入耳朵皮下組織，如有水泡隆起即代表注射成功。. 表 3-1 動物實驗 A 分組 (刺激時間點測試) 兩耳皆注射同樣樣品. 注射之樣品. 30.
(40) 刺激 6hr. 刺激 12hr. 刺激 24hr. DMSO + PBS. Control (n=3) . DMSO + P. acnes DMSO + PBS DMSO + P. acnes DMSO + PBS DMSO + P. acnes. DMSO (n=3) Control (n=3) DMSO (n=3) Control (n=3) DMSO (n=3) . 註 1：每隻耳朵注入樣品之體積為 10μL。 註 2：每隻耳朵注射之 P. acnes 最終濃度為 6 ×107 CFU。 註 3：每組的 DMSO 注射與 FL1-FL7 等量. 表 3-2 動物實驗 B 分組. 31.
(41) 注射之樣品 Control. PBS + DMSO*. 左耳 右耳 . DMSO (n=6). 左耳. -. 右耳 . FL1 (n=6). 左耳 . P. acnes + DMSO* P. acnes + FL1 (20μg). FL2 (n=6). 左耳 . FL3 (n=6). 左耳 . FL4 (n=6). 左耳 . FL5 (n=6). 左耳 . FL6 (n=6). 左耳 . FL7 (n=6). 左耳 . 右耳 . P. acnes + FL2 (20μg). 右耳 . P. acnes + FL3 (20μg). 右耳 . P. acnes + FL4( 20μg). 右耳 . P. acnes + FL5 (20μg). 右耳 . P. acnes + FL6 (20μg). 右耳 . P. acnes + FL7 (20μg). 右耳 . 註 1：每隻耳朵注入樣品之體積為 10μL。 註 2：每隻耳朵注射之 P. acnes 最終濃度為 6 ×107 CFU。 *註 3：Control 和 DMSO 組和其他組別等量之 DMSO. 五、動物犧牲與組織採樣 32.
(42) (1) 犧牲與組織採樣： 樣品及菌液注射後依不同實驗分組時間點以乙醚犧牲小鼠。犧牲後剪下小鼠 耳朵並使用微測徑器(Mitutoyo, Kanagawa, Japan)測量耳朵厚度，並計算抑制率(% inhibition)。 耳朵厚度增加百分比＝實驗組之耳朵厚度／控制組之耳朵厚度 × 100%. 六、P. acnes 誘導小鼠耳朵產生 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 蛋白質 1.耳朵組織均質 將測完厚度的小鼠耳朵冰存-80℃，隔天取出剪小塊，放入研磨管(BioMasher III) 中，並加入 lysis buffer(RIPA lysis：PMSF=2000μL：20μL) 700μL，以電動研磨 器(Power Masher II)研磨約 30 秒~1 分鐘，接著以 4℃ 10000g 離心 1 分鐘，取出組 織均質液到 1.5mL 微量離心管中，再以 4℃ 14000rpm 離心 10 分鐘，得到上清液， 以-80℃保存。. 2.ELISA 實驗步驟如前所述 (1) ELISA IL-1β 以市售 ELISA kit 分析鼠耳組織所產生的 IL-1β 蛋白質濃度，依照產品步驟說 明書進行實驗。. (2) ELISA IL-6. 33.
(43) 以市售 ELISA kit 分析鼠耳組織所產生的 IL-6 蛋白質濃度，依照產品步驟說明 書進行實驗。. (3) ELISA TNF-α 以市售 ELISA kit 分析鼠耳組織所產生的 TNF-α 蛋白質濃度，依照產品步驟說 明書進行實驗。. 柒、統計分析 每次實驗都至少進行三次獨立試驗，各實驗結果數值以 mean ± SD (n = 3)表示， 並以 SPSS (Statistical Product and Service Solutions) 12 版統計軟體進行實驗數據的 統計分析，實驗結果之數據以單因子變異數分析(one way ANOVA)檢定組間差異之 顯著性，再以 LSD (Least Significant Difference)法進行事後比較，檢定各實驗組 別與 vehicle group (heat-killed P. acnes alone)間是否具有顯著差異(p < 0.05， p < 0.01， p < 0.001)。檢定各實驗組別彼此之間是否具有顯著差異時，使用 Duncan 檢定法進行事後比較，各組別間標示不同的小寫英文字母，則代表該組別之間具 有統計上的顯著差異(p < 0.05)。. 34.
(44) 第四章 結果 第一節 in vitro 抗發炎作用 壹、 細胞存活率測定(MTT) 實驗樣品的實驗濃度選定，以不影響細胞存活率為原則，避免影響細胞生 長進而造成細胞數目不同而成為實驗的干擾因素。 1. 黃芩 Butanol 和 EtOAc 粗萃物 黃芩 Butanol 粗萃物在 250μg/mL 濃度會對 THP-1 cell 產生毒性而排除該 濃度。實驗結果以 50、150、200μg/mL 作為後續實驗使用的濃度。而 EA 粗 萃物在 20μg/mL 濃度會對 THP-1 cell 產生毒性而排除該濃度選用 2.5、5、. 120. 120. 100. 100. 80. *. 60 40. *. Cell viability (% control). Cell viability (% control). 10μg/mL 作為後續實驗使用的濃度。. 20. *. 80 60. *. 40 * 20. 0. 0. control. 150. 200. 250. 300. control. 10. Butanol extract (g/mL). 20. 40. 80. EtOAc extract (g/mL). 圖 4-1 以 MTT 方法測試不同濃度之黃芩 Butanol 和 EtOAc 粗萃物處理 THP-1 cell 之細胞存活率 Figure 4-1 Effects of Butanol and EtOAc extracts of Scutellariae radix on viability of THP-1 cells by MTT method. THP-1 cells were treated with test compounds for 24 hours. Values are mean ± SD. Asterisk indicates a significant difference from the control group(*p＜0.001).. 35.
(45) 2. 黃芩 EtOAc 粗萃物分離之黃酮類化合物 FL1-FL7 實驗結果 FL1、FL2、FL4 和 FL5 以 5, 10, 15μM 作為後續實驗使用的濃度。 FL3 以 30, 60, 120μM 作為後續使用的濃度。FL6 以 15, 30, 60μM 作為後續 使用的濃度。FL7 以 60, 90, 120μM 作為後續使用的濃度。. 140 120. Cell viability (% control). 120. Cell viability (% control). 100 80 ** 60 40. 100 80 60 40 20. 20. 0. 0. control. 5. 10. 15. control. 30. 5. 10. 30. FL2 (M). FL1 (M). 120. 120. 100. 100. 80 ** 60 40. Cell viability (% control). Cell viability (% control). 15. **. 80 60 40 20. 20. 0. 0. control. 30. 60. 120. control. 240. 5. 10. 15. FL4 (). FL3 (M). 36. 30.
(46) 120. 120 *. Cell viability (% control). **. 80 60 40. Cell viability (% control). 100. 100. **. 80 60 40 20. 20. 0. 0. control. 5. 10. 15. control. 30. FL5 (). 15. 30. 60. 120. FL6 (). 140 **. Cell viability (% control). 120 100. **. 80 60 40 20 0. control. 30. 60. 120. 240. FL7 (M). 圖 4-2 MTT 方法測試不同濃度之黃芩 EtOAc 粗萃物分離之黃酮類化合物 FL1-FL7 處理 THP-1 cell 之細胞存活率 Figure 4-2 Effects of FL1-FL7 on viability of THP-1 cells by MTT method. THP-1 cells were treated with test compounds for 24 hours. Values are mean ± SD. Asterisk indicates a significant difference from the control group(*p＜0.05, **p＜0.001).. 37.
(47) 貳、 抑制 IL-1β、IL-8 生成之活性評估(ELISA assay) 1. 不同處理方式 P. acnes 誘導 THP-1 細胞產生 IL-8 蛋白質的關係 P. acnes 以活菌或經熱殺皆能達到誘發皮膚發炎狀態(Lyte et al., 2009)，我們以 不同方式處理 P. acnes，以含抗生素的培養液、活菌和熱殺處理(P. acnes =200μg/mL)，發現三者皆達到誘導 THP-1 細胞生成 IL-8 的效果(圖 4-3)。從文 獻得知，樣品具有抑菌效果，由於我們想探討的是樣品抗發炎效果，因此選 用 heat-killed P. acnes 作為後續研究的刺激物。. 2. 黃芩 Butanol 和 EtOAc 粗萃物 以不同濃度黃芩 Butanol 和 EtOAc 粗萃物和 heat-killed P. acnes(M.O.I. =75) 與 THP-1 cell 共同培養 24 小時，收取上清液，以 ELISA 方法分析促發炎激素 IL-1β 和 IL-8，發現在 Butanol 粗萃物 50、150 和 200μg/mL(圖 4-4 和圖 4-5) 和 EtOAc 粗萃物 5 和 10μg/mL(圖 4-6 和圖 4-7)有顯著抑制效果，Butanol 和 EtOAc 粗萃物的 IL-1β 和 IL-8 的 IC50 如圖 4-10、圖 4-11。. 3. 黃芩 EtOAc 粗萃物分離之黃酮類化合物 FL1-FL7 將不同濃度黃芩 EtOAc 粗萃物分離之黃酮類化合物 FL1-FL7 和 heat-killed P. acnes (M.O.I. =75)與 THP-1 cell 共同培養 24 小時，收取上清液，以 ELISA 方法分析促發炎激素 IL-1β 和 IL-8，發現每個化合物都有顯著抑制效果(圖 4-8 和圖 4-9)，而 FL1-FL7 的 IL-1β 和 IL-8 的 IC50 如圖 4-12、圖 4-13(因未達 50% 抑制率，FL1 和 FL6 沒有計算 IL-1β 的 IC50，FL4 沒有計算 IL-8 的 IC50)。. 38.
(48) IL-8 concentration (pg/mL). 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0. control. Antibiotics-treated P. acnes. living P. acnes. Heat-killed P. acnes. 圖 4-3 P. acnes(200μg/mL)以不同處理方式誘導 THP-1 細胞生成 IL-8 Figure 4-3 P. acnes (200μg/mL) in a different approach to induce THP-1 cells to produce IL-8.. 39.
(49) 2000. IL-1 concentration (pg/mL). 1800 1600 1400 * c. 1200 1000 800. * b. 600 400. * a. 200 0. control DMSO. 50. 150. 200. Butanol extract (g/mL). 10 Luteolin (M). Heat-killed P. acnes (M.O.I.=75). 圖 4-4 黃芩 Butanol 粗萃物抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-1β cytokines 生成 Figure 4-4 Butanol extract of Scutellariae radix inhibited heat-killed P. acnes-induced cytokine IL-1β production by THP-1 cells. THP-1 cells were incubated for 24 hr with heat-killed P. acnes suspension (M.O.I. =75) in the presence of three concentrations of Butanol extract of Scutellariae radix. Data are expressed as the means ± SD of three independent tests. The data were evaluated for statistical significance with one-way ANOVA followed by LSD and Duncan’s multiple range tests. Asterisk indicates indicate a significant difference from the DMSO group(*p＜0.001). DMSO: positive control (with heat-killed P.acnes), Control: negative control (without heat-killed P.acnes). Means with the same letter are not significantly different between treatment groups. Differences were considered significant for p＜0.05.. 40.
(50) IL-8 concentration (ng/mL). 80. * c. 60. * * b. 40. 20. * a. 0. control DMSO. 50. 150. 200. Butanol extract g/mL). 10 Luteolin (M). Heat-killed P. acnes (M.O.I.=75). 圖 4-5 黃芩 Butanol 粗萃物抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-8 cytokines 生成 Figure 4-5 Butanol extract of Scutellariae radix inhibited heat-killed P. acnes-induced cytokine IL-8 production by THP-1 cells. THP-1 cells were incubated for 24 hr with heat-killed P. acnes suspension (M.O.I.=75) in the presence of three concentrations of Butanol extract of Scutellariae radix. Data are expressed as the means ± SD of three independent tests. The data were evaluated for statistical significance with one-way ANOVA followed by LSD and Duncan’s multiple range tests. Asterisk indicates indicate a significant difference from the DMSO group(*p＜0.001). DMSO: positive control (with heat-killed P.acnes), Control: negative control (without heat-killed P.acnes). Means with the same letter are not significantly different between treatment groups. Differences were considered significant for p＜0.05.. 41.
(51) IL-1 concentration (pg/mL). 120 100. b. 80. * b. **. 60 40. ** a. 20 0. control. DMSO. 2.5. 5 EtOAc extract (g/mL). 10. 10. Luteolin (M). Heat-killed P. acnes (M.O.I.=75). 圖 4-6 黃芩 EtOAc 粗萃物抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-1β cytokines 生成 Figure 4-6 EtOAc extract of Scutellariae radix inhibited heat-killed P. acnes-induced cytokine IL-1β production by THP-1 cells. THP-1 cells were incubated for 24 hr with heat-killed P. acnes suspension (M.O.I. =75) in the presence of three concentrations of EtOAc extract of Scutellariae radix. Data are expressed as the means ± SD of three independent tests. The data were evaluated for statistical significance with one-way ANOVA followed by LSD and Duncan’s multiple range tests. Asterisk indicates significant difference from the DMSO group(* p＜0.05, **p＜0.001). DMSO: positive control (with heat-killed P.acnes), Control: negative control (without heat-killed P.acnes). Means with the same letter are not significantly different between treatment groups. Differences were considered significant for p＜0.05. 42.
(52) 10. IL-8 concentration (ng/mL). c 8 * b *. 6 * a. 4. 2. 0. control. DMSO. 2.5. 5 EtOAc extract (g/mL). 10. 10. Luteolin (M). Heat-killed P. acnes (M.O.I.=75). 圖 4-7 黃芩 EtOAc 粗萃物抑制 heat-killed P. acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-8 cytokines 生成 Figure 4-7 EtOAc extract of Scutellariae radix inhibited heat-killed P. acnes-induced cytokine IL-8 production by THP-1 cells. THP-1 cells were incubated for 24 hr with heat-killed P. acnes suspension (M.O.I. =75) in the presence of three concentrations of EtOAc extract of Scutellariae radix. Data are expressed as the means ± SD of three independent tests. The data were evaluated for statistical significance with one-way ANOVA followed by LSD and Duncan’s multiple range tests. Asterisk indicates a significant difference from the DMSO group(*p＜0.001). DMSO: positive control (with heat-killed P.acnes), Control: negative control (without heat-killed P.acnes). Means with the same letter are not significantly different between treatment groups. Differences were considered significant for p＜0.05.. 43.
(53) 3000. 2500. IL-1 concentration (pg/mL). *. **. c 2000. **. b. ** ** **. a. **. b. c. c. a. **. b b. **. **. **. **. b ** b 1500. b. a **. **. **. a ** a. a. b **. 1000 **. **. **. a. a. b **. 500. a. 0 control DMSO 5 10 15. FL1. 5 10 15. 30 60 120. 5 10 15. 5 10 15. 15 30 60. 60 90 120. FL2. FL3. FL4. FL5. FL6. FL7. 10 (M) Luteolin. Heat-killed P. acnes (M.O.I.=75). 圖 4-8 FL1-FL7 抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-1β cytokines 生成 Figure 4-8 FL1-FL7 inhibits heat-killed P.acnes-induced cytokine IL-1β production by THP-1 cells. THP-1 cells were incubated for 24 hr with heat-killed P.acnes suspension (M.O.I.=75) in the presence of different concentrations of FL1-FL7. Data are expressed as the means ± SD of three independent tests. The data were evaluated for statistical significance with one-way ANOVA followed by LSD and Duncan’s multiple range tests. Asterisk indicates significant difference from the DMSO group(* p＜0.05, **p＜0.001). DMSO: positive control (with heat-killed P.acnes), Control: negative control (without heat-killed P.acnes). Means with the same letter are not significantly different within the same fraction. Differences were considered significant for p ＜0.05. 44.
(54) 100 ***. c. IL-8 concentration (ng/mL). 80. c c. *. b 40. c. *. 60. ***. * b. ***. a. ***. a 20. b ***. *. b ***. a. ***. b. *** ***. a. ***. b. a. ***. ** a *** a ***. a. a. a. ***. ***. a 0 control DMSO 5 10 15. FL1. 5 10 15 30 60120 5 10 15. FL2. FL4. FL3. 5 1015. FL5. 15 30 60 60 90 120 10 (M). FL6. FL7. Luteolin. Heat-killed P. acnes (M.O.I.=75). 圖 4-9 生成. FL1-FL7 抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-8 cytokines. Figure 4-9 FL1-FL7 inhibits heat-killed P. acnes-induced cytokine IL-8 production by THP-1 cells. THP-1 cells were incubated for 24 hr with heat-killed P. acnes suspension (M.O.I. =75) in the presence of different concentrations of FL1-FL7. Data are expressed as the means ± SD of three independent tests. The data were evaluated for statistical significance with one-way ANOVA followed by LSD and Duncan’s multiple range tests. Asterisk indicates significant difference from the DMSO group(* p＜0.05, ***p＜0.001). DMSO: positive control (with heat-killed P.acnes, Control: negative control (without heat-killed P.acnes). Means with the same letter are not significantly different within the same fraction. Differences were considered significant for p ＜0.05.. 45.
(55) IC50=80.5M. (A) Butanol extract. 120. % of inhibition. 100 80 60 40 20 0 0. 50. 100. 150. 200. 250. M IC50=6.6M. (B) EtOAc extract 100. % of inhibition. 80. 60. 40. 20. 0 0. 2. 4. 6. 8. 10. 12. M. 圖 4-10 黃芩 Butanol 和 EtOAc 粗萃物抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-1β cytokines 生成效果(% 抑制率和 IC50) Figure 4-10 % Inhibition and a half maximum inhibition (IC50) of heat-killed P. acnes-induced cytokine IL-1β production by Butanol and EtOAc extract of Scutellariae radix in THP-1 cells.. 46.
(56) IC50=135.5M. (A) Butanol extract 120. % of inhibition. 100 80 60 40 20 0 0. 50. 100. 150. 200. 250. M. 60. IC50=5.6M. (B) EtOAc extract. 50. % of inhibition. 40 30 20 10 0 -10 0. 2. 4. 6. 8. 10. 12. M. 圖 4-11 黃芩 Butanol 和 EtOAc 粗萃物抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-8 cytokines 生成效果(% 抑制率和 IC50) Figure 4-11 % Inhibition and a half maximum inhibition (IC50) of heat-killed P. acnes-induced cytokine IL-8 production by Butanol and EtOAc extract of Scutellariae radix in THP-1 cells.. 47.
(57) (A) FL1. 100. 80. % of inhibition. 80. % of inhibition. IC50=4.9M. (B) FL2. 100. 60. 40. 60. 40. 20. 20. 0. 0 0. 2. 4. 6. 8. 10. 12. 14. 0. 16. 2. 4. 6. 8. 12. 14. 16. M. M. 100. 10. IC50=9.1M. (D) FL4. 100. IC50=72.8M. (C) FL3. 80. % of inhibition. % of inhibition. 80. 60. 40. 60. 40. 20. 20 0 0. 0 0. 20. 40. 60. 80. 100. 120. 140. M. 48. 2. 4. 6. 8. M. 10. 12. 14. 16.
(58) IC50=11.3M. (E) FL5. 100. 100. 80. % of inhibition. 80. % of inhibition. (F) FL6. 60. 40. 60. 40. 20. 20. 0. 0 0. 2. 4. 6. 8. 10. 12. 14. 16. 20. 40. 60. M. M. IC50=84.3M. (G) FL7. 100. 0. % of inhibition. 80. 60. 40. 20. 0 0. 20. 40. 60. 80. 100. 120. 140. M. 圖 4-12 FL1-FL7 抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-1β cytokines 生成效果(% 抑制率和 IC50) Figure 4-12% Inhibition and a half maximum inhibition (IC50) of heat-killed P. acnes-induced cytokine IL-1β production by FL1-FL7 in THP-1 cells.. 49.
(59) IC50=13.1M. (A) FL1. 100. 80. % of inhibition. 80. % of inhibition. IC50=8.7M. (B) FL2 100. 60. 40. 20. 60 40 20 0 -20. 0 0. 2. 4. 6. 8. 10. 12. 14. 4. 16. 6. 8. 10. IC50=55.2M. (C) FL3. 16. (D) FL4. 100. 80. % of inhibition. 80. % of inhibition. 14. M. M. 100. 12. 60. 40. 60. 40. 20. 20. 0. 0 0. 20. 40. 60. 80. 100. 120. 0. 140. 2. 4. 6. 8. M. M. 50. 10. 12. 14. 16.
(60) IC50=10.2M. (E) FL5. 60. 80. % of inhibition. 40. % of inhibition. IC50=26.1M. (F) FL6. 100. 80. 20 0. 60. 40. -20. 20 -40. 0. -60 0. 2. 4. 6. 8. 10. 12. 14. 0. 16. M. 40. 60. M. IC50=124.3M. (G) FL7. 100. 20. % of inhibition. 80. 60. 40. 20. 0 0. 20. 40. 60. 80. 100. 120. 140. M. 圖 4-13 FL1-FL7 抑制 heat-killed P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 IL-8 cytokines 生成效果(%抑制率和 IC50) Figure 4-13 % Inhibition and a half maximum inhibition (IC50) of heat-killed P. acnes-induced cytokine IL-8 production by FL1-FL7 in THP-1 cells.. 51.
(61) 第二節 in vivo 抗發炎活性評估 從細胞實驗中觀察到 FL1-FL7 可以抑制 heat-killed P. acnes induced THP-1 cell 生成的 IL-1β 和 IL-8，以 P. acnes 皮下注射鼠耳動物模式來檢視 樣品的抗發炎效果。為了確認樣品的安全性和 in vivo 實驗濃度，先以單純 注射 FL1-FL7 至小鼠耳朵，根據小鼠外觀目測(外觀無紅腫等現象)選擇不造 成刺激的劑量，定 20μg/10μL/ear 進行實驗。 將 P. acnes 活菌注射在 ICR 小鼠耳朵皮下組織中誘發小鼠耳朵紅腫發 炎。先進行預實驗，以注射 P. acnes 後不同時間點的外觀和促發炎細胞激素 變化來決定之後的刺激時間，實驗 A 注射 P. acnes 6、12、24 小時後犧牲小 鼠，紀錄耳朵組織厚度變化，發現三個時間點都達到誘發小鼠耳朵腫脹的 效果(圖 4-14)，接著取下鼠耳組織均質，均質液以 ELISA 方法分析促發炎 細胞激素 IL-6 和 IL-1β，發現 IL-1β 在刺激 12 小時後可生成最高的量(圖 4-15)， 而 IL-6 則是刺激 6 小時後較高(圖 4-16)。我們選擇以刺激 12 小時作為後續 \實驗的模式。 接下來將 P. acnes 和樣品一起注射，實驗 B 注射 P. acnes 與 FL1-FL7 於 12 小時後犧牲小鼠，從外觀上來看，FL1-FL7 皆比單純注射 P. acnes 組 紅腫程度較輕微(圖 4-17)；在厚度方面，FL1-FL7 皆能顯著降低 ICR 小鼠耳 朵的厚度，降低 P. acnes 刺激所造成之腫脹現象(圖 4-18、表 4-1)。之後將 鼠耳磨碎均質，組織均質液以 ELISA 方法分析促發炎細胞激素 IL-6、IL-1β 和 TNF-α，發現 FL1-FL7 對於 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 皆有抑制的效果 (圖 4-19、圖 4-20 和圖 4-21)，FL1 -FL7 皆可顯著抑制 IL-6 和 TNF-α 的生成， 而 FL3 -FL7 可顯著抑制 IL-1β 的生成。. 52.
(62) 250 *. *. 6h. 12h. Ear thickness (% of PBS injected-ear). 200. *. 150. 100. 50. 0 control. 24h. with P. acnes injected. 圖 4-14 不同時間點 6、12、24 小時以 P. acnes 誘發 ICR 小鼠耳朵腫脹發炎 之影響 Figure 4-14 Time course of evaluation in vivo inflammatory activity of P. acnes induced ear edema. Ears of ICR mice were injected intradermally with P. acnes (6×107 CFU per 10 μl in PBS) or PBS alone for 6, 12, 24 hours. The ear edema in mice was evaluated by measuring the ear thickness. Values are means ± SD. The data were evaluated for statistical significance with one-way ANOVA followed by LSD tests. Asterisk indicate significant difference from the control group(* p＜0.001). Control: PBS alone.. 53.
(63) #. IL-1 concentration (pg/mL). 1000. c. control P. acnes. 800 # 600. b. # a. 400. 200. 0 6h. 12h. 24h. 圖 4-15 不同時間點 PBS 和 P. acnes 注射小鼠耳朵後組織均質液的 IL-1β cytokines 生成情形 Figure 4-15 Time course of IL-1β cytokines in homogenized ears after intradermally injection of PBS alone or P. acnes into the ears of ICR mice. Ears of ICR mice were injected intradermally with P. acnes (6×107 CFU per 10 μl in PBS) or PBS alone for 6, 12, 24 hours. Values are means ± SD. The data were evaluated for statistical significance with one-way ANOVA followed by LSD and Duncan’s multiple range tests. Pound sign indicates significant difference between the two bars(# p＜0.05). Control: PBS alone. Means with the same letter are not significantly different between P. acnes groups. Differences were considered significant for p＜0.05.. 54.
(64) 400. #. control P. acnes. IL-6 concentration (pg/mL). c # 300 b 200. 100 a 0 6h. 12h. 24h. 圖 4-16 不同時間點 PBS 和 P. acnes 注射小鼠耳朵後組織均質液的 IL-6 cytokines 生成情形 Figure 4-16 Time course of IL-6 cytokines in homogenized ears after intradermally injection of PBS alone or P. acnes into the ears of ICR mice. Ears of ICR mice were injected intradermally with P. acnes (6×107 CFU per 10 μl in PBS) or PBS alone for 6, 12, 24 hours. Values are means ± SD. The data were evaluated for statistical significance with one-way ANOVA followed by LSD and Duncan’s multiple range tests. Pound sign indicates significant difference between the two bars(# p＜0.05). Control: PBS alone. Means with the same letter are not significantly different between P. acnes groups. Differences were considered significant for p＜0.05.. 55.
(65) 圖 4-17 P. acnes 及 FL1-FL7 注射後 12 小時小鼠耳朵的外觀變化情形 Figure 4-17 Effect of intradermally injected with P. acnes and FL1-FL7. P. acnes (6×107 CFU per 10 μL in PBS) and FL1-FL7(20μg/10μL) was intradermally injected into the right ears of ICR mice for 12 hrs. Left ears did not inject anything.. 56.
(66) 250. Ear thickness (% of PBS injected-ear). 200 *. *. * *. *. *. *. 150. 100. 50. 0. control DMSO. FL1. FL2. FL3. FL4. FL5. FL6. FL7 (20g). with P. acnes injected. 圖 4-18、FL1-FL7 對 P. acnes 誘發 ICR 小鼠耳朵腫脹發炎之影響 Figure 4-18 Evaluation in vivo anti-inflammatory activity of FL1-FL7 on P. acnes-induced ear edema. Ears of ICR mice were injected intradermally with P. acnes (6×107 CFU per 10 μl in PBS) and FL1-FL7 (20μg per 10 μL) or PBS alone for 12 hours. The ear edema in mice was evaluated by measuring the ear thickness. Values were means ± SD (n = 6). The data were evaluated for statistical significance with one-way ANOVA followed by LSD tests. Asterisk indicates significant difference from the DMSO group(*p＜0.001). DMSO: P. acnes. Control: PBS alone.. 57.
(67) 抑制率(%) c. P. acnes. 0 ± 0.0 a, b. P. acnes + FL1. 33.9 ± 6.4 b. P. acnes + FL2. 27.8 ± 7.7 a, b. P. acnes + FL3. 37.9 ± 5.8. P. acnes + FL4. 36.3 ± 17.6. a, b. a. P. acnes + FL5. 38.3 ± 16.9. P. acnes + FL6. 30.7 ± 14.1. P. acnes + FL7. 27.0 ± 8.6. a, b. b. 表 4-1 FL1-FL7 抑制 P. acnes 誘發 ICR 小鼠耳朵腫脹發炎之效果(% 抑制率) Table 4-1 % Inhibition of FL1-FL7 on P. acnes-induced ear edema in vivo anti-inflammatory activity. Ears of ICR mice were injected intradermally with P. acnes (6×107 CFU per 10 μl in PBS) and FL1-FL7 (20μg per 10 μL). The ear edema in mice was evaluated by measuring the ear thickness. Values were means ± SD (n = 6). The data were evaluated for statistical significance with one-way ANOVA followed by Duncan’s multiple range tests. Means with the same letter are not significantly different between groups. Differences were considered significant for p＜0.05.. 58.
(68) 1000. IL-1 concentration (pg/mL). a. a. 800. *** a. *** a 600. *** a. ** a. * a. 400. 200. 0 control DMSO FL1. FL2. FL3. FL4. FL5. FL6. FL7 (20g/10L). with P. acnes injected. 圖 4-19 FL1-FL7 對於 P. acnes 注射 12 小時後小鼠耳朵組織均質液的 IL-1β cytokines 生成情形 Figure 4-19 The effect of FL1-FL7 on IL-1β cytokines induced by intradermally injection of P. acnes into the ear of ICR mice for 12 hrs. Ears of ICR mice were injected intradermally with P. acnes (6×107 CFU per 10 μL in PBS) and FL1-FL7 (20μg per 10 μL) or PBS alone for 12 hours. Values are means ± SD (n = 6). The data were evaluated for statistical significance with one-way ANOVA followed by LSD and Duncan’s multiple range tests. Asterisk indicates significant differences from the DMSO group(* p < 0.05, ** p < 0.01, ***p＜0.001). DMSO: positive control (with P.acnes), Control: negative control (PBS alone). Means with the same letter are not significantly different between treatment groups. Differences were considered significant for p＜0.05.. 59.
(69) IL-6 concentration (pg/mL). 250. 200. 150 * a. 100. * a * a. * a * a. 50. * a. * a. 0 control DMSO FL1. FL2. FL3. FL4. FL5. FL6. FL7 (20g/10L). with P. acnes injected. 圖 4-20 FL1-FL7 對於 P. acnes 注射 12 小時後小鼠耳朵組織均質液的 IL-6 cytokines 生成情形 Figure 4-20 The effect of FL1-FL7 on IL-6 cytokines induced by P. acnes into the ear of ICR mice for 12 hrs. Ears of ICR mice were injected intradermally with P. acnes (6×107 CFU per 10 μL in PBS) and FL1-FL7 (20μg per 10 μL) or PBS alone for 12 hours. Values are means ± SD (n = 6). The data were evaluated for statistical significance with one-way ANOVA followed by LSD and Duncan’s multiple range tests. Asterisk indicates a significant difference from the DMSO group(*p＜0.001). DMSO: positive control (with P.acnes), Control: negative control (PBS alone). Means with the same letter are not significantly different between treatment groups. Differences were considered significant for p＜0.05.. 60.
(70) TNF- concentration (pg/mL). 100. 80. 60. 40. ** a. ** a, b. ** a. FL2. FL3. * b ** a. ** a. ** a. 20. 0 control DMSO FL1. FL4. FL5. FL6. FL7 (20g/10L). with P. acnes injected. 圖 4-21 FL1-FL7 對於 P. acnes 注射 12 小時後小鼠耳朵組織均質液的 TNF-α cytokines 生成情形 Figure 4-21 The effect of FL1-FL7 on TNF-α cytokines induced by P. acnes into the ear of ICR mice for 12 hrs. Ears of ICR mice were injected intradermally with P. acnes (6×107 CFU per 10 μL in PBS) and FL1-FL7 (20μg per 10 μL) or PBS alone for 12 hours. Values are means ± SD (n = 6). The data were evaluated for statistical significance with one-way ANOVA followed by LSD and Duncan’s multiple range tests. Pound sign and asterisk indicate significant differences from the DMSO group(* p < 0.01, **p＜0.001). DMSO: positive control (with P.acnes), Control: negative control (PBS alone). Means with the same letter are not significantly different between treatment groups. Differences were considered significant for p＜0.05.. 61.
相關文件
二次導數 f‘’ 對函數 f
此極限便是觀察分子或者分母誰「跑得比較快」。若是分子 趨近無窮大的速度快很多，則極限為無窮大 ，若是分母快很 多，則極限便是
如果函數是由基本函數所組成，至少需要注意：分式函 數分母會等於 0
[r]
• Develop motor skills and acquire necessary knowledge in physical and sport activities for cultivating positive values and attitudes for the development of an active and
[r]
4.1 Extreme Values of Functions on Closed Intervals 4.2 The Mean Value Theorem.. 4.3 Monotonic Functions and the First Derivative Test 4.4 Concavity and
[r]
