3.2 Totally porous silica trapping column preparation
I. 取 10 cm L, 100 µm i.d.的中空毛細管，在一端填入 0.2 mm 的 Si60
粉末，再以高溫火焰鍛燒使其形成濾孔狀結構。
II. 取 10 mg pore size 200Å , particle size 5 µm totally porous silica C18 固定相填充材料置於 1.5 mL sample vial 中，並加入 1.2 mL methanol 與 stir bar，再將整個 vial 置入 pressure bomb 中並開啟
電磁攪拌。
III. 將毛細管未燒結的端口穿過 pressure bomb 系統上蓋，浸入含有填 充材料之 methanol，調整毛細管位置，鎖上 pressure bomb 系統上 蓋。
IV. 打開與系統所連接的高壓氮氣，提供約 60 bar 的背壓，即開始填 充管柱，待填充至 2 公分時，緩慢將毛細管拉離液面，並持續通 氣體 15 分鐘將管柱內殘留 methanol 吹乾，即可取下毛細管置於乾 燥箱中備用。
3.3 SDVB monolithic trapping column preparation
I. 取 50 cm L, 250 µm i.d. 的中空毛細管，依序使用 10 mL 1 M NaOH、
VI. 將步驟Ⅴ之聚合物溶液注入步驟Ⅳ之已活化內壁毛細管中，以耐熱 矽膠封住兩端開口，並將其浸入 75℃恆溫水浴中反應 16 小時，最 後以 80% ACN 洗除毛細管中所有未反應物。
3.4 Totally porous silica analytical column preparation
I. 取 20 cm L, 75 µm i.d. 的中空毛細管，在一端填入 0.2 mm 的 Si60，
3.5 HALO® fused core analytical column preparation
I. 取 10 cm L, 100 µm i.d. 的中空毛細管，在一端填入 0.2 mm 的 Si60，
再以高溫火焰鍛燒使其形成濾孔狀結構。
II. 取 10 mg pore size 90 Å particle size 2.7 µm HALO fused-core C18
固定相填充材料至於 1.5 mL sample vial 中，並加入 1.2 mL
3.6 SDVB monolithic analytical column preparation
I. 取 4 m L, 50 µm i.d. 的中空毛細管，依序使用 10 mL 1 M NaOH、
V. 取 200 μL styrene + 200 μL divinylbenzene + 550 μL ETOH + 50 μL 1-propanol + 5 mg AIBN，混和均勻後置於超音波震盪器內在 15℃
震盪 10 分鐘，以去除氣泡。 所配之六向閥、一個 peek microtee (IDEX Health & Science) 三向接頭、一 個連接高電壓的 metal union、2 cm L, i.d. 20 μm, o.d. 50 μm empty capillary emitter、一根 trapping column、一根 µ LC analytical column；連接系統管路 之毛細管皆為 50 µm i.d. empty capillary。
系統於前五分鐘的 loading mode 時，儀器配置設定如圖 20 所示，自動 進樣器的六向閥是處於 main pass 狀態，質譜儀上的六向閥是處於流通狀 態，此時 HPLC 以 2 µL/min 98% mobile phase A (2% ACN + 1% FA)進行溶 液輸出，由於 analytical column 提供相對較高的背壓，所以分析樣品及溶 劑均會通過 trapping column 直接導入廢液桶，胜肽樣品會被 trapping column 留滯住，經由五分鐘的沖洗，可以確定所有樣品皆以注入 trapping column 中；同時達到 online 濃縮去鹽的效果。在結束 5 分鐘的 loading mode 之後系統同步切換到 inject mode，系統設定如圖 21 所示，自動進樣器的六 向閥是處於 by pass 狀態以減少系統內體積，質譜儀上的六向閥是處於阻 塞狀態，此時 HPLC 流速為 0.3 nL/min，樣品直接被移動相依照梯度設定，
洗脫出 trapping column 進入 analytical column 中進行分離，再透過前端的 pre-column 做 on-line 去鹽濃縮，接著以每 200 nL/min 的流速，沖提胜肽樣 品進入逆相層析分離管柱，進行 100 分鐘如表一所示之梯度分離。
3.9 串聯式質譜儀掃描模式設定
連接在 HPLC 後端的 i.d. 20 μm, o.d. 50 μm empty capillary emitter 上施 加約 1000 V 電壓，利用電噴灑游離使胜肽樣品帶電並產生游離化，質譜 端使用 QTOF 串聯式質譜儀（QSTAR XL，Applied Biosystems Sciex）進行 分析，儀器構造如圖 22；胜肽離子在一開始的質譜分析時，會先做一個完 全 離 子 性 檢 視 質 譜 掃 描 (survey scan) ， 掃 描 所 設 定 的 範 圍 中 (400 amu-1700 amu)所有的離子訊號，在依照預先設定的即時資料判別模式 (information dependent acquisition，IDA) 進行碰撞裂解；IDA 參數設定如 下:針對前三強離子訊號、強度超過 20 counts、為正一價到四價的離子，進 行 CID 產生碎片離子，接著執行 MS/MS 分析，針對離子碎片掃描 75 amu-1700 amu 的範圍，當同一個目標離子進行 2 次 MS/MS 掃描後，將於
120 秒內不再對其掃描，質量誤差的容許範圍為 200 ppm。
質譜參數設定：
IonSpray voltage (IS)：1000 V through liquid junction (est.) Declustering potential (DP)：60 V
Focusing potential (FP)：265 V Declustering potential 2 (DP2)：15 V
Scan events : survey scan (400 amu-1700 amu 1 s) Product ion scan x 3 (75 amu-1700 amu 1, 1, 1.5 s）
3.10 資料分析
將所有經質譜分析的結果，利用 Mascot(version 2.3.2) 軟體來進行蛋白 質的鑑定，所使用的資料庫分別有 Swiss-Prot_v2013_06 以及自行建立的 fetuin sequence database；同時挑選 Mascot 比對後 p value < 0.05 的胜肽序 列 輸 入 online database ExPASy 分 析 grand average of hydropathicity (GRAVY) value。
MASCOT 搜尋參數設定如下：
Database：Swiss-Prot_v2013_06，fetuin Enzyme：Trypsin
Peptide charge：2+ ~ 4+
Fixed modifications：Carbamidomethyl (C) Variable modifications：Oxidation (M) Mass values：Monoisotopic
Peptide Mass Tolerance：± 0.2 Da (# 13C = 1) Fragment Mass Tolerance：± 0.2 Da
Max Missed Cleavages：1
Instrument type：ESI-QUAD-TOF
3.11 掃描式電子顯微鏡分析
本實驗所採用的電子顯微鏡分析儀為：JEOL 出產之 JSM-6510LV Series Scanning Electron Microscope；樣品先以鉑金屬進行表面濺鍍，濺鍍 時間為 60 至 80 秒，接續將樣品送入電子顯微鏡內掃描腔室中同時開啟真 空系統，當真空穩定後即啟動掃描式電子探針進行樣品表面分析。