比較粒子填充式與聚合式分離管柱搭配奈流液相層析串聯質譜儀分析法於蛋白質體學研究

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(1)國立臺灣師範大學化學系研究所碩士論文 Department of Chemistry, National Taiwan Normal University Master Thesis. 比較粒子填充式與聚合式分離管柱搭配奈流液相層析串聯質譜儀分析法於蛋白質體學研究 Comparison of SDVB-Monolithic & Bead-Based Columns Used in Nanoflow LC/MS for Proteomic Study. 研究生：宋祖儀. 撰. Graduate Student： Tsue-Yi Sung 指導教授：陳頌方博士 Advisor： Sung-Fang Chen, Ph.D. 中華民國一百零四年七月 July, 2014.

(2) 謝誌時光飛逝，兩年的碩士班生涯轉眼間即將結束，於此致謝陳頌方教授悉心的指導使我能一窺生化質譜學領域的奧妙；老師的諄諄教誨與教學熱忱讓我在這段時間內受益良多，同時透過實驗討論精進了解決問題的能力；除了學業上的教導外，平日討論時事議題更使我們受益匪淺，並帶領我們在球場上訓練體魄，讓 C404 大家感情更融洽時時充滿歡笑。在實驗室的時日我要謝謝所有成員；感謝芷葳學姐在學術面廣泛性的專業指導以及照料實驗室大家的日常生活並囊括大小事務的責任；感謝沛倫學長以專業的背景知識協助我解決實驗時遇到的問題並適時給予建議。感謝群皓學長認真的教導 QSTAR 與其他儀器的操作方式；善解人意的珮琳學姐樂於分享生活趣事；堯聰學長對實驗小技巧的傳授；熱情開朗的立平學姐提供多采的生活資訊。謝謝同學六年的羽薇散布歡笑氣氛；昀昇對於實驗數據分析的協助以及魚缸的照料；認真盡責的佳穎一同解決質譜儀的問題同時處理實驗室的雜務。謝謝善解人意的思樺隨時注意實驗小細節；做事井然有序的瓊文默默地提供協助；想法獨到的境晏分享不同的思維；婷婷、怡安、廷宇、詩潔，謝謝妳們在口試的幫忙。同時要感謝周綠蘋教授與辜韋智教授百忙抽空前來擔任我的碩士論文口試委員，並以不同的觀點來提點研究內容；感謝柏睿對於質譜儀無微不至的維護以及儀器進階操作的指導；感謝俊懋公司的曾鈺秀小姐對液相層析儀相關經驗傳授；再者感謝國立台灣師範大學化學系提供適合研究之學術環境。最後，要特別感謝爸爸媽媽與姐姐無條件的支持，讓我能將心思放在研究上，沒有家裡的照料與扶持就沒有今日的我，家人的親情永遠是我生命中最珍貴的支撐力量，謝謝你們。.

(3) 目錄目錄 ................................................................................................................................................... I 中文摘要 ........................................................................................................................................ III ABSTRACT ....................................................................................................................................IV 縮寫 .................................................................................................................................................. V 圖目錄 ..........................................................................................................................................VIII 表目錄 .............................................................................................................................................. X 第一章導論 ....................................................................................................................................... 1 1.1 前言......................................................................................................................................... 1 1.2 高效能液相層析法 .................................................................................................................. 2 1.3 管柱填充材料.......................................................................................................................... 4 1.3.1 Totally porous silica particle ............................................................................................. 4 1.3.2 HALO® fused core particle ................................................................................................ 5 1.3.3 Monolithic ........................................................................................................................ 6 1.4 質譜儀 ..................................................................................................................................... 6 1.4.1 電噴灑游離 .................................................................................................................... 10 1.4.2 四極柱串聯時間飛行式質量分析器 .............................................................................. 11 1.5 質譜蛋白質鑑定.................................................................................................................... 12 1.5.1 胜肽質量指紋法 ........................................................................................................... 12 1.5.2 胜肽碎片指紋鑑定 ....................................................................................................... 13 1.5.3 De Novo sequencing........................................................................................................ 13 1.5.4 醣基化修飾鑑定 ............................................................................................................ 14 1.6 研究動機 ............................................................................................................................... 14 第二章實驗材料 ............................................................................................................................ 16 2.1 樣品 ...................................................................................................................................... 16 2.2 材料 ...................................................................................................................................... 16 2.3 藥品 ...................................................................................................................................... 16 2.4 儀器設備............................................................................................................................... 17 第三章實驗方法 ............................................................................................................................ 19 3.1 蛋白質樣品製備 ................................................................................................................... 19 3.2 Totally porous silica trapping column preparation ................................................................... 19 3.3 SDVB monolithic trapping column preparation ....................................................................... 20 3.4 Totally porous silica analytical column preparation ................................................................. 21 I.

(4) 3.5 HALO® fused core analytical column preparation................................................................... 21 3.6 SDVB monolithic analytical column preparation .................................................................... 22 3.7 液相層析連結電噴灑游離化界面設定 ................................................................................. 23 3.8 樣品進樣 ............................................................................................................................... 24 3.9 串聯式質譜儀掃描模式設定 ................................................................................................ 24 3.10 資料分析............................................................................................................................. 25 3.11 掃描式電子顯微鏡分析 ...................................................................................................... 26 第四章實驗結果與討論................................................................................................................. 27 4.1 SDVB monolithic column preparation condition ..................................................................... 27 4.1.1 聚合物型態及濃度測試 ................................................................................................. 28 4.1.2 不同內徑毛細管效能分析 ............................................................................................. 29 4.1.3 不同管柱選配與承受進樣樣品量分析 .......................................................................... 30 4.1.4 製備步驟添加致孔劑測試 ............................................................................................. 31 4.1.5 SDVB monolithic 管柱製備優化條件 ............................................................................. 32 4.2 三種管柱應用於 Regular protein 分析之質譜分析結果........................................................ 33 4.3 三種管柱應用於 Glycoprotein 分析之質譜分析結果............................................................ 33 4.4 實驗所鑑定的胜肽親疏水性質分布 ..................................................................................... 34 4.5 實驗中所鑑定到的胜肽分子量分布 ..................................................................................... 35 4.6 實驗中不同管柱所鑑定的胜肽互補性差異.......................................................................... 35 4.7 三種分離管柱對 tryptic BSA 分析之全離子層析圖 ............................................................. 36 4.8 相同胜肽於不同管柱間沖提時間 ......................................................................................... 36 第五章結論與未來展望................................................................................................................. 37 圖表說明 ......................................................................................................................................... 38 參考文獻 ......................................................................................................................................... 91. II.

(5) 中文摘要在蛋白質體學的研究領域中，奈米級液相層析連接電噴灑游離源搭配串聯式質譜儀系統是相當重要的分析工具，當中以移動相不含鹽類的逆相層析法具有最好的儀器相容性與極佳的解析能力。本篇研究中，我們將採用 shotgun proteomics 分析策略，比較實驗室所自製的三種逆相層析毛細管分離管柱，並選用經胰蛋白酶水解之胜肽作為樣品，搭配串聯式質譜儀系統(QTOF)進行分析，藉此研究不同類型管柱對胜肽樣品分離特性。製備的毛細管分離管柱包括了兩種粒子填充式管柱 totally porous silica C18 particle (3 μm, 100 Å )、HALO® fused core C18 particle (2.7 μm, 90 Å )，與一種聚合式管柱 SDVB monolithic (50 μm X 400 cm)；並於實驗中優化 monolithic column 製備之條件，包括聚合物種類、單體濃度、毛細管內徑、致孔劑組成、進樣量等條件逐一進行測試。實驗結果顯示 40% SDVB 單體濃度添加 5% 1-propanol 作為致孔劑配合內徑 50 μm 的毛細管所製備的管柱具有最佳的分離效能，且 monolithic 管柱可大幅度的降低系統運作壓力。搭配 totally porous C18 作為 trapping column 下，四公尺的 SDVB column 能夠有效降低 co-elute 干擾與減緩離子抑制現象，因此可大幅提升整體訊號強度，並增加質譜分析時所得到的譜圖數目；同時於 GRAVY value 分析中可發現 SDVB 與 HALO® 能明顯提升親水性胜肽整體的鑑定比率；同時亦透過萃取離子層析圖(XIC)來分析胎球蛋白(fetuin)的醣基化胜肽，結果顯示 SDVB 與 C18 相較於 HALO® 能鑑別較多的醣基化胜肽。這種新型的固定相分離介質具有廣泛的操作便利性與極佳的分離效能，相信能在蛋白質體學的研究中能夠展現出更完備的應用性。. 關鍵字: 奈流液相層析，整體聚合，苯乙烯二乙烯苯共聚物，熔融核粒子，質譜儀 III.

(6) Abstract Nanoflow liquid chromatography coupled with electrospray tandem mass spectrometry (nanoLC-ESI-MS/MS) is a powerful tool in proteomic analysis. The preparation conditions for the SDVB-Monolithic column including the choice of monomer, inside diameter of capillary, and porogen are investigated. The performance of polymeric column was also compared and evaluated with micro particle-filled capillary columns, including a totally porous silica C18 column (75 μm x 100 mm, 3 μm, 100Å) and a HALO® fused core C18 column (75 μm x 100 mm, 2.7 μm, 90 Å). With all optimized conditions, the monolithic capillary column was prepared by in-situ polymerization of styrene and divinylbenzene (SDVB) inside a 4 meter-long, 50 μm i.d. fused silica capillary using 1-propanol as porogen. This continuous unitary porous structure provides more robust and high separation efficiency when comparing with the bead-based columns. Since the meter-long SDVB column could substantially reduce peptides co-elution and abate the ion suppression, the total ion current signal could be significantly enhanced with comparable flow rate and pressure. For the peptide identification in fetuin, the use of SDVB column in shotgun approach can identify more glycopeptides than HALO® column. The characterization of this novel monolithic media will be a promising addition to the stationary phase used in capillary column for proteome research.. Key words: nanoHPLC, monolithic, SDVB, fused core, mass spectrometry. IV.

(7) 縮寫 ABC. ammonium bicarbonate. ACN. acetonitrile. AIBN. azobisisobutyronitrile. BSA. bovine serum albumin. CID. collision induced dissociation. DTT. D,L-dithiothreitol. DMF. dimethylformamide. DPPH. 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl. ESI. electrospray ionization. EDMA. ethylene dimethacrylate. FA. formic acid. HPLC. high performance liquid chromatography. IAA. iodoacetamide. V.

(8) LC-MS. liquid chromatography mass spectrometry. MALDI. matrix assisted laser desorption/ionization. MS. mass spectrometry. MRM. multiple reaction monitoring. MCP. microchannel plate. MSMA. 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate. ODS. octadecylsilyl. NP. normal phase chromatography. PFF. peptide fragment fingerprinting. PMF. peptide mass fingerprinting. PTM. posttranslational modification. QTOF. quadrupole time of flight mass spectrometer. RP. reverse phase chromatography. SEM. scanning electron microscope. SDVB. styrene-divinylbenzene copolymers. VI.

(9) TFA. trifluoroacetic acid. TIC. total ion chromatogram. XIC. extracted ion chromatogram. VII.

(10) 圖目錄圖圖圖圖圖. 1. 高效能液相層析儀構造圖 ........................................................................... 38 2. 液相層析法示意圖 ...................................................................................... 39 3. HALO® fused core particle 結構示意圖 ..................................................... 40 4. Monolithic column 結構示意圖 .................................................................. 41 5. Totally porous particle；fused-core particle；monolithic 管柱擴散路徑示意. 圖圖圖圖. 圖 .................................................................................................................... 42 6. 電噴灑游離示意圖 ...................................................................................... 43 7. Quadrupole mass analyzer 構造示意圖 ...................................................... 44 8. TOF mass analyzer 構造示意圖 .................................................................. 45 9. Ion trap mass analyzer 構造示意圖 ............................................................ 46. 圖圖圖圖. 10. FT-ICR mass analyzer 構造示意圖 ........................................................... 47 11. Orbitrap mass analyzer 構造示意圖 ......................................................... 48 12. General bottom up and top down approach 蛋白質體學實驗流程......... 49 13. 本實驗所採用的 bottom up 蛋白質鑑定策略 .......................................... 50. 圖圖圖圖圖. 14. 粒子式管柱填充法 .................................................................................... 51 15. Porous silica particles 毛細管管柱示意圖................................................. 52 16. HALO® fused core particles 毛細管管柱示意圖 ...................................... 53 17. SDVB monolithic 毛細管分離管柱製備流程 ........................................... 54 18. SDVB 毛細管管柱示意圖 .......................................................................... 55. 圖圖圖圖圖. 19. 實驗流程示意圖 ........................................................................................ 56 20. HPLC 系統於 loading mode 分流架構...................................................... 57 21. HPLC 系統於 inject mode 分流架構......................................................... 58 22. 四極柱-飛行時間串聯式質譜 .................................................................... 59 23. 碰撞誘導解離模式示意圖 ......................................................................... 60. 圖圖圖圖. 24. 質譜儀中胜肽碎片離子型態 ..................................................................... 61 25. De Novo sequencing 示意圖 ....................................................................... 62 26. 不同固定相管柱連接質譜儀分析 TIC 圖 ................................................. 63 27. SDVB 單體濃度結構 SEM 圖 .................................................................... 64. 圖圖圖圖圖. 28. 40% SDVB 於不同內徑毛細管結構 SEM 圖 ............................................ 65 29. 添加致孔劑之 40% SDVB 管柱結構 SEM 圖 .......................................... 66 30. 優化製備條件後 monolithic 管柱 SEM 圖 ............................................... 67 31. Tryptic BSA 於實驗中經質譜儀鑑定之胜肽 GRAVY value 分布 ............ 68 32. Tryptic serum 於實驗中經質譜儀鑑定之胜肽 GRAVY value 分布 ......... 69. 圖 33. Tryptic fetuin 於實驗中經質譜儀鑑定之胜肽 GRAVY value 分布 .......... 70 圖 34. Tryptic BSA 於實驗中經質譜儀鑑定之胜肽分子量分布 ......................... 71 圖 35. Tryptic serum 於實驗中經質譜儀鑑定之胜肽分子量分布 ....................... 72 VIII.

(11) 圖 36. Tryptic fetuin 於實驗中經質譜儀鑑定之胜肽分子量分布 ....................... 73 圖 37. Tryptic BSA 於實驗中經質譜儀鑑定 unipeptides Venn diagram ............ 74 圖 38. Tryptic serum 於實驗中經質譜儀鑑定 unipeptides Venn diagram ......... 75 圖 39. Tryptic fetuin 在三種管柱實驗中經質譜儀鑑定 unipeptides Venn diagram ........................................................................................................................ 76 圖 40. Tryptic BSA 於實驗中經質譜儀分析之全離子層析圖 ............................. 77 圖 41. 兩段胜肽於實驗中經質譜儀分析之萃取離子層析圖............................... 78. IX.

(12) 表目錄表 1. 100 分鐘液相層析梯度表 ............................................................................. 79 表 2. Tryptic BSA 於不同管柱間組合實驗與不同管柱內徑實驗之質譜鑑定結果 ........................................................................................................................ 80 表 3. Tryptic serum 於不同管柱間組合實驗與不同管柱內徑實驗之質譜鑑定結果 .................................................................................................................... 81 表 4. Tryptic fetuin 於不同管柱間組合實驗與不同管柱內徑實驗之質譜鑑定結果 ........................................................................................................................ 82 表 5. Tryptic BSA 於不同致孔劑所製備管柱之質譜鑑定結果 ........................... 83 表 6. 不同進樣量的 Tryptic BSA 對 C18 與 SDVB 管柱之分離結果 ................ 84 表 7. 不同進樣量的 Tryptic serum 對 C18 與 SDVB 管柱之分離結果 ............. 85 表表表表. 8. 不同進樣量的 Tryptic fetuin 對 C18 與 SDVB 管柱之分離結果 .............. 86 9. Tryptic BSA 在三種分離管柱中之質譜鑑定結果 ....................................... 87 10. Tryptic serum 在三種分離管柱中之質譜鑑定結果 .................................. 88 11. Tryptic fetuin 在三種分離管柱之質譜鑑定結果 ....................................... 89. 表 12. Fetuin 中醣基化胜肽比對結果 .................................................................. 90. X.

(13) 第一章導論 1.1 前言. 在質譜儀系統與分離設備的快速進步下，蛋白質體學的研究出現了大幅度成長。透過使用軟性游離技術如電噴灑游離法 (electrospray ionization, ESI) 與介質輔助雷射脫附離子化 (matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)，可進行大分子化合物的分析；使用生化質譜進行蛋白質體學鑑定時大多採用 top down 或 bottom up 實驗流程，top down 法直接游離完整蛋白質，並利用高解析質譜進行分析，bottom up 法則將大分子量蛋白質降解成胜肽，水解後胜肽具有高度複雜度，因此透過液相層析分離來降低樣品複雜度，並由 ESI 作為其與串聯式質譜儀的游離化介面，可有效的提升鑑定效能。液相層析主要是透過樣品與分析系統間交互作用力差異來達到分離純化的效果 1；透過改變移動相 (mobile phase) 與固定相 (stationary phase) 組合產生不同的分離特性。質譜儀為量測帶電粒子質荷比的分析儀器，具高靈敏度 (sensitivity)、高解析度 (resolution)、高準確度 (mass accuracy) 及偵測動態範圍廣 (dynamic range) 等特性。電噴灑游離是透過施加高壓電使毛細管內液體產生游離，迫使液相中分析物轉為帶電離子，本身為軟性游離法，不會破壞分析物本身結構特徵，同時可作為良好的液氣相轉換介面，所形成的離子大多攜帶多價電荷，可使高分子量分析物的質荷比 (m/z) 落於質譜儀的偵測範圍內，因此廣泛應用於大分子化合物的鑑定；由於 ESI 本身游離效能極易受鹽類抑制，同時具有高度濃度依賴 (concentration dependent) 的特性，因此在蛋白質體學所應用的液相層析串聯質譜儀系統 1.

(14) 中，大多選用與 ESI-MS 具有高度儀器相容性的逆相層析法，同時搭配毛細管分離管柱來提升單位時間內濃度。分離管柱是液相層析系統的核心元件，扮演著降低樣品複雜度的角色，傳統上逆相層析法選擇使用由矽烷基構成的疏水性長碳鏈分子，如 C4、 C8 或 ODS，沖提液多為 pH 2 - 8 的中高極性溶液，透過樣品本身疏水性質不同來達到分離的效果，經常用於蛋白質、胜肽與核苷酸的分離純化實驗，具高解析度、高再現性的特點。逆相層析管柱所使用的固定相組成，除了傳統的全多孔球性固定相粒子 (totally porous silica particle)，隨著微粒子材料製程技術提升，出現了熔融核式粒子 (core shell particle)，主要結構差異在於粒子中心核為實心固態，並於核外側修飾上固定相基團；另一種類型為本篇實驗中將提及的 monolithic polymer 管柱，此類型管柱是由高分子化合物直接在管壁內進行聚合，產生具一致性結構的固定相結構，與傳統粒子填充式管柱最大差異在於其系統壓力極低，同時大幅度降低擴散效應，因此可有效提升分離效能 2-4。本實驗中將針對 monolithic column 的製程條件進行優化，並與 totally porous silica particle 以及 HALO® Fused-Core Particle 所填充的分離管柱進行一系列測試，且評估各管柱的分離特性 5。. 1.2 高效能液相層析法. 高效能液相層析 (high performance liquid chromatography，HPLC) 是在 1960 年代末期發展的新型分析技術，隨著科技進步與硬體系統改良，現今的 HPLC 具備高靈敏度、高解析能力與高度自動化操作的優點，目前廣泛應用於食品、環境、毒化物以及多數的檢測流程中，基本儀器硬體組成如圖 1 所示。層析技術主要是透過分析物在固定相 (stationary phase) 與 2.

(15) 移動相 (mobile phase) 之間交互作用力差異做為分離依據，根據分析物本身結構特性、組成成分或官能基團特性等，可選擇不同的分離條件作為實驗配置；基於分析物與管柱固定相間有不同程度的交互作用力，隨著時間改變移動相組成 (gradient) 或是增加沖提時間 (isocratic)，即可將滯留在分離管柱內的分析物洗脫，再藉由偵測器對分析物特徵分析即可得到定性與定量訊息。 HPLC 的系統元件中除了分離管柱外，還有液壓幫浦供應系統、偵測裝置等部分。基本分析步驟: 首先樣品會先以該實驗配製的起始 mobile phase 回溶，透過進樣器導入樣品，隨著移動相流入分離管柱並滯留於內，接著可選用兩種沖提方式進行分離，分別是 isocratic 與 gradient，在大多數蛋白質體分析中皆會採用 gradient 沖提方式，主要是因為不同的胜肽有著相異的親疏水性質 6，因此透過改變移動相組成才能有效並快速的分離樣品，樣品離開分離管柱後會進入檢測系統進行鑑定，此部分亦可依樣品性質採用不同形式偵測法，如紫外可見光吸收儀 (UV-visible absorption detector)、螢光偵測器 (fluorescence detector)、折射率偵測器 (refractive index detector)，亦可直接選擇質譜儀作為分析器。現今的儀器設計為了提升解析度及縮短分析時間，大多採用幫浦系統來增加移動相的移動速率，同時亦提供了穩定的液體流動性；在 HPLC 的所有元件系統中，分離效能主要由分離管柱的特性來決定，管柱可依據長度、內徑、粒子種類、填充粒子大小、粒子表面孔洞大小，等來提供不同程度的分離效果。分離管柱是提供樣品分離的主要區域，其分離方式可分為圖 2 所示的四種；大分子化合物大多進行吸附層析法 (adsorption chromatography)分離，依據樣品在移動相間吸附能力不同來做為分離，必須採用 gradient 沖提才能達到完整分離效果，又可分為正相層析法 (normal phase) 與逆相層析法 (reversed phase），正相層析法中固定相的極性高於移動相，樣品溶於在高 3.

(16) 極性移動相內注入系統中；逆相層析的組成則與正相層析完全相反；小分子化合物則較常進行分配層析法 (partition chromatography)分析，可選用 isocratic 或 gradient 作為沖提模式，在樣品與固定相表面具有吸附能力下條件下，移動相會與樣品競爭固定相吸附面，進而沖提出樣品；離子交換層析法 (ion-exchange chromatography) 主要用於分離帶電荷物質，管柱內固定相由帶電樹脂構成，移動相可透過添加鹽類來產生電荷性競爭，或是改變酸鹼值使分析物電荷價數產生變化，並透過庫倫作用力來達到分離效果；排除或膠體層析法 (exclusion or gel chromatography) 大多用於不同分子大小或分子量化合物之分離，主要是利用樣品大小不同在固定相中移動路徑差異進行時間性的篩選。. 1.3 管柱填充材料. 分析管柱中所含的固定相決定了該管柱的分析能力，透過使用不同的固定相組成即可分離不同性質與種類的化合物 7,8；現今所採用的填充結構大多為粒子式 9-11，與整體聚合式兩種 12,13；粒子填充式管柱會先合成具有不同性質的固定相顆粒，再填充進入管柱中作為分離管柱. 14,15. ；整體聚合. 式管柱則採用高分子單體做為固定相，並於管柱內誘發聚合連鎖反應以產生固定相結構。. 1.3.1 Totally porous silica particle Totally porous silica particle 全多孔球型矽膠顆粒，最早在 1960 年代開始被應用於層析法中，由於當時的製程技術不發達，導致平均顆粒粒徑大約為 100 μm 左右，使得管柱分離效能極差。Horvath 成功開發出 40 μm 的 4.

(17) totally porous silica particle，此種固定相粒子透過縮小粒徑與增加表面多孔性結構，有效的提升了質量傳輸以及分析的效能 16。隨著技術的進步終於在 1970 年由 Kirkland 成功製備出平均粒徑 7 μm 的 totally porous silica particle，透過粒子半徑的縮小以及固定相修飾技術的進步，使得管柱的穩定度以及再現性大幅增進，同時亦提升了管柱的分析效能。. 1.3.2 HALO® fused core particle HALO fused core particle 熔融核式粒子最先於 2007 年由 Kirkland 提出，外觀基本構型與 totally porous silica particle 同為球狀構型，但其內部為實心球狀核心，並於外層包覆固定相材料使整個粒子達到 2.7 μm，表面孔洞大小為 90 Å ，與 totally porous silica particle 比較之下 HALO fused core particle 有較小的擴散路徑 17,18，如圖 3 及圖 5 所示。透過 van Deemter equation：H = A + B/u + C · u，來比較 HALO fused core 與 totally porous silica 這兩種粒子；A 值 (eddy diffusion) 主要是分析物在填充粒子間移動路徑不同所產生，由於 HALO 粒子粒徑具較高一致性，因此可較為緊密的填充於管柱中，同時減少固定相內空腔體積，能有效的降低約百分之四十的 A 值；B 值 (longitudinal diffusion) 則與樣品本身濃度擴散相關，透過 HALO 本身的固體核心，可降低約百分之二十的軸相擴散現象；C 值 ( mass transfer resistances) 則是分析物與固定相間的分配平衡效率，透過實心內核能使樣品分子擴散路徑縮短，連帶讓平均擴散路徑縮短，藉此加速分析物與固定相間的質量傳輸平衡，以降低波峰寬度 19；從理論分析來看 fused core particle 的分析效能較 totally porous particle 佳，在提升流速的實驗條件下，HALO 的理論板高並不會急遽的升高；同時在與 1.7 µm 粒子填充管柱條件比較下，能降低大約一半的系統壓力 11,20-25。 5.

(18) 1.3.3 Monolithic Monolithic 最早在 1950 年代由 Synge 所提出，起先這項技術是以 ” 連續多孔性膠狀結構”應用於膠狀碟盤的製程中；1960 年代才被以”單一結構固定相”的概念應用在 HPLC 管柱中 26,27。Monolithic 的主要概念是透過小分子單體的聚合反應來產生有相同性質的孔狀結構. 28,29. 。此技術. 應用於層析管柱的優點在於，沒有將粒子顆粒填充在管柱中，可顯著降低系統運作壓力同時可以大幅度抑制擴散現象的發生以提升分離效能. 30. ，. 樣品擴散路徑如圖 5 所示。同時 Monolithic 管柱的操作便利性也較粒子填充式管柱高，可依實驗設計變更管柱長度、內徑 28,29、流速 31-33、聚合物單體組成等條件. 34-38. ，藉此得到更便捷的高效能分析管柱. 39-43. ；其次. 由於所有的固定相都是相同的物質構成，可除去固定相修飾反應的缺陷，亦可透過與固定相內壁的鍵結來提升管柱對酸鹼及溫度的穩定性降低移動相的使用限制. 46. 44,45. ，. ；近年常見的實驗大多以改變聚合物單體種類. 來增加管柱的解析力與應用性 31,47-53，同時也有以 monolithic 為基礎結構. 再另修飾上酵素基團 54-58、金屬 59、粒子參雜 33,34,60 的實驗應用，以增加固定相實用性 61-70，本實驗所製備之 monolithic 結構如圖 4 所示。. 1.4 質譜儀. 質譜儀為分析離子質量之工具，於 1913 年由諾貝爾物理學獎得主 Thomson 提出基礎儀器原理；質譜儀主要利用是測量帶電粒子的質荷比 (mass to charge ratio，m/z) 來得到分析物分子量，具有高度解析能力、高靈敏度、高專一性等優點，是應用範圍相當廣泛的分析儀器；質譜儀系統元件可分為三大部分；游離源、質量分析器以及訊號偵測器。基本分析流 6.

(19) 程為樣品經由離子源離子化後，進入質量分析器透過時間或是空間性分離進行篩選，再由偵測器蒐集放大訊號後輸出。游離源 (ion source) 主要功用是使中性分子轉為帶電荷離子，依樣品種類不同可採用：氣相游離法 (如 electron ionization、chemical ionization)、雷射去吸附法 (laser desorption)、電漿去吸附法 (plasma desorption) 、快速原子撞擊法 (fast atom bombardment)、電噴灑游離法 (electrospray ionization)、介質輔助雷射脫附離子化游離法(matrix-assisted laser desorption ionization)71,72、大氣壓力游離法 (atmospheric pressure chemical ionization)等方式。樣品再經過游離源後會轉為氣相離子並透過壓力與電位差進入系統中的質量分析器進行分析，現今常使用的質量分析器有下述幾種構型，四極柱 (quadrupole analyzer， Q)、飛行時間 (time of flight analyzer，TOF)、離子阱 (ion trap analyzer，IT)、傅立葉轉換離子迴旋共振 (fourier transform ion cyclotron analyzer，FT-ICR)、軌道阱 (orbitrap analyzer)，可依解析能力、掃描速度、系統運作原理等進行不同分類。四極柱式質量分析器 (Q) 由兩組電荷相反的四根平行電極柱體構成，如圖 7 所示，可使離子以螺旋狀簡諧震盪 (Simple Harmonic Motion，SHM) 運動行進，透過控制交流電與直流電比值產生特定電場，讓特定的 m/z 值的離子能穿越電極柱，異於該 m/z 值的離子則會直接碰撞電極柱而去離子化，在被真空系統排出；四極柱式質量分析器具有高度的操作便利性及系統穩定度，惟受限於質量掃描範圍較為狹隘；除了作為質量分析器，四極柱本身亦可透過設定電流參數值作為離子聚焦傳輸器使用，同時可增加電極柱數目來增進離子穩定效果。飛行時間式質量分析器 (TOF) 屬於高解析質量分析器，可分辨分子量差異達小數點以下四位，同時可偵測的質量範圍相當大，可達 1000000 m/z 左右，廣泛應用於大分子生化樣品的分析中，同時本身具有質量分析器與 7.

(20) 偵測器的功能，結構設計如圖 8 所示；分析原理主要是基於能量守恆定理，當離子在靜電場中受力產生動能，再加速送入真空腔體進行自由飛行，由於飛行距離（L）是已知的常數，只要精確記錄的離子飛行時間（t），可得到離子的速度（v = L/t），而離子的動能 E 可由儀器設定得知，運算 E =（1/2） mv2 即可得到離子的質量，再透過高解析掃描模式判別離子價數後回推即可得知該離子之實際質量。離子阱式質量分析器 (IT) 為儲存式的質量分析器，可將離子的儲存、裂解、與分析掃描於同空間內進行，具有極高靈敏度；離子阱質譜設計上以一個環狀電極 (ring electrode) 以及兩個端蓋電極 (end cap electrode) 所構成，如圖 9 所示，只透過交流電來做電場的控制，並利用三軸向電場作為 trapping，分析原理是依據 Mathieu equation 所推導出的穩定區圖 (stable diagram)，在該方程式中離子於 z 軸方向會存在不穩定區，具有質量選擇性拋出的特性；透過改變固定頻率的振幅，使的 z 軸產生不穩定區，讓落於穩定區邊界不同質荷比的離子被依序拋出，現今多使用共振拋出法 (resonance ejection)來提高解析度，共振拋出是指利用離子阱的環電極 (ring electron)所產生的正弦波電壓與頻率，限制特定質荷比範圍的離子運動軌跡，此時透過在端蓋板 (end cap)上施加微弱交流電，促使離子阱內離子迴旋頻率會端蓋板上交流電的頻率相同產生共振，離子吸收額外的能量，增加在 z 軸方向的振動幅度而被拋出離子阱，再以電子倍增器 (electron multiplier) 放大訊號，並搭配類比轉數位器記錄訊號強度 73。傅立葉轉換離子迴旋共振式質量分析器 (FT-ICR) 具有極高的解析能力與極佳的準確度，其儀器構造主要由一組電極板，與高穩定均勻強磁場構成，如圖 10 所示，離子樣品進入分析器後會因為磁場於腔室內產生迴旋，透過激發電極板來控制離子產生不同迴旋半徑並得到具專一性之感應電流，透過傅立葉邏輯運算轉換可得離子分子量與相對強度；系統是依據 8.

(21) 感應電流頻率來得到分子量，使得其準確度與解析能力遠優於同為高解析系統的 TOF analyzer，主要缺點為產生高磁場的超導體設備維護不易。軌道阱 (orbitrap)，同樣為具有高解析與高準確度之質量分析器，最早於 1920 年由 Kingdon 提出並於 2001 年由 Thermo Fisher Scientific 推出商用機型；orbitrap 由中央電極與紡錘狀腔室構成，本身可作為質量分析器與偵測器；透過中央電極增加直流高電壓，離子進入後受到中心電場的吸引會產生圓周軌道運動，透過改變紡錘狀外腔電極來影響不同離子的運行軌跡，並即時將感應電流透過傅立葉邏輯運算，計算出分子量與相對強度等資訊，如圖 11 所示；orbitrap 的硬體系統設計上具有高度穩定性，雖於 FT-ICR 一樣透過傅立葉轉換來運行，但其不需要高強磁場的特性使得運轉成本大幅降低。除了上述由單一質量分析器所構成的質譜儀系統外，現今所使用的質譜儀系統大多包含兩個或以上的質量分析器以增加應用性，即稱串聯式質譜儀 (tandem mass spectrometry，MS/MS)，串聯式質譜儀主要將數個質量分析器依時間或空間進行連接，可於分析過程中挑選特定離子並將其加以裂解 (MS/MS) 進而得到離子碎片資訊。硬體設計可分為時間串聯式與空間串聯式兩種類型。時間串聯式設計為在不同時間內以相同質量分析器進行分析，如離子阱質譜儀 (IT) 及傅立葉轉換質譜儀 (FT-ICR)，此類型系統透過保留離子可連續進行多次的碰撞碎裂；空間串聯式則是指在相同時間內以不同質量分析器進行分析，可於第一段質量分析器篩選離子後進行碎裂再送入第二段質量分析器分析，如三段四極柱質譜儀 (QQQ)、四極柱飛行時間式質譜儀 (Q-TOF)、飛行式串聯質譜儀 (TOF-TOF)。常見的碎裂模式包括碰撞誘導解離 (collision induced dissociation，CID) 圖 23、電子捕捉式解離 (electron capture dissociation，ECD)、電子轉移式解離 (electron transfer dissociation，ETD)。 9.

(22) 串聯式質譜儀的掃描偵測模式主要可分為四類，第一種為碎片離子掃描 (product ion scan)，選擇已知特定分子量為前驅離子並進行碎裂產生 MS/MS 圖譜後分析其碎片離子碎片，常應用於小分子結構判讀、蛋白質鑑定、蛋白質後轉譯修飾位點分析或是解讀蛋白質序列 (de Novo sequencing)；第二種為前驅離子掃描 (precursor ion scan)，此模式主要應用在於混合物中尋找特定結構之分子量，如小分子代謝產物鑑定及蛋白質分析中特定後轉譯蛋白搜尋；第三種為中性丟失掃描 (neutral loss scan)，應用於偵測特殊碎片所丟失之中性分子；第四種為多重反應模式 (multiple reaction mode， MRM)，此模式透過選擇特定前驅離子與其碎裂後所產生的碎片離子分子量組合進行分析，目前以三段式四極住質譜儀 (triple quadrupole，QQQ) 搭配上 MRM 掃描模式為小分子定量的黃金標準，其定量檢測靈敏度與線性範圍極佳。. 1.4.1 電噴灑游離電噴灑游離法於 1984 年由 Fenn 首度提出 74，當溶液流經施加高電壓的毛細管，溶液中的離子會受到電場影響產生偏極化，負電荷離子會往正極方向移動，正電荷離子則受到排斥聚集於毛細管口產生泰勒錐(Taylor cone)，如圖 6 所示，當正電荷離子累積的靜電排斥力大於表面張力時即會產生電噴灑情形 75；電噴灑的離子液珠則透過電位差與壓力差朝向質譜儀前進，在飛行過程中溶劑揮發使得帶電液珠表面電荷密度增加，當庫倫排斥力大於液體表面張力時就會使帶電液滴分裂，再分裂反應之後，分析物形成帶多價電荷的氣相離子進入質譜儀中進行分析. 76. ；同時由於 ESI 為. concentration dependent 游離源，因此目前大多數生化質譜分析中多採用毛細管作為系統進樣連結方式，可以大幅提高靈敏度與降低樣品用量 77。 10.

(23) 1.4.2 四極柱串聯時間飛行式質量分析器. 四極柱串聯時間飛行式質量分析器 (quadrupole time of flight mass spectrometer，QTOF) 廣泛的被應用於生化大分子的分析中，具有高度解析能力；大多採用 ESI 和 MALDI 作為游離源進樣。硬體構造部分由四極柱與飛行時間質量分析器串接構成，此節將以本實驗所採用的系統 ABI QSTAR-XL 為範例，其結構如圖 22 所示。儀器最前端由一組四極柱構成 Q0，固定維持 RF only 模式，作為聚焦離子與傳輸用，Q0 後端連接著第二組四極柱 Q1，Q1 有兩種模式可使用，在 RF only mode 下與 Q0 無異，DC mode 下則變為 mass filter，透過改變交直流電比例，讓特定質荷比離子進入後段系統；Q2 為碰撞室，腔內會導入少量惰性氣體分子，使其與待測離子進行碰撞，在完成碰撞後所有離子會在 Q2 後端再次聚焦，接著以 accelerator 對離子群進行偏向加速進入飛行時間質量分析器，該分析器本身為零電場真空腔體，離子受到相同的加速電壓進入飛行管中，透過能量守恆定理與量測離子抵達偵測器之時間便可推算其質量，此飛行管系統中配有一套由環電極所構成的離子鏡，主要功能是讓具有不同初速度之相同離子聚集，同時增加飛行路徑以提升解析能力。飛抵偵測器後由一套 microchannel plate 作為電子放大器，產生脈衝電流再透過 time to digital converter 產生質譜訊號。. 11.

(24) 1.5 質譜蛋白質鑑定. 傳統上鑑定蛋白質一級結構大多採用 Edman degradation 法逐步將胜肽轉為 PTH 衍生物，再以 HPLC 或電泳法依序分析生成的 PTH-amino acid，進而回推得到胺基酸序列，根據此原理所設計出的自動分析儀，只能可靠鑑別約 30 個左右的胺基酸殘基序列 78,79；現今多利用質譜儀直接進行蛋白質或是胜肽的質量分析，再將相關數據資訊以統計分析軟體運算，或人工比對圖譜得到該資訊。在應用質譜儀的蛋白質體學鑑定中，主要可分為 top down 以及 bottom up 兩種方法，如圖 12 所示，前者是直接將整體蛋白質離子化後送入質譜儀中分析，可以得到較為完整的結構序列以及後轉譯修飾資訊，主要缺點為所採用的儀器需要具有極高的解析度與準確度，同時需要較強的碰撞能量，目前僅有 FT-ICR 以及 orbitrap 可達到該實驗門檻；另一實驗為 bottom up 方式，又稱為 shotgun proteomics，此方法主要是透過特定蛋白質水解酶將蛋白質水解為分子量較小的胜肽，再搭配上分離步驟以降低樣品複雜度再進入串聯式質譜分析，大多數的實驗皆是採用此實驗流程，主要缺點在於增加了水解的步驟，容易使得後轉譯修飾與部分序列遺失。. 1.5.1 胜肽質量指紋法. 胜肽質量指紋法 (peptide mass fingerprinting，PMF) 採用直接比對酵素水解後胜肽分子量來辨別蛋白質身份；實驗透過蛋白質水解酵素將蛋白質水解成胜肽片段，基於蛋白質本身的不同，所產生的胜肽片段也會因為胺基酸組成上的差異出現不同的分子量分布，再將實驗結果與資料庫中已知序列的蛋白質進行胜肽分子量比對，即可判別該蛋白質的身份 80。 12.

(25) 1.5.2 胜肽碎片指紋鑑定. 胜肽碎片指紋鑑定 (peptide fragmentation fingerprint，PFF)，此鑑定方式必須在串聯式質譜儀 (tandem MS/MS) 系統下才能夠進行，是將胜肽在串聯式質譜儀中裂解後產生的碎片離子與資料庫相互比對，來得到胜肽與蛋白質序列資訊 81。在此技術中樣品與 PMF 一樣需要先經過蛋白質水解酶進行水解，再將樣品送入質譜儀中分析，但此實驗法會質譜分析時透過第一個質量分析器分析並篩選特定胜肽的質荷比做為前驅離子，送入碰撞室和惰性氣體產生碰撞，並將碰撞之動能轉換為內能，造成胜肽內化學鍵斷裂形成胜肽碎片，透過第二個質量分析器分析所有碎片質量；胜肽鍵的碎裂型態主要有三種，離子片段的命名如圖 24 所示，可分為為 a、b、c、x、 y、z 六種離子型態，a、b、c 為 N-terminal fragment，x、y、z 則為 C-terminal fragment，數字則代表該胺基酸於此胜肽之排序，透過此方式可於一次實驗中得到多個胜肽的可能序列，故比對的結果具有極高的正確率與特異性，常於蛋白質身份鑑定實驗中被採用。. 1.5.3 De Novo sequencing De Novo Sequencing 與 PFF 有著相似的鑑定系統，主要差別在於 De Novo Sequencing 並沒有直接透過資料庫系統的比對來確定蛋白質身分，而是先採用離子碎片進行序列推導，所得之序列再與資料庫進行比對來確定蛋白質身分，如圖 25 所示；在此鑑定方法中，蛋白質樣品也是先透過蛋白質水解酵素轉變為胜肽片段，再送入串聯式質譜儀進行分析，同樣的也是特過第一個質量分析器分析並篩選特定胜肽的質荷比做為前驅離子，送入碰撞室和惰性氣體產生碰撞，並將碰撞之動能轉換為內能，並造成胜肽 13.

(26) 內化學鍵斷裂形成胜肽碎片，透過第二個質量分析器蒐集所有碎片質量，接著再透過人工或是軟體比對圖譜中相鄰離子分子量差異，將分子量差異對應回胺基酸分子量或是修飾基團後分子量後，即可得知胺基酸序列組成。. 1.5.4 醣基化修飾鑑定. 蛋白質的後轉譯修飾 (post translational modification，PTM) 指在轉譯作用完成後針對蛋白質進行的化學性修飾；蛋白質生成過程中，從 DNA 轉錄 (transcription) 成 mRNA 再轉譯 (translation) 形成的蛋白質大多不具生物活性，需要透過後轉譯修飾來改變性質或構型以發揮完整的生物功能；常見的後轉譯修飾包括：醣基化修飾( glycosylation)、磷酸化修飾 (phosphorylation)、雙硫鍵修飾 (formation of disulfide bridges)、乙醯化 (acetylation)等；在真核細胞內醣基化修飾主要調節蛋白質活性，從結構類性上可分共價性鍵結 N-link (Asn residue) 與 O-link (Ser and Thr residue)，醣鏈的結構以葡萄糖 (glucose 與其胺類衍生物)、半乳糖 (galactose)、甘露糖 (mannose)、L- 果糖 (L-fructose)、 N-acetylneraminic acid 為主。. 1.6 研究動機. 在使用 bottom up 實驗流程作為蛋白質體學研究時，由於採用蛋白質水解酵素將蛋白質降解為胜肽片段，造成樣品複雜度急遽提升，必須透過有效的分離來降低單位時間內樣品的複雜度才可提升質譜鑑定效能，如圖 13 所示；透過結合高效能液相層析儀與串聯式質譜儀系統，可有效的增進此 14.

(27) 類型實驗中蛋白質的鑑定效率；本實驗採用具有高度解析能力的奈米級流速逆相層析法 (nanoflow RP HPLC) 連接電噴灑游離並搭配四極柱式飛行時間質譜儀做為硬體架構，並在實驗中選擇使用具有不同固定相組成的逆相層析毛細管分離管柱來分析胜肽樣品，同時比較各分離管柱之效能特性。實驗流程如圖 19 所示。實驗中採用實驗室所製備的粒子填充式 (bead based) 與聚合性 (monolithic) 毛細管管柱作為實驗主要操作變因；分別是全多孔球型矽膠顆粒 (totally porous silica particle) C18、熔融核式顆粒 (HALO fused-core particle) C18 ，苯乙烯 - 二乙烯苯共聚物 (SDVB monolithic)，透過使用上述三種固定相組成之毛細管分離管柱來分析三種不同蛋白質樣品，希望能夠找出各種管柱間的分離特性，同時亦針對 SDVB monolithic capillary 的製備過程條件進行一系列的製程條件優化。上述三種管柱製備流程如圖 14 至 18 所示。. 15.

(28) 第二章實驗材料 2.1 樣品. Bovine serum albumin (Sigma-AldrichA70906) Fetuin (Sigma-Aldrich ，F3004) 人類血清來自於健康女性自願者抽血提供，蒐集全血至 BD SST 血清分離膠管，以 3000-5000 rpm/min 離心十分鐘，在分隔血細胞與血清，取上層液體即為本實驗之血清標準品，凍於 -20℃備用。. 2.2 材料. Porcine trypsin (Sequencing Grade Modified, Promega) NUCLEOSIL 100-3 C18 (712370, Macherey-Nagel) PKG MTL HALO C18 (PM3/91100/00, Michrom Bioresources) Flexible empty fused silica capillary tubing (Polymicro Technologies). 2.3 藥品. 1-Propanol (Sigma-Aldrich，279544) 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (Sigma-Aldrich，D9132) 3-（Trimethoxysilyl）propyl methacrylate (Sigma-Aldrich，440159) Acetone (Sigma-Aldrich，650501) Acetonitrile (Merck，100665) 16.

(29) Ammonium bicarbonate (J.T.Baker，3003) Azobisisobutyronitrile (Sigma-Aldrich，11630) Decanol (Sigma-Aldrich，W236500) Dimethylformamide (Sigma-Aldrich，394963 Divinylbenzene (Sigma-Aldrich，414565) D,L-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich，D0632) Ethanol (J.T.Baker，32205) Ethylene dimethacrylate (Sigma-Aldrich，335681) Formic acid (J.T.Baker，0128) Hydrochloric acid (Sigma-Aldrich，72787) Iodoacetamide (Sigma-Aldrich，I1149) Methanol (Sigma-Aldrich，34860) Sodium hydroxide (Sigma-Aldrich，S8045) Styrene (Sigma-Aldrich，W323306). 2.4 儀器設備. 分析天平 (METTLER TOLEDO, AL104) 多功能試管震盪器 (Scientific Industries, G-560) 實驗室規格烘箱 (Fisher Scientific, Isotemp, 500 Series) 超純水系統 (Millipore, Direct-Q3) 電磁加熱攪拌機 (Thermo Scientific, Cimarec2) 高速低溫離心機 (Hitachi, CT15RE) 超音波震盪洗淨器 (DELTA, DC150H) 數字型恆溫乾浴器 (Major Science, MD-02N-110) 17.

(30) 桌上型離心機 (WHALE, PC-200) 真空離心式濃縮機 (miVAC, DUC-12060-C00) 電子防潮箱 (Eureka, AD-98) 質譜儀 (AB SCIEX, QSTAR XL) 高效液相層析系統 (Agilent Technologies, Agilent 1100,1200 series) 固定波段式紫外光燈 (UVP, UVLS-28）. 18.

(31) 第三章實驗方法 3.1 蛋白質樣品製備. I.. 將 1 mg 蛋白質標準品 (BSA)加入 250 μL 50mM ABC，並均分 5 等分，使每等分含有 200 μg 蛋白質標準品。. II. 於每份內添加 20 μL 200 mM DTT (in 100 mM ABC)，以 95℃加熱 5 分鐘進行打斷雙硫鍵之還原反應。 III. 待溶液冷卻至室溫，每管加入 8 μL 1 M IAA (in 100 mM ABC)，室溫下避光 45 分鐘，進行硫醇基團遮蔽之烷基化反應。 IV. 每管加入 40 μL 200 mM DTT (in 100 mM ABC)，室溫 45 分鐘以終止烷基化反應。 V. 以 Trypsin: protein (w/w) 1: 50，每管加入 4 μg trypsin，以石臘膜封口後置於 36℃水浴槽中，靜置 16 小時。 VI. 將所有反應液體蒐集至一管，以 ddH2O 潤洗其餘四管內壁，並將其回收後將樣品分管，再使用真空離心式濃縮機去除所有液體，凍於 -20℃備用。. 3.2 Totally porous silica trapping column preparation. I.. 取 10 cm L, 100 µm i.d.的中空毛細管，在一端填入 0.2 mm 的 Si60 粉末，再以高溫火焰鍛燒使其形成濾孔狀結構。. II. 取 10 mg pore size 200Å , particle size 5 µm totally porous silica C18 固定相填充材料置於 1.5 mL sample vial 中，並加入 1.2 mL methanol 與 stir bar，再將整個 vial 置入 pressure bomb 中並開啟 19.

(32) 電磁攪拌。 III. 將毛細管未燒結的端口穿過 pressure bomb 系統上蓋，浸入含有填充材料之 methanol，調整毛細管位置，鎖上 pressure bomb 系統上蓋。 IV. 打開與系統所連接的高壓氮氣，提供約 60 bar 的背壓，即開始填充管柱，待填充至 2 公分時，緩慢將毛細管拉離液面，並持續通氣體 15 分鐘將管柱內殘留 methanol 吹乾，即可取下毛細管置於乾燥箱中備用。. 3.3 SDVB monolithic trapping column preparation. I.. 取 50 cm L, 250 µm i.d. 的中空毛細管，依序使用 10 mL 1 M NaOH、 10 mL ddH2O、10 mL 1 M HCl、10 mL ddH2O、10 mL ACN 潤洗毛細管內壁並去除內壁雜質，再以 N2 流通 20 分鐘移除殘存液體。. II. 配置毛細管內壁活化溶劑，30% (V/V) MSMA + 0.5% (W/V) DPPH + 70% (V/V) DMF，混和均勻後置於超音波震盪器內在 15℃震盪 10 分鐘，以去除氣泡。 III. 將步驟Ⅱ之活化液體注入步驟一之毛細管內，並使用耐熱矽膠封住毛細管兩端，放入 110℃ 烘箱內 8 小時，使毛細管內壁基團修飾上 MSMA 支鏈。 IV. 取出後待其自然冷卻，以 10 mL ddH2O、10 mL ACN 洗除毛細管內殘餘試劑，再以 N2 流通 20 分鐘吹乾毛細管。 V. 取 200 μL styrene + 200 μL divinylbenzene + 600 μL ETOH + 5 mg AIBN，混和均勻後置於超音波震盪器內以 15℃震盪 10 分鐘，以去除氣泡。 20.

(33) VI. 將步驟Ⅴ之聚合物溶液注入步驟Ⅳ之已活化內壁毛細管中，以耐熱矽膠封住兩端開口，並將其浸入 75℃恆溫水浴中反應 16 小時，最後以 80% ACN 洗除毛細管中所有未反應物。. 3.4 Totally porous silica analytical column preparation. I.. 取 20 cm L, 75 µm i.d. 的中空毛細管，在一端填入 0.2 mm 的 Si60，再以高溫火焰鍛燒使其形成濾孔狀結構。. II. 取 10 mg pore size 100 Å particle size 3 µm totally porous silica C18 固定相填充材料至於 1.5 mL sample vial 中，並加入 1.2 mL methanol 與 stir bar，再將整個 vial 置入 pressure bomb 中並開啟電磁攪拌。 III. 將毛細管未燒結的端口穿過 pressure bomb 系統上蓋，浸入含有填充材料之 methanol，調整毛細管位置，鎖上 pressure bomb 系統上蓋。 IV. 打開與系統所連接的高壓氮氣，提供約 120 bar 的背壓，開始填充管柱，帶填充至 10 公分時，緩慢將毛細管拉離液面，並持續通氣體 45 分鐘將管柱內殘留 methanol 吹乾，即可取下毛細管置於乾燥箱中備用。. 3.5 HALO® fused core analytical column preparation. I.. 取 10 cm L, 100 µm i.d. 的中空毛細管，在一端填入 0.2 mm 的 Si60，再以高溫火焰鍛燒使其形成濾孔狀結構。. II. 取 10 mg pore size 90 Å particle size 2.7 µm HALO fused-core C18 21.

(34) 固定相填充材料至於 1.5 mL sample vial 中，並加入 1.2 mL methanol 與 stir bar，再將整個 vial 置入 pressure bomb 中並開啟電磁攪拌。 III. 將毛細管未燒結的端口穿過 pressure bomb 系統上蓋，浸入含有填充材料之 methanol，調整毛細管位置，鎖上 pressure bomb 系統上蓋。 IV. 打開與系統所連接的高壓氮氣，提供約 120 bar 的背壓，開始填充管柱，帶填充至 10 公分時，緩慢將毛細管拉離液面，並持續通氣體 40 分鐘將管柱內殘留 methanol 吹乾，即可取下毛細管置於乾燥箱中備用。. 3.6 SDVB monolithic analytical column preparation. I.. 取 4 m L, 50 µm i.d. 的中空毛細管，依序使用 10 mL 1 M NaOH、 10 mL ddH2O、10 mL 1 M HCl、10 mL ddH2O、10 mL ACN 潤洗毛細管內壁來清除內壁上雜質，最後再以 N2 流通 20 分鐘移除殘存液體。. II. 配置毛細管內壁活化溶劑，30% (V/V) MSMA + 0.5% (W/V) DPPH + 70% (V/V) DMF，混和均勻後置於超音波震盪器內 15℃震盪 10 分鐘，以去除氣泡。 III. 將步驟Ⅱ之活化液體注入步驟Ⅰ之毛細管內，並使用耐熱矽膠封住毛細管兩端，放入 110℃ 烘箱內 8 小時，以達成毛細管內壁支鏈基團修飾反應。 IV. 取出後待其自然冷卻，以 10 mL ddH2O、10 mL ACN 洗除毛細管內殘餘試劑，再以 N2 流通 20 分鐘吹乾毛細管。 22.

(35) V. 取 200 μL styrene + 200 μL divinylbenzene + 550 μL ETOH + 50 μL 1-propanol + 5 mg AIBN，混和均勻後置於超音波震盪器內在 15℃ 震盪 10 分鐘，以去除氣泡。 VI. 將步驟Ⅴ之聚合物溶液注入步驟Ⅳ之已活化內壁毛細管中，以耐熱矽膠封住兩端開口，並將其浸入 75℃恆溫水浴中反應 16 小時，最後以 80% ACN 洗除毛細管中所有未反應物。. 3.7 液相層析連結電噴灑游離化界面設定. 本實驗所設計的進樣系統如圖 20 及圖 21 所示，其中包含一組 Agilent 1200 series HPLC (Agilent)、一個 AB Sciex QSTAR XL mass spectrometer 所配之六向閥、一個 peek microtee (IDEX Health & Science) 三向接頭、一個連接高電壓的 metal union、2 cm L, i.d. 20 μm, o.d. 50 μm empty capillary emitter、一根 trapping column、一根 µLC analytical column；連接系統管路之毛細管皆為 50 µm i.d. empty capillary。系統於前五分鐘的 loading mode 時，儀器配置設定如圖 20 所示，自動進樣器的六向閥是處於 main pass 狀態，質譜儀上的六向閥是處於流通狀態，此時 HPLC 以 2 µL/min 98% mobile phase A (2% ACN + 1% FA)進行溶液輸出，由於 analytical column 提供相對較高的背壓，所以分析樣品及溶劑均會通過 trapping column 直接導入廢液桶，胜肽樣品會被 trapping column 留滯住，經由五分鐘的沖洗，可以確定所有樣品皆以注入 trapping column 中；同時達到 online 濃縮去鹽的效果。在結束 5 分鐘的 loading mode 之後系統同步切換到 inject mode，系統設定如圖 21 所示，自動進樣器的六向閥是處於 by pass 狀態以減少系統內體積，質譜儀上的六向閥是處於阻塞狀態，此時 HPLC 流速為 0.3 nL/min，樣品直接被移動相依照梯度設定， 23.

(36) 洗脫出 trapping column 進入 analytical column 中進行分離，再透過前端的 metal union 施加電壓於 i.d. 20 μm, o.d. 50 μm empty capillary emitter 達到電噴灑游離效果。. 3.8 樣品進樣. 將乾燥後凍於 -20℃的樣品溶於 HPLC mobile phase A (0.1% FA in 2% ACN)，並使用試管震盪器震盪以及桌上型離心機離心將其完全回溶，靜置於 4℃ 30 分鐘，接著將樣品瓶放置入自動進樣器，設定參數以及方法之後，連續進樣同一樣品三次，胜肽樣品先以 10 µL/min 的流速，先經由 pre-column 做 on-line 去鹽濃縮，接著以每 200 nL/min 的流速，沖提胜肽樣品進入逆相層析分離管柱，進行 100 分鐘如表一所示之梯度分離。. 3.9 串聯式質譜儀掃描模式設定連接在 HPLC 後端的 i.d. 20 μm, o.d. 50 μm empty capillary emitter 上施加約 1000 V 電壓，利用電噴灑游離使胜肽樣品帶電並產生游離化，質譜端使用 QTOF 串聯式質譜儀（QSTAR XL，Applied Biosystems Sciex）進行分析，儀器構造如圖 22；胜肽離子在一開始的質譜分析時，會先做一個完全離子性檢視質譜掃描 (survey scan) ，掃描所設定的範圍中 (400 amu-1700 amu)所有的離子訊號，在依照預先設定的即時資料判別模式 (information dependent acquisition，IDA) 進行碰撞裂解；IDA 參數設定如下:針對前三強離子訊號、強度超過 20 counts、為正一價到四價的離子，進行 CID 產生碎片離子，接著執行 MS/MS 分析，針對離子碎片掃描 75 amu-1700 amu 的範圍，當同一個目標離子進行 2 次 MS/MS 掃描後，將於 24.

(37) 120 秒內不再對其掃描，質量誤差的容許範圍為 200 ppm。. 質譜參數設定： IonSpray voltage (IS)：1000 V through liquid junction (est.) Declustering potential (DP)：60 V Focusing potential (FP)：265 V Declustering potential 2 (DP2)：15 V Scan events : survey scan (400 amu-1700 amu 1 s) Product ion scan x 3 (75 amu-1700 amu 1, 1, 1.5 s）. 3.10. 資料分析. 將所有經質譜分析的結果，利用 Mascot(version 2.3.2) 軟體來進行蛋白質的鑑定，所使用的資料庫分別有 Swiss-Prot_v2013_06 以及自行建立的 fetuin sequence database；同時挑選 Mascot 比對後 p value < 0.05 的胜肽序列輸入 online database ExPASy 分析 grand average of hydropathicity (GRAVY) value。. MASCOT 搜尋參數設定如下： Database：Swiss-Prot_v2013_06，fetuin Enzyme：Trypsin Peptide charge：2+ ~ 4+ Fixed modifications：Carbamidomethyl (C) Variable modifications：Oxidation (M) Mass values：Monoisotopic 25.

(38) Peptide Mass Tolerance：± 0.2 Da (# 13C = 1) Fragment Mass Tolerance：± 0.2 Da Max Missed Cleavages：1 Instrument type：ESI-QUAD-TOF. 3.11. 掃描式電子顯微鏡分析. 本實驗所採用的電子顯微鏡分析儀為：JEOL 出產之 JSM-6510LV Series Scanning Electron Microscope；樣品先以鉑金屬進行表面濺鍍，濺鍍時間為 60 至 80 秒，接續將樣品送入電子顯微鏡內掃描腔室中同時開啟真空系統，當真空穩定後即啟動掃描式電子探針進行樣品表面分析。. 26.

(39) 第四章實驗結果與討論圖 19 為整體實驗流程設計，蛋白質樣品以胰蛋白酶水解，於 arginine (R) 及 lysine (K) 的 C 端將蛋白質水解成胜肽；接著將樣品送入 nanoflow 液相層析電噴灑游離串聯式質譜分析；由於經胰蛋白酶水解之胜肽的分子量有一定質量分布區間，因此選擇以 400 amu - 1700 amu 進行 survey scan，同時經胰蛋白酶水解過後的胜肽殘基為 R、K 在酸性條件下易帶多價數正電，利於電噴灑游離化，在質譜儀中選擇三根最強訊號的離子進行 IDA 實驗並以碰撞誘導解離打斷胜肽鍵，形成 b 與 y 類型的胜肽碎片離子，再利用 Mascot 搜尋軟體以及 online software ExPASy 進行分析即可獲得下列資訊：鑑定到之蛋白質總數 (ID proteins)；MS/MS 圖譜總數 (spectra)；MS/MS 圖譜中所鑑定到胜肽圖譜數 (matched peptides)；扣除 matched peptides 中胜肽重複鑑定之結果 (unique peptides)，所鑑定到胜肽片段胺基酸佔蛋白質全部胺基酸數目的百分比 (sequence coverage)；所鑑定到胜肽之親疏水性質(GRAVY)。同時亦使用 Analyst 軟體針對含有醣基化修飾之樣品採以 XIC 方式進行醣基化胜肽分析。利用上述所有的資訊，即可比較不同類型樣品在三種具有不同固定相組成管柱中分離程度上的差異與各自的分離特性。. 4.1 SDVB monolithic column preparation condition 在此組實驗中我們選用 styrene、divinylbenzene 做為單體，並對 SDVB monolithic capillary 管柱製備條件進行測試，同時在與 totally porous silica C18 比較分析效能下，依序針對合成步驟中所有反應的條件進行下述一系列的優化。. 27.

(40) 4.1.1 聚合物型態及濃度測試. 在實驗最初我們嘗試使用 EDMA 以及 SDVB 做為 monolithic column 內部的聚合物，當中 EDMA 是採用紫外光活化式聚合，SDVB 則採取熱不穩式自由基聚合反應，以相同長度的 EDMA 與 SDVB 管柱在 MS scan 模式下分析 0.1 μg tryptic BSA，圖 26 為經不同管柱分離之 tryptic BSA TIC 結果，由圖中發現到兩種聚合物皆可以留滯胜肽樣品，但開始增加移動相中有機相組成比例 (elute) 時即發現到以 EDMA 作為固定相的管柱無法有效依親疏水程度對胜肽樣品進行分離；而以 SDVB 為固定相之管柱明顯可以隨著梯度改變有效分離胜肽樣品。另外我們發現到在將 SDVB monolithic 管柱與 totally porous silica C18 管柱相比時，totally porous silica 中所分離較為親水的胜肽群會在 SDVB 中產生更佳的的分離結果，因此推測固定相組成為 SDVB 的管柱能較 C18 管柱有效的分離親水性樣品。接續我們嘗試在聚合 SDVB monolithic 管柱時改變聚合單體濃度，希望能夠由此找出最適當的單體組成比例；從圖 27 的掃描式電子顯微鏡橫切面圖中發現，聚合物 (styrene、divinylbenzene= 1:1) 在 40%到 90% (Vpolymer/Vtotal) 的聚合比例中，當聚合物濃度大於等於整體體積比的 60%之後，聚合物本身會自行結成無明顯孔隙的柱狀結構，並與毛細管內壁修飾基團完全分離，且在 HPLC 的測試結果中毛細管完全堵塞，至於 40 及 50% 的濃度則以在 40%聚合條件下 HPLC 流通測試中有最小的背壓，故選用 40% (Vpolymer/Vtotal) 的 SDVB 作為後續 monolithic 管柱製備優化之參考條件。. 28.

(41) 4.1.2 不同內徑毛細管效能分析接著我們嘗試選用不同內徑的毛細管 (i.d. 50 μm、i.d. 75 μm、i.d. 100 μm、i.d. 250 μm) 來製備 40% SDVB monolithic 管柱，並觀察是否會在分離效能上有所差異；可由圖 28 觀察各管柱之橫切面圖差異，同時採用 tryptic BSA，tryptic fetuin，tryptic serum 作為樣品，並以串聯式質譜儀 (QTOF) 來實際測試各管柱對胜肽之分離能力，結果如表 2 至表 4 所示，表中我們列出在使用相同 trapping column 條件下 (4.1.3 節另討論不同 trapping column 對整體實驗影響) 比較內徑 75 m 的 totally porous silica C18 毛細管管柱，與內徑 50 m 及 75 m 的 SDVB monolithic 毛細管管柱之分離結果，當中所比較的鑑定資訊包括 MS/MS 圖譜總數(spectra)； MS/MS 圖譜所鑑定到胜肽之圖譜數 (matched peptides)；扣除 matched peptides 中胜肽重複鑑定之結果 (unique peptides)，所鑑定到胜肽片段胺基酸佔蛋白質全部胺基酸數目的百分比 (sequence coverage)。比較實驗結果可發現內徑 50 m 的 SDVB 管柱所分析的 tryptic BSA 鑑定結果明顯優於內徑 75 m 的 totally porous silica C18 管柱與內徑 75 m 的 SDVB 管柱。0.4 μg tryptic fetuin 分析鑑定結果中除了 sequence coverage 之外，內徑 50 m 的 SDVB 管柱亦優於內徑 75 m 的 SDVB 管柱與內徑 75 m 的 C18 管柱。0.4 μg tryptic serum 分析鑑定結果中 SDVB 管柱所鑑定到的圖譜總數較其餘兩者多，但總蛋白質數目則略少於 C18 管柱。同時在整體條件測試實驗中發現，不論是在哪種 trapping column 組合中，由 monolithic 技術所製成的 SDVB column 所反應出的系統整體壓力皆遠遠低於以粒子填充的毛細管管柱。. 29.

(42) 4.1.3 不同管柱選配與承受進樣樣品量分析. 除了前節所提及的內徑差異外，在此我們亦比較不同管柱組合效能，希望能夠藉此找出 SDVB 與 C18 管柱更多特性。在實驗中我們選擇 6 cm L, i.d. 250 μm 的 SDVB trapping column 與 2 cm L, i.d. 75 μm 的 C18 trapping column 來比較 trapping 效能，實驗結果如表 2 至表 4 所示，在交叉比較相同 analytical column 搭配不同 trapping column 所得之資訊後發現在實驗結果中，無論是在分析何種樣品或是選用不同 analytical column 的實驗設計下，C18 trapping column 的 trapping 效能皆較 SDVB trapping column 佳；唯有在 trypric fetuin 搭配上 C18 analytical column 的分析組合中出現了出現了相反的結果，也就是在 spectra、matched peptides、unique peptides、sequence coverage，這四個主要比較項目中 SDVB trapping column 皆具有較好的結果，推測可能是由於 fetuin 本身屬於醣蛋白，水解後產生的胜肽碎片具有較親水的特性，因而較容易被 SDVB column trapping 住，以至於實驗結果出現落差；在經過反覆的實驗測試後我們亦發現到 SDVB trapping column 的使用壽命短於 C18 trapping column，大約在 30 到 40 次的使用後，其 trapping 效能明顯降低，因此選定了 C18 作為後續實驗的 trapping column。同時我們也測試了管柱所承受的進樣量與質譜儀鑑定分析結果的關聯性，結果如表 6 至表 8 所示，在這部分我們以 2 cm C18 trapping column 搭配 1 m SDVB 分離管柱與 20 cm C18 分離管柱對 tryptic BSA，tryptic fetuin， tryptic serum 這三種樣品分別進行 0.4 μg、1.0 μg、2.0 μg 三種不同進樣量的實驗，在以 tryptic BSA 作為樣品的實驗中，我們發現到不論是哪種類型的分離管柱實驗中，增加進樣量的情形下都只能夠增加質譜鑑定到的的圖譜數目 (spectra) 無法有效提升 matched peptides 與 unique peptides 以及 sequence coverage，也就是針對 tryptic BSA 這個樣品，增加樣品進樣量只 30.

(43) 能提升胜肽被重複鑑定到的機率，因此在單一蛋白質的分析中，以 0.4 μg 作為進樣量已經足夠進行完整的分析。Tryptic fetuin 的實驗中，增加進樣量確實有助於樣品的分析，從 spectra、 matched peptides、unique peptides、 sequence coverage 上來比較皆有相同趨勢。在 tryptic serum 部分則依不同 analytical column 有相異結果，以 SDVB analytical column 而言，增加樣品進樣量與提升鑑定結果並沒有正相關性，反而在增加進樣量之後導致管柱出現飽和的情況，推測原因可能是因為 SDVB analytical column 本身的 loading capacity 較小，無法完全承受 2 cm C18 trapping column 所抓取的胜肽樣品總量；而在 C18 analytical column 實驗中，增加進樣量確實有助於提升鑑定結果；整體來說大於 0.4 μg 的進樣量會造成樣品殘留在兩種分離管柱中，影響接續實驗的分析，因此最後選擇以 2 cm C18 trapping column 搭配上 0.4 μg tryptic protein 做為後續實驗操作之參考條件。. 4.1.4 製備步驟添加致孔劑測試. 在製備 monolithic column 中，除了常見的改變組成單體外，我們亦嘗試了在聚合時加入了不同種類致孔劑 (porogenic solvent)，希望能透過增加這項參數來改變 monolithic 的結構性質並增進解析能力。在製作 SDVB monolith 管柱的 polymerization reagent 中含有 styrene，divinylbenzene 這兩種單體，以及自由基連鎖反應起始試劑的 AIBN、讓試劑均勻混和的有機相 methanol (bp. 78.37℃)，這些藥品在混和均勻後加熱到 70℃即會開始產生聚合作用；因此我們透過添加兩種具有不同沸點的溶劑：acetone (bp. 56 ℃)、1-propanol (bp. 97℃) 來改變 monolithic 管柱內部的結構。主要是基於 AIBN 需加熱至 75℃以上才能產生反應，因此選擇沸點高於及低於此溫度的試劑，由圖 29 可發現到添加沸點低於加熱溫度 75℃的 acetone 時，不 31.

(44) 論添加濃度多寡，皆會在毛細管內某側面產生明顯空腔；添加沸點高於加熱溫度的不同比例 1-propanol，則不會有空腔出現，接著把有添加致孔劑所製備的 40 cm SDVB monolithic column 與沒有添加致孔劑的 100 cm SDVB monolithic column 實際進行分離比較，在以 C18 trapping column 搭配上 0.4 μg tryptic BSA 進行分析能力測試，結果如表 5 所示，在與 1 m 的無添加致孔劑管柱相比下，40 cm 的有添加致孔劑管柱所鑑定到的 tryptic BSA 不論是在圖譜數目或是鑑定序列百分比皆較為優異；在 tryptic BSA 的實驗組中，除了 15% 1-propanol 沒有分析出任何結果外，其餘五組實驗皆直接證明在固定毛細管內徑下，有添加致孔劑的管柱就算在長度減少的條件下，依然能夠具有較佳的分析效能，當中又以 5% 1-propanol 添加結果最佳；在考量質譜分析結果與 SEM image 後決定選用 5% 1-propanol 作為 SDVB monolithic capillary column 聚合之添加致孔劑。. 4.1.5 SDVB monolithic 管柱製備優化條件. 在總合 4.1 節的所有 SDVB monolithic 毛細管管柱製成條件後，我們決定選用 0.4 μg tryptic protein 樣品為整體實驗分析進樣量，並採用整體體積濃度 40%的 styrene (20%)，divinylbenzene (20%)單體，添加 5% 1-propanol 作為致孔劑，並將包含上述之所有藥品溶於 ethanol 後經均質化除氣得 polymer reagent，並填入 4 m L, i.d. 50 m 的毛細管中，以 75℃水浴加熱 16 小時即可完成管柱製備，結構如圖 30 所示。. 32.

(45) 4.2 三種管柱應用於 regular protein 分析之質譜分析結果. 在此部分實驗中，我們將選用三種具有不同固定相組成之分離管柱，同時搭配 tryptic BSA 以及 tryptic serum 進行一系列的實驗，並將質譜儀的鑑定結果經分析後用於評估三種管柱各自具有的特性；在 tryptic BSA 的分析實驗中，我們選用 2 cm C18 trapping column 搭配上 10cm totally porous silica C18 與 10 cm HALO Fused-Core C18 以及 4 m SDVB monolithic 這三種毛細管分離管柱搭配質譜儀進行分析，並選用 0.4 μg tryptic BSA 作為樣品進行三重複分析，結果如表 9 所示，我們發現經 SDVB 管柱所分析之樣品能夠得到最多的 spectra 和 matched peptides，並且在 unique peptides 與 sequence coverage 兩項目上與 totally porous silica C18 有著相似的結果，而 HALO C18 在此組實驗中鑑定效能最差，且同時具有最高的背壓。針對 tryptic serum 的分析結果來看，表 10 所示，一樣是 SDVB column 能夠得到最多的 spectra，但其餘比較項目 matched peptides 與 unique peptide 以及 id. protein 部分則是以 totally porous silica C18 與 HALO C18 較佳。整合 BSA 與 serum 鑑定結果可得知，選用 SDVB column 搭配質譜儀分析胜肽樣品時，能較 totally porous silica C18 管柱得到多三成的質譜的圖譜數目，並且能在低複雜性胜肽樣品的鑑定中得到較佳的序列佔有率，但在高複雜度的胜肽樣品中，由於 SDVB 本身的 capacity 較其餘兩種管柱低，以至於無法有效增加管柱本身的分析能力。. 4.3 三種管柱應用於 glycoprotein 分析之質譜分析結果. 另外我們亦選用 tryptic glycoprotein 作為樣品，採用與 4.2 節實驗相同的實驗條件來比較三種不同分離管柱對於親水性樣品的分析能力；實驗中 33.