SDVB monolithic column preparation condition

在此組實驗中我們選用 styrene、divinylbenzene 做為單體，並對 SDVB monolithic capillary 管柱製備條件進行測試，同時在與 totally porous silica C18 比較分析效能下，依序針對合成步驟中所有反應的條件進行下述一系 列的優化。

4.1.1 聚合物型態及濃度測試

在實驗最初我們嘗試使用 EDMA 以及 SDVB 做為 monolithic column 內部的聚合物，當中 EDMA 是採用紫外光活化式聚合，SDVB 則採取熱不 以隨著梯度改變有效分離胜肽樣品。另外我們發現到在將 SDVB monolithic 管柱與 totally porous silica C18 管柱相比時，totally porous silica 中所分離較 為親水的胜肽群會在 SDVB 中產生更佳的的分離結果，因此推測固定相組

4.1.2 不同內徑毛細管效能分析

接著我們嘗試選用不同內徑的毛細管 (i.d. 50 μm、i.d. 75 μm、i.d. 100 μm、i.d. 250 μm) 來製備 40% SDVB monolithic 管柱，並觀察是否會在分 離效能上有所差異；可由圖 28 觀察各管柱之橫切面圖差異，同時採用 tryptic BSA，tryptic fetuin，tryptic serum 作為樣品，並以串聯式質譜儀 (QTOF) 來實際測試各管柱對胜肽之分離能力，結果如表 2 至表 4 所示，

表中我們列出在使用相同 trapping column 條件下 (4.1.3 節另討論不同 trapping column 對整體實驗影響) 比較內徑 75 m 的 totally porous silica C18 毛細管管柱，與內徑 50 m 及 75 m 的 SDVB monolithic 毛細管管柱 之分離結果，當中所比較的鑑定資訊包括 MS/MS 圖譜總數(spectra)；

MS/MS 圖譜所鑑定到胜肽之圖譜數 (matched peptides)；扣除 matched peptides 中胜肽重複鑑定之結果 (unique peptides)，所鑑定到胜肽片段胺基 酸佔蛋白質全部胺基酸數目的百分比 (sequence coverage)。

比較實驗結果可發現內徑 50 m 的 SDVB 管柱所分析的 tryptic BSA 鑑 定結果明顯優於內徑 75 m 的 totally porous silica C18 管柱與內徑 75 m 的 SDVB 管柱。0.4 μg tryptic fetuin 分析鑑定結果中除了 sequence coverage 之外，內徑 50 m 的 SDVB 管柱亦優於內徑 75 m 的 SDVB 管柱與內徑 75 m 的 C18 管柱。0.4 μg tryptic serum 分析鑑定結果中 SDVB 管柱所鑑 定到的圖譜總數較其餘兩者多，但總蛋白質數目則略少於 C18 管柱。同時 在整體條件測試實驗中發現，不論是在哪種 trapping column 組合中，由 monolithic 技術所製成的 SDVB column 所反應出的系統整體壓力皆遠遠低 於以粒子填充的毛細管管柱。

4.1.3 不同管柱選配與承受進樣樣品量分析

除了前節所提及的內徑差異外，在此我們亦比較不同管柱組合效能，

希望能夠藉此找出 SDVB 與 C18 管柱更多特性。在實驗中我們選擇 6 cm L, i.d. 250 μm 的 SDVB trapping column 與 2 cm L, i.d. 75 μm 的 C18 trapping column 來比較 trapping 效能，實驗結果如表 2 至表 4 所示，在交叉比較相 同 analytical column 搭配不同 trapping column 所得之資訊後發現在實驗結 果中，無論是在分析何種樣品或是選用不同 analytical column 的實驗設計 下，C18 trapping column 的 trapping 效能皆較 SDVB trapping column 佳；

唯有在 trypric fetuin 搭配上 C18 analytical column 的分析組合中出現了出現 了相反的結果，也就是在 spectra、matched peptides、unique peptides、sequence coverage，這四個主要比較項目中 SDVB trapping column 皆具有較好的結 果，推測可能是由於 fetuin 本身屬於醣蛋白，水解後產生的胜肽碎片具有 較親水的特性，因而較容易被 SDVB column trapping 住，以至於實驗結果 出現落差；在經過反覆的實驗測試後我們亦發現到 SDVB trapping column 的使用壽命短於 C18 trapping column，大約在 30 到 40 次的使用後，其

trapping 效能明顯降低，因此選定了 C18 作為後續實驗的 trapping column。

同時我們也測試了管柱所承受的進樣量與質譜儀鑑定分析結果的關聯性，

結果如表 6 至表 8 所示，在這部分我們以 2 cm C18 trapping column 搭配 1 m SDVB 分離管柱與 20 cm C18 分離管柱對 tryptic BSA，tryptic fetuin，

tryptic serum 這三種樣品分別進行 0.4 μg、1.0 μg、2.0 μg 三種不同進樣量 的實驗，在以 tryptic BSA 作為樣品的實驗中，我們發現到不論是哪種類型 的分離管柱實驗中，增加進樣量的情形下都只能夠增加質譜鑑定到的的圖 譜數目 (spectra) 無法有效提升 matched peptides 與 unique peptides 以及 sequence coverage，也就是針對 tryptic BSA 這個樣品，增加樣品進樣量只

能提升胜肽被重複鑑定到的機率，因此在單一蛋白質的分析中，以 0.4 μg 作為進樣量已經足夠進行完整的分析。Tryptic fetuin 的實驗中，增加進樣 量確實有助於樣品的分析，從 spectra、 matched peptides、unique peptides、

sequence coverage 上來比較皆有相同趨勢。在 tryptic serum 部分則依不同 analytical column 有相異結果，以 SDVB analytical column 而言，增加樣品 進樣量與提升鑑定結果並沒有正相關性，反而在增加進樣量之後導致管柱 出現飽和的情況，推測原因可能是因為 SDVB analytical column 本身的 loading capacity 較小，無法完全承受 2 cm C18 trapping column 所抓取的胜 肽樣品總量；而在 C18 analytical column 實驗中，增加進樣量確實有助於 提升鑑定結果；整體來說大於 0.4 μg 的進樣量會造成樣品殘留在兩種分離 管柱中，影響接續實驗的分析，因此最後選擇以 2 cm C18 trapping column 搭配上0.4 μg tryptic protein 做為後續實驗操作之參考條件。

4.1.4 製備步驟添加致孔劑測試

在製備 monolithic column 中，除了常見的改變組成單體外，我們亦嘗 試了在聚合時加入了不同種類致孔劑 (porogenic solvent)，希望能透過增加 這項參數來改變 monolithic 的結構性質並增進解析能力。在製作 SDVB monolith 管柱的 polymerization reagent 中含有 styrene，divinylbenzene 這兩 種單體，以及自由基連鎖反應起始試劑的 AIBN、讓試劑均勻混和的有機 相 methanol (bp. 78.37℃)，這些藥品在混和均勻後加熱到 70℃即會開始產 生聚合作用；因此我們透過添加兩種具有不同沸點的溶劑：acetone (bp. 56

℃)、1-propanol (bp. 97℃) 來改變 monolithic 管柱內部的結構。主要是基 於 AIBN 需加熱至 75℃以上才能產生反應，因此選擇沸點高於及低於此溫 度的試劑，由圖 29 可發現到添加沸點低於加熱溫度 75℃的 acetone 時，不

論添加濃度多寡，皆會在毛細管內某側面產生明顯空腔；添加沸點高於加 熱溫度的不同比例 1-propanol，則不會有空腔出現，接著把有添加致孔劑 所製備的 40 cm SDVB monolithic column 與沒有添加致孔劑的 100 cm SDVB monolithic column 實際進行分離比較，在以 C18 trapping column 搭 配上0.4 μg tryptic BSA 進行分析能力測試，結果如表 5 所示，在與 1 m 的 為 SDVB monolithic capillary column 聚合之添加致孔劑。

4.1.5 SDVB monolithic 管柱製備優化條件

在總合 4.1 節的所有 SDVB monolithic 毛細管管柱製成條件後，我們決 定選用0.4 μg tryptic protein 樣品為整體實驗分析進樣量，並採用整體體積 濃度 40%的 styrene (20%)，divinylbenzene (20%)單體，添加 5% 1-propanol 作為致孔劑，並將包含上述之所有藥品溶於 ethanol 後經均質化除氣得 polymer reagent，並填入 4 m L, i.d. 50 m 的毛細管中，以 75℃水浴加熱 16 小時即可完成管柱製備，結構如圖 30 所示。