本篇實驗主要目的在於比較不同固定相結構管柱之分離特性；選擇以 質譜儀搭配高效能液相層析之實驗設計，測試不同類型分離管柱對於胜肽 樣品分離能力差異，並透過分析所鑑定到的牲肽特徵來探究固定相之分離 特性。實驗中我們比較了 totally porous silica C18、HALO® fused core C18 與 SDVB monolithic 管柱，選用三種蛋白質樣品作為分析物，同時對 monolithic 管柱的製程條件進行優化。實驗結果證實選用 40% SDVB 單體 添加 5% 1-propanol 作為致孔劑之高分子聚合物試劑，搭配 i.d. 50 μm 的毛 細 管 所 製 備 的 管 柱 具 有最 佳 的 分 離 效 能， 且 由 於 不 含 粒 子 顆 粒， 使 monolithic 管柱的系統壓力大幅降低。4 公尺的 SDVB 管柱能夠有效降低 逆相層析管柱中的共沖提現象來減少離子抑制現象發生；於 GRAVY value 分析中可發現 SDVB 與 HALO® 能明顯提升親水性胜肽整體的鑑定比率，
圖表說明
圖 1. 高效能液相層析儀構造圖
液相層析系統構造主要由: 溶液輸送系統 (solvent supply)；高壓幫浦 (pump)；樣品進樣端 (injector)；層析管柱 (column)；偵測器 (detector)；數據處 理系統所組成 (data recoder)構成。
圖 2. 液相層析法示意圖
（A）吸附層析法（absorption chromatography）；（B）分配層析法（partition chromatography）；（C）離子交換層析法（ion-exchange chromatography）；（D）
大小排除層析法（exclusion or gel chromatography） 。
圖 3. HALO
®fused core particle 結構示意圖
HALO® fused core particle固定相內部為直徑 1.7 µm 的實心矽膠粒子，外層
包覆固定相結構，粒子整體直徑為 2.7 µm，表面孔洞大小約 90 Å 。
圖 4. Monolithic column 結構示意圖
圖為 40% SDVB monolithic 於內徑 100μm 的 silica capillary 內聚合所形成的 管柱之橫切面電子顯微鏡圖
圖 5. Totally porous particle；fused-core particle；monolithic 管柱擴散路徑示意圖
Porous silica particle 為多孔性殼層構成，分析物擴散路徑較長同時本身粒徑
較不一致；fused-core 內為實心矽膠核心，固定相包覆於外層，有較短的擴散路
徑與質量傳輸阻抗；monolithic 不具有粒子顆粒填充因此可有效降低擴散影響。
圖 6. 電噴灑游離示意圖
溶液流經施加高電壓的毛細管後，會在末端形成泰勒錐，並出現電噴灑現象產生極微小的帶電液滴，在飛行過程中溶劑揮發使得 液滴表面的電荷密度升高，當庫倫斥力大於表面張力時，帶電液滴則不斷的分裂成更小的液滴，使得分析物得以形成帶多價電荷的氣 相離子進入質譜儀。
圖 7. Quadrupole mass analyzer 構造示意圖
四極柱質量分析器由兩組平行電極柱組成，當離子進入後會以簡諧震盪前進，透過改變交直流電比例來造成電場差異以 影響震盪路徑，使具備特定的 m/z 質的離子能穿越，其餘離子則接碰撞極柱去離子化被真空系統排出。
圖 8. TOF mass analyzer 構造示意圖
飛行時間式質量分析器由一真空腔室與數組電位板構成，構型上可分為直線式與上圖所示的反射路徑式。透過精確記錄離子在靜
電場中所得到的動能、自由飛行路徑以及飛行時間，運算 E =（1/2）mv2即可得到離子的質量，再透過高解析掃描模式判別離子價數後
即可得知該離子之實際質量。
圖 9. Ion trap mass analyzer 構造示意圖
離子阱式質量分析器 (IT) 為儲存式的質量分析器，可將離子的儲存、裂解、與分析掃描於同空間內進行；設計上以一個環狀電極 以及兩個端蓋電極所構成，只透過交流電來做電場的控制，並利用三軸向電場作為 trapping，並以質量選擇性拋出來偵測離子。
圖 10. FT-ICR mass analyzer 構造示意圖
傅立葉轉換離子迴旋共振式質量分析器具有極高的解析能力與極佳的準確度，其儀器構造主要由一組電極板，與高穩定均勻強磁 場構成，離子樣品進入分析器後於磁場腔內產生迴旋，透過偵測感應電流，再以傅立葉邏輯運算轉換出離子分子量與相對強度。
圖 11. Orbitrap mass analyzer 構造示意圖
Orbitrap 由中央電極與紡錘狀腔室構成，本身可作為質量分析器與偵測器，具有極高的解析能力與極佳的準確度；透過中央電極增 加直流高電壓，離子進入後受到中心電場的吸引會產生圓周軌道運動，並即時以傅立葉邏輯運算感應電流透過，計算出分子量與相對 強度等資訊。
圖 12. General bottom up and top down approach 蛋白質體學實驗流程
圖為蛋白質身分鑑定常採用的實驗流程；top down 實驗直接將完整蛋白質送入質譜儀中進行蛋白質碎片的鑑定，具有較高的序列 涵蓋率以及後轉譯修飾資訊，惟受限於高階儀器系統才可採用此流程；bottom up 實驗先將蛋白質降解為胜肽，再透過胜肽碎片鑑定來 得到蛋白質相關資訊，適用於大多數儀器系統中，但會漏失部分蛋白質序列以及後轉譯修飾資訊。
圖 13. 本實驗所採用的 bottom up 蛋白質鑑定策略
在本實驗所採取的蛋白質定策略以 bottom up 為基礎，並在當中加入液相層析來降低樣品複雜度以提升分析效能。
圖 14. 粒子式管柱填充法
圖為本實驗中所選用的粒子填充式毛細管管柱製備裝置；先將粒子加入甲醇 中並攪拌以維持均勻懸浮態，並透過氮氣系統提供背壓將懸浮液推入毛細管中堆 積粒子。
Beads
圖 15. Porous silica particles 毛細管管柱示意圖
圖為內徑 75 μm 填充 10 公分 porous silica particles C18 毛細管管柱，毛細管前端使用二氧化矽燒結成篩狀結構避免粒子流失。
圖 16. HALO® fused core particles
毛細管管柱示意圖圖為內徑 75 μm 填充 10 公分 HALO® fused core particlesC18 毛細管管柱，毛細管前端使用二氧化矽燒結成篩狀結構避免粒子流失。
圖 17. SDVB monolithic 毛細管分離管柱製備流程
圖為 SDVB 管柱製備流程；以 MSMS 作為毛細管內壁支架，在聚合上 styrene 以及 divinylbenzene 形成高分子共聚物，同時於聚合 反應時添加 1 propanol 使聚合結構更具一致性。
圖 18. SDVB
毛細管管柱示意圖圖為內徑 50 μm 聚合 400 公分 SDVB monolithic 毛細管管柱。
圖 19. 實驗流程示意圖
圖為實驗主要流程；分別將三種蛋白質樣品以胰蛋白酶水解實驗降解為胜肽 混合物，在使用液相層析串聯質譜儀中進行分子量分析，再透過統計軟體與資料 庫進行比較。
圖 20. HPLC 系統於 loading mode 分流架構
圖為 loading 模式下系統設定；自動進樣器的六向閥是處於 main pass 狀態，質譜儀上的六向閥是處於流通狀態， HPLC 以 2 µL/min 進行溶液輸出，由於 analytical column 提供相對較高的背壓，所以分析樣品及溶劑均會通過 trapping column 直接導入廢液桶，胜肽樣 品會被 trapping column 留滯住，經由五分鐘的沖洗，可以確定所有樣品皆以注入 trapping column 中；同時達到 online 濃縮去鹽的效果。
圖 21. HPLC 系統於 inject mode 分流架構
圖為 inject 模式下系統設定；自動進樣器的六向閥是處於 by pass 狀態減少系統體積，質譜儀上的六向閥是處於阻塞狀態，HPLC 以 0.3 µL/min 進行溶液輸出，樣品直接被移動相依照梯度設定洗脫出 trapping column 同時進入 analytical column，再透過前端的 metal union 施加電壓於 i.d. 20 μm, o.d. 50 μm empty capillary emitter 達到電噴灑游離效果。
圖 22. 四極柱-飛行時間串聯式質譜
圖為 AB Sciex QSTAR XL mass spectrometer 內部主要硬體結構。
Q
2Q
0Curtain Gas
Q
1Ion Mirror reflector 4 anode detector Accelerator
Modulator
Effective Flight Path : 2.5 m Sample
Ions
圖 23. 碰撞誘導解離模式示意圖
圖為串聯式質譜儀中碰撞誘導解離反應機構，前驅離子進入碰撞室後會和惰性氣體產生碰撞，並將動能轉變成內能使樣品內共價 鍵斷裂形成碎片離子。
圖 24. 質譜儀中胜肽碎片離子型態
a、b、c 系列離子為斷裂在不同位置 N 端碎片，x、y、z 則為斷裂在 C 端碎片，數字代表胺基酸的排列順序；而在 CID 的碰撞模 式下，易產生 b-與 y- type 的碎片離子。
圖 25. De Novo sequencing 示意圖
圖為蛋白質序列鑑定法 De Novo sequencing 判別方式；基於不同胺基酸有不同的分子量，因此透過質譜儀中所觀察到的相鄰訊號 之分子量差異即可回推蛋白質一級結構。
圖 26. 不同固定相管柱連接質譜儀分析 TIC 圖
圖為使用不同靜相類型管柱搭配質譜儀分析 tryptic BSA 於 MS scan 模式下全離子層析圖。＊、+代表兩段親水性較高的胜肽。
圖 27. SDVB 單體濃度結構 SEM 圖
圖為 styrene 以及 divinylbenzene 兩種高分子聚合物單體(% = VST+DVB /VST+DVB+ETOH+1-propanol)在不同濃度下於毛細管中聚合結構圖。
圖 28. 40% SDVB 於不同內徑毛細管結構 SEM 圖
圖 29. 添加致孔劑之 40% SDVB 管柱結構 SEM 圖
圖為添加 5 至 15% (V/V) acetone 以及 1-propanol 作為致孔劑所製備之 SDVB 毛細管管柱。
圖 30. 優化製備條件後 monolithic 管柱 SEM 圖
圖為 40% SDVB 添加 5% 1-propanol 於內徑 50 μm 毛細管聚合結
圖 31. Tryptic BSA 於實驗中經質譜儀鑑定之胜肽 GRAVY value 分布
圖為實驗所鑑定之tryptic BSA 胜肽分布圖，橫坐標為 HPLC 滯留時間，右端縱座標為 grand average of hydropathy (GRAVY)值，左 端為 HPLC 中移動相 B (ACN + 0.1% FA)組成比例；實驗組別如圖所示。
% of mobile phase B（ACN）
GRAVY value
Retention Time （min）
0.4 μg tryptic BSA GRAVY distrubition
C18, N=114 HALO, N=79 SDVB, N=122
圖 32. Tryptic serum 於實驗中經質譜儀鑑定之胜肽 GRAVY value 分布
圖為實驗所鑑定之 tryptic serum 胜肽分布圖，橫坐標為 HPLC 滯留時間，右端縱座標為 grand average of hydropathy (GRAVY)值，
左端為 HPLC 中移動相 B (ACN + 0.1% FA)組成比例；實驗組別如圖所示。
% of mobile phase B（ACN）
GRAVY value
Retention Time （min）
0.4 μg tryptic serum GRAVY distrubition
C18, N=490 HALO, N=433 SDVB, N=400
圖 33. Tryptic fetuin 於實驗中經質譜儀鑑定之胜肽 GRAVY value 分布
圖為實驗所鑑定之 tryptic fetuin 胜肽分布圖，橫坐標為 HPLC 滯留時間，右端縱座標為 grand average of hydropathy (GRAVY)值，
左端為 HPLC 中移動相 B (ACN + 0.1% FA)組成比例；實驗組別如圖例所示。
% of mobile phase B（ACN）
GRAVY value
Retention Time （min）
0.4 μg tryptic fetuin GRAVY distrubition
C18, N=415 HALO, N=235 SDVB, N=300
圖 34. Tryptic BSA 於實驗中經質譜儀鑑定之胜肽分子量分布
圖為實驗所鑑定之 tryptic BSA 胜肽分子量分布圖；橫坐標為分子量區間，縱座標為鑑定到之胜肽數目；實驗組別如圖例所示。
圖 35. Tryptic serum 於實驗中經質譜儀鑑定之胜肽分子量分布
圖為實驗所鑑定之 tryptic serum 胜肽分子量分布圖；橫坐標為分子量區間，縱座標為鑑定到之胜肽數目；實驗組別如圖例所示。
圖 36. Tryptic fetuin 於實驗中經質譜儀鑑定之胜肽分子量分布
圖為實驗所鑑定之 tryptic fetuin 胜肽分子量分布圖；橫坐標為分子量區間，縱座標為鑑定到之胜肽數目；實驗組別如圖例所示。
圖 37. Tryptic BSA 於實驗中經質譜儀鑑定 unipeptides Venn diagram
圖為以 tryptic BSA 胜肽作為分析樣品所鑑定之 unipeptides 實驗組間互補性；括弧為平均 grand average of hydropathy (GRAVY)值。
圖 38. Tryptic serum 於實驗中經質譜儀鑑定 unipeptides Venn diagram
圖為以 tryptic serum 胜肽作為分析樣品所鑑定之 unipeptides 實驗組間互補性；括弧為平均 grand average of hydropathy (GRAVY)值。
圖 39. Tryptic fetuin 在三種管柱實驗中經質譜儀鑑定 unipeptides Venn diagram
圖為以 tryptic fetuin 胜肽作為分析樣品所鑑定之 unipeptides 實驗組間互補性；括弧為平均 grand average of hydropathy (GRAVY)值。
圖 40. Tryptic BSA 於實驗中經質譜儀分析之全離子層析圖
圖為以 tryptic BSA 胜肽作為分析樣品，於三組實驗所得之質譜儀全離子層析圖；紅色線代表 10 cm HALO® fused core C18 管柱、
藍色線代表 10 cm totally porous silica C18 管柱、綠色線代表 4 m SDVB monolithic 管柱實驗結果。
圖 41. 兩段胜肽於實驗中經質譜儀分析之萃取離子層析圖
圖為以 tryptic BSA 胜肽作為分析樣品，於三組實驗得之質譜儀萃取離子層析圖；紅色線代表 HALO® fused core C18 管柱、藍色線 代表 totally porous silica C18 管柱、綠色線代表 SDVB monolithic 管柱實驗結果；上下兩張圖代表不同親疏水性質胜肽之離子訊號層析 圖。
HALO C18
SDVB
Total time（min） Flow rate（μL/min） Mobile phase（% A） Mobile phase（% B）
0.0 2 98 2
5.0 2 98 2
5.1 0.3 98 2
50 0.3 60 40
50.1 0.3 20 80
70.0 0.3 20 80
70.1 0.3 98 2
99.0 0.3 98 2
100.0 2 98 2
表 1. 100 分鐘液相層析梯度表
表為本實驗中 HPLC 之梯度設定；mobile phase A 為 0.1% FA in 2% ACN，mobile phase B 為 0.1% FA in 98% ACN。
Sample: 0.4 μg tryptic BSA
C18/C18 2/20 cm, i.d. 100/75 m 179 52（26） 43（27） 62%
C18/SDVB 2/20 cm, i.d. 100/50 m 390 62（32） 44（24） 66%
C18/SDVB 2/20 cm, i.d. 100/75 m 157 20（13） 16（12） 30%
SDVB/C18 6/20 cm, i.d. 250/75 m 240 40（22） 38（24） 56%
SDVB/SDVB 6/20 cm, i.d. 250/50 m 341 30（17） 36（17） 47%
SDVB/SDVB 6/20 cm, i.d. 250/75 m 151 22（15） 16（12） 31%
表 2. Tryptic BSA 於不同管柱間組合實驗與不同管柱內徑實驗之質譜鑑定結果
Sample: 0.4 μg tryptic serum
Sample: 0.4 μg tryptic fetuin
Sample: 0.4 μg tryptic BSA
Analytical column Porogenic Solvent
# of
Sample: tryptic BSA Column
（trapping/analytical）
Amount
# of
Sample: tryptic serum Column
（trapping/analytical）
Amount
# of
Sample: tryptic fetuin Column
（trapping/analytical）
Amount
# of
Sample: tryptic BSA Column
（trapping/analytical） Amount
# of
Sample: tryptic serum Column
（trapping/analytical） Amount
# of
Sample: tryptic fetuin Column
（trapping/analytical） Amount
# of
0.4 μg tryptic fetuin inject
Peptides Glycan
Theoretical
參考文獻
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