第三章 研究方法
第三節 實驗方法
1 細胞培養
（1）懸浮細胞培養
將HL-CZ 培養於含有 10 %的 FBS（fetal bovine serum）的 RPMI -1640 培養液中，置於 5％CO2、37℃恆溫培養箱。當細胞生長在培養盤 70
％至80％時，利用培養盤裡原有的培養液將細胞沖離培養盤底部，吸 起所有舊培養液，放置在 15ml 離心管，離心 1200rpm 5 分鐘，去除 上清液，以1xPBS（phhosphate buffer saline）清洗細胞後，離心去除 上清液，再加入 3-4ml 培養液輕輕打散細胞，保留 1ml 並補培養液至 10ml 放回培養箱作繼代培養。當細胞數過多時，可以做細胞冷凍。
（2）貼細胞培養
將 TE-671 培 養 於 含 有 2 mM L-glutamine 、 1.5 g/L sodium bicarbonate、0.1 mM non-essential amino acids、1.0 mM sodium pyruvate 、10 %的 FBS（fetal bovine serum）的 Minimum essential medium (MEM)培養液中，置於 5％CO2、37℃恆溫培養箱。當細胞 生長在培養盤70％至 80％時，吸起舊的培養液，以 1xPBS 清洗細 胞後，加入1ml 的 trypsin 於培養箱作用 2 分鐘，再以 3-4ml 培養液 中和trypsin 後，輕輕打散細胞，保留 1ml 並補培養液至 10ml 放回 培養箱作繼代培養。當細胞數過多時，可以做細胞冷凍將其冷凍在 液態氮中。
2 細胞週期測定（1）
病毒感染細胞－流式細胞儀（Flow Cytometry Assay）
將細胞培養在 T30 內，MOI 為 0.1：細胞數為 1×105個 cell / T30 flask，並於每個 T30 加入 1×104 pfu/ml 日本腦炎病毒液；MOI 為 1：
細胞數為 4×104個cell / T30 flask，並於每個 T30 加入 4×104 pfu/ml 日本腦炎病毒液分別培養 24、48、72 與 96 小時。依不同時間點收 下細胞，以trypsin 將細胞打下（懸浮細胞則否）放入試管中，離心 1200rpm，5 分鐘去除上清液，再以 1X PBS 清洗兩次，離心
Channels (PE-A) propidium iodide（PI）染劑【25μl PI（1mg/ml），0.5μl RNase（10mg/ml）
於 500μl PBS 中】視細胞數多寡而定。移至 FACS 管，37℃避光反
3 質體純化 ( plasmid purification )
取含有質體的單一菌落，以3ml LB 在 37°C 培養箱培養至 log phase 後取出，離心 12,000rpm 3 分鐘，倒掉上清液，用 Gene-SpinTM Miniprep Purification Kit 來純化質體。1）以 solution I 溶液 200μl resuspend pellet，2）solution II 溶液 200μl 上下倒置數次 3）solution III 溶液 200μl 上下輕搖數次，離心 12,000rpm 15 分鐘。4）將 spin column 插入一收集管（collection tube）中，並將離心後的上清液移 至spin collumn 中，離心 12,000rpm 1 分鐘，去除上清液。
5）加入 700μl Washing solution，離心 12,000rpm 1 分鐘，去除上 清液，再離心 12,000rpm 3 分鐘，去除上清液。
6）再將收集管以 1.5ml 微量離心管置換，加入 20μl ddH2O 放置 2 分鐘，4℃離心 12,000rpm 5 分鐘。
7）回收質體放置在-20 冰箱備用。
4 聚合酵素連鎖反應 （polymerase chain reaction，PCR）
在 0.5ml 微量離心管中，取病毒反轉錄的 cDNA 5 μl 做為模版 (template)，依序加入 ddH2O 79μl，10X Optipol buffer 10 μl ，dNTP (10mM) 1 μl，Primer F 與 Primer R (10mM)各 2 μl ，最後加 Optipol Taq polymerase 1 μl，總體積為 100 μl。混合均勻後加入約 20 μl 的礦物油在置於聚合酵素連鎖反應器（thermohybrid）的反應槽中。
反應條件：
1. 94℃作用五分鐘
2. 94℃作用 1 分鐘的 DNA 變性反應 3. 52℃作用一分鐘三十秒的鏈合反應
4. 72℃作用一分鐘的 DNA 合成反應，進行 40 個反應週期。
5 之後以 72℃作用十五分鐘將 DNA 片段補齊。
6 最後設定 4℃保存。
將PCR DNA 產物跑 2%瓊酯凝膠（2% agarose gel）進行電泳分 析。確定PCR 產物片段大小正確，以 Spin PCR Clean-Up system 試劑套組（Viogene）將 DNA 純化。
5 限制酵素的處理
PCR 得到的產物，以 Spin PCR Clean-Up system 試劑套將 DNA 純 化後，以30 μl 的 ddH2O 將 DNA 溶出，加入 10X reaction buffer 10μl 及切位的限制酵素依照最佳比例配製，使總體積為 100 μl，以 37℃
作用三小時。相對應的質體載體亦以同樣的方式進行限制酵素的水 解，來構築實驗的表現載體。
6 質體的構築
10X ligation buffer 1μl、ligase 1μl、質體載體 1μl，加上欲接合的
Target DNA 7μl，16℃作用一個晚上。
7 大腸桿菌之轉型 （transformation）
將構築好的質體 10μl 加到 200μl 適應性細胞（Top10）中，混合後 放在冰上作用三十分鐘。再放置在42℃水浴槽反應 90 秒後，迅速 放置冰上三分鐘，之後在flow 中加入 800μl 不含抗生素的 LB 培養 液。在37℃ 培養箱培養一小時後，離心 5000rpm 5 分鐘去除上清 液，均勻塗在含抗生素的LB 培養基
8 DNA 轉染（DNA transfection）
細胞的轉染是利用Arrest In(AI) Transfection Kit 試劑。
將 2×105cell/well 轉染於 6-well plate 中培養至隔夜（懸浮細胞則 否）。將3μg/well 的 DNA 以 50μI/well 不含胎牛血清的培養液稀釋。
再加入15μl 的 AI （Transfection Kit Reagents）混合均勻靜置於室 溫十五分鐘，使得 AI/DNA complexes 形成。再將要轉染的細胞移 去舊的培養液，利用PBS 將細胞清洗ㄧ次。最後將反映 15 分鐘的 AI/DNA complexes 加入，並加入 1ml 不含胎牛血清的培養液，於 37.0°C, 5% CO2 下培養 3 到 5 小時，再更換 2ml 含胎牛血清的培養 液，繼續培養72 小時。
9 免疫染色（1）
將2×105cell/well 轉染於 6-well plate，於 48 小時吸去培養液，用 PBS 洗滌兩次去除殘留的培養液，以福馬林固定，再加入 10％
methanol 乾燥，利用 PBS 洗滌兩次，去除上清液。加入 anti-His 抗體反應一小時，再以 PBS 洗滌三次去除抗原抗體非專一性結 合，再加入Rhoamone anti mouse IGg Ab (1:1000)避光反應一小 時，於避光條件下利用PBS 清洗後，利用螢光顯微鏡觀察。
10 免疫染色（2）
將2×105cell/well 轉染於含有玻片的 6-well plate，於 48 小時吸去 培養液，用PBS 洗滌兩次去除殘留的培養液，以福馬林固定，再 加入 10％methanol 乾燥用，利用 PBS 洗滌兩次，去除上清液。
加入anti-JEV（1：400）抗體反應一小時，再以 PBS 洗滌三次去 除抗原抗體非專一性結合，再加入 FITC anti mouse IGg Ab (1:1000)避光反應一小時，於避光條件下利用 PBS 清洗後，利用 共扼焦顯微鏡（confocal）觀察。
11 細胞週期測定（2）
病毒DNA 轉染細胞－流式細胞儀
將2×105cell/well 轉染於 6-well plate，於 48 小時後吸去培養液，
用 PBS 洗滌兩次去除殘留的培養液，以 trypsin 打下細胞（懸浮 細胞則否）放到試管中，離心 1200rpm，5 分鐘，之後去除上清 液，再以1X PBS 清洗兩次，離心 1200rpm，5 分鐘，去除上清液。
一滴滴加入2-3ml 70％酒精，進行細胞固定。放置在-20℃冰箱存 放。第二天，將sample 取出離心 1200rpm，5 分鐘，之後去除上 清液，再加入 1X PBS 將殘留的酒精洗淨，再離心 1200rpm，5 分鐘，去除上清液，加入染劑【25μl PI（1mg/ml），0.5μl RNase
（10mg/ml）於 500μl PBS 中】視細胞數多寡而定。移至 FACS 管，37℃避光反應 30 分鐘後，再以流式細胞儀進行分析。
12 Annexin V 染色
將 2×105cell/well 細胞轉染於有蓋玻片放置的 6-well plate 中，48 小時後吸去培養液，用1xPBS 洗滌兩次去除殘留的培養液。再用 Annexin V -BindingBuffer Resuspend 細胞，吸去殘留液。加入 Annexin V conjugateSubstubste 10μl /1ml Annexin V -Binding Buffer ，室溫避光反應 15 分鐘。將蓋玻片固定於載玻片上，封 邊，利用顯微鏡觀察。
13 caspase3 活性分析（caspase3 activity assay）
使用 Fluorimetric assay kit。
將細胞分盤到6 well plate 中培養十八到二十四小時，進行轉染後 培養48 小時將細胞收起，以冰的 1X PBS 清洗，離心 1200rpm，5 分鐘之後去除上清液。加入100μl extraction buffer 溶解細胞後，
冰上反應10 分鐘，4℃離心 1200rpm，5 分鐘之後先收取上清液 50μl。再將 assay buffer 50μl、細胞上清液 50μl，及 caspase3 substrate conjugate solution 10μl，混合加入 black microtiter plate 中。避光放 置培養箱37.0°C 培養 2 小時，再使用 cytoFluor 測其活性。
14 蛋白質之電泳分析（SDS-PAGE）
實驗所使用的電泳裝置為Bio-Rad 蛋白質電泳槽。待鑄膠裝置組 合後，先加入分離膠體溶液（separating gel），再加入酒精將上 層膠壓平，待凝固後倒掉酒精並擦拭乾後加入集膠溶液（stacking gel），插上齒膜，膠體凝固後置於電泳槽中，注入電泳緩衝液
（running buffer）。取蛋白質樣本溶液加入等量的 sample loading dye，混勻後在 110 ℃加熱五分鐘後，迅速置於冰上。於電泳槽 注入樣本10 μl，並注入控制組 10 μl 為對照，先以 80V 30 分鐘 進行電泳，待藍色染劑跑到分離膠體時，將電壓調整為110V 50
分鐘繼續電泳，直到藍色染劑跑到膠體底部。
15 西方墨點法
實驗所使用的電泳裝置為 Bio-Rad 半乾式的電泳轉漬槽。
SDS-PAGE 後，切除集膠體部份，膠片浸在轉漬緩衝液（Transfer buffer）中。取轉印紙（硝化纖維紙 nitrocellulose paper)切成膠片 大小浸在轉漬緩衝液，先鋪上三張濕潤的3M 濾紙，後鋪上濕潤 的轉印紙，疊上已濕潤的膠片，再鋪上三張濕潤的3M 濾紙。以 200 mA 轉印 100 分鐘。之後，進行 Blocking 將轉印紙放入 1x TBST 含5% 脫脂牛奶，室溫搖盪一小時。倒掉牛奶，加入一抗（1：1000 稀釋），置於室溫搖擺一至二小時或放置4℃隔夜。一抗回收重 覆使用，轉印紙以1 x TBST 清洗七分鐘三次。再加入二抗（1：
1000 稀釋），置於室溫搖擺一至二小時。回收二抗，轉印紙以 1 x TBST 清洗七分鐘三次。加入 NBT/TCIP 顯色劑，反應至呈色。加 入二次水以終止反應，晾乾後保存。
16 活性氧化物測定
將2×105cell/well 轉染於 6-well plate，於 48 小時後吸去培養液，
用 1xPBS 洗滌兩次去除殘留的培養液，以 trypsin 打下細胞（懸 浮細胞則否），放入試管中離心 1200rpm，5 分鐘，之後去除上清
液，再以1X PBS 清洗兩次，離心 1200rpm，5 分鐘，去除上清液。
加入DCFH-DA 染劑【1μl DCFH-DA（10μΜ）於 500μl PBS 中】
視細胞數多寡而定。移至 FACS 管，37℃避光反應 30 分鐘後，
再以流式細胞儀進行分析。
利用流式細胞儀測ROS 判讀方式：
對照組 實驗組
縱軸：代表細胞數
橫軸：代表吸收螢光量
利用縱軸黑線將上圖波峰平均分半為 P2 與 P3。當細胞有氧化物 產生，雷射會激發螢光使螢光量增加波峰由中間往右移（P2 部分 增加）
17 鈣離子測定
將 2×105cell/well 轉染於 6-well plate，48 小時後吸去培養液，用 1xPBS 洗滌兩次去除殘留的培養液，以 trypsin 打下細胞（懸浮細 胞則否）放入試管中離心1200rpm，5 分鐘，之後去除上清液，再 以1X PBS 清洗兩次，離心 1200rpm，5 分鐘，去除上清液。，加 入 FLUO3/AM 染劑 0.3-1ml（5μg/ml）視細胞數多寡而定。37℃
培養箱避光反應 30 分鐘，離心 1200rpm，5 分鐘去除上清液，再 以1x PBS 清洗兩次，離心 1200rpm，5 分鐘，去除上清液。加入 500μl PBS，並移至 FACS 管，再以流式細胞儀進行分析。
（判讀方式與ROS 相同）
18 粒線體膜電位測定
將2×105cell/well 轉染於 6-well plate，於 48 小時後吸去培養液，
用 1xPBS 洗滌兩次去除殘留的培養液，以 trypsin 打下細胞（懸 浮細胞則否）放入試管中離心 1200rpm，5 分鐘，之後去除上清 液，再以1X PBS 清洗兩次，離心 1200rpm，5 分鐘，去除上清液。
加入DioC6 染劑【10μl DioC6（400μΜ）於 500μl PBS 中】視細 胞數多寡而定。移至 FACS 管，37℃避光反應 30 分鐘後，再以 流式細胞儀進行分析。
利用流式細胞儀測膜電位改變之判讀方式：
對照組 實驗組
縱軸：代表細胞數
橫軸：代表吸收螢光量
利用縱軸黑線將上圖波峰平均分半為 P2 與 P3。當細胞膜電位下 降，雷射所激發螢光少波峰由中間往左移（P2 部分增加）。