第一節 以 MOI 為 0.1 及 1 的條件下日本腦炎病毒感染 HLCZ 細胞及 TE671 細胞之細胞週期分析
利用流式細胞儀分析日本腦炎病毒感染 HL-CZ 及 TE-671 細胞分別 在MOI 為 0.1 與 1 的條件感染 24、48、72、96 小時，發現隋著時間增加 細胞凋亡程度也隨之上升。HL-CZ 細胞在 MOI 為 0.1 條件經由病毒感染 後 72 能看見明顯細胞凋亡；而當感染病毒條件提升至 MOI 為 1 時發現 在 48 小時就有細胞凋亡，時間上提前 24 小時就看到細胞凋亡的情形。
另外，在TE-671 細胞部份則發現隨著 MOI 為 0.1 提升至 MOI 為 1 時在 48 小時細胞凋亡比例明顯上升，因此在 TE-671 細胞 MOI 為 1 時病毒才 明顯引起細胞凋亡（圖一）。
第二節 日本腦炎病毒蛋白 NS2B、NS3-180、NS2BNS3-180 的質體構築 將病毒的cDNA 進行 PCR 增幅，PCR 產物經過純化後，跑 2％瓊酯 確認NS2B 的片段大小為 393bp（圖二 A）、NS3-180 的片段大小為 540bp
（圖二 B），NS2BNS3-180 的片段大小為 933bp（圖二 C）。接著再利用 BamHΙ、EcoRΙ限制內切酶處理接到相同切位的 pcDNA 載體上經轉型到 勝任細胞上，再利用基因轉殖電泳分析進行質體選殖。將帶有NS2B（圖
三 A）、NS3-180（圖三 B）、NS2B-NS3-180（圖三 C）的載軆 pcDNA
（5514bp），進行序列片段確認。
第三節 蛋白表現 HL-CZ 及 TE-671 細胞之免疫螢光染色
HL-CZ 細胞分別進行（pcDNA/His C，pE，pNS1，pNS2B，pNS3-180，
pNS2BNS3-180，pNS4A 及 pNS4B）：pEGFP 以 9 比 1 的比例進行轉染，
利用螢光顯微鏡觀察，綠色螢光為EGFP 蛋白（圖四－七 B、F），紅色 螢光利用anti：His（Rhodamine）表現出來的 E、NS1、NS2B、NS3-180、
NS2B-NS3-180、NS4A 及 NS4B 蛋白（圖四－七 C、G），merge 後可以 看到兩種基因在細胞都有表現，而呈現黃色螢光（圖四－七D、H）。
同時，在 TE-671 細胞也分別進行（（pcDNA/His C，pE，pNS1，pNS2B，
pNS3-180，pNS2BNS3-180，pNS4A 及 pNS4B）：pEGFP 以 9 比 1 的比例 進行共同轉染，利用螢光顯微鏡觀察，綠色螢光為EGFP 蛋白（圖八－
十一A、D），紅色螢光利用 anti：His（Rhodamine）所表現出來的 E、
NS1、NS2B、NS3-180、NS2B-NS3-180、NS4A 及 NS4B 蛋白（圖八－
十一B、E），merge 後可以看到兩種基因在細胞都有表現，而呈現黃色螢 光（圖八－十一C、F）。
另外，又分別將 pE、pNS1、pNS2B、pNB3-180、pNS2B3-180 轉染 在TE-671 細胞，培養兩天後以螢光顯微鏡觀察。利用一抗 anti：JEV，
二抗anti：mouse Co-AP 確認病毒蛋白 E、NS2B、NB3-180、NS2B3-180 在TE-671 細胞表現。自然視野下觀察到 E、NS2B、NB3-180、NS2B3-180 蛋白表現在TE671 細胞（圖十二 B、C、D、E）。綠色螢光為利用 anti：
JEV（FITC）所表現出來的 E、NS1、NS2B、NB3-180、NS2B3-180 蛋白，
確認病毒蛋白在細胞有表現（圖十二G、H、I、J）。
第四節 流式細胞儀分析日本腦炎病毒蛋白誘導 HL-CZ 及 TE-671 細胞凋 亡程度
利用流式細胞儀分析日本腦炎病毒基因分別轉染於HL-CZTE-671 細 胞在不同蛋白存在表現後，HL-CZ 細胞誘導細胞凋亡比例 E（8.7％）、
NS1（7.3％）、NS2B（15.3％）、NS3-180（21.1％）、NS2B-NS3-180（29
％）、NS4A（5.9％）及 NS4B（1.0％）（圖十三）。TE-671 細胞誘導細胞 凋亡比例分別為E（0.1％）、NS1（0.1％）、NS2B（0.6％）、NS3-180（7.2
％）、NS2B-NS3-180（18.2％）、NS4A（0.23％）及 NS4B（0.03％）（圖 十三）。結果發現在 HL-CZ 細胞病毒蛋白 NS2B、NS3-180，NS2BNS3-180 表現，細胞會產生較明顯細胞凋亡；同時在 TE-671 細胞，病毒蛋白 NS3-180，NS2BNS3-180表現，細胞也產生明顯細胞凋亡。
第五節 Annexin V 檢 測 細 胞 凋亡之早 期 反 應
在TE-671 細胞當病毒蛋白有表現促使細 胞 凋 亡 發 Phosphotidyl Serine 磷 脂 從 細 胞 膜 內 轉 移 到 細 胞 膜 外，與 Annexin V 染劑結合在
螢光顯微鏡下為紅色螢光。因此，病毒蛋白NS3-180，NS2BNS3-180表現 在TE-671 細胞在螢光顯微鏡下則看到多數紅色螢光，E、NS2B 則有部分 紅色螢光出現，顯示出E，NS2B，NS3-180，NS2BNS3-180皆能引起細胞 凋亡，其中以NS2BNS3-180表現在細胞引起明顯細胞凋亡（圖十四）。
第六節 分析日本腦炎病毒蛋白表現誘導 Caspase 3 活性分析
日本腦炎病毒表現對HL-CZ 細胞（A）、TE-671 細胞（B）作用 48 小時後，細胞溶解與Caspase 3 substrate、Assay buffer 作用 2 小時,再利用 cytofluor 測其活性。比較誘導 Caspase 3 蛋白產生的比例。當 Caspase 3 活 性被活化就能初步判定細胞會產生細胞凋亡。 結果發現在 HL-CZ 細胞，
病毒蛋白E，NS3-180，NS2BNS3-180表現，細胞會活化明顯 Caspase 3 蛋 白產生，其活化Caspase 3 蛋白活性的比例依序增加（圖十五）。TE-671 細胞，病毒蛋白NS2B，NS3-180，NS2BNS3-180表現，細胞也會活化Caspase 3 蛋白產生，其活化 Caspase 3 蛋白活性的比例依序增加（圖十五）。
第七節 利用西方墨點法分析病毒蛋白對 HLCZ 細胞及 TE671 細胞之 細胞凋亡相關 caspase 3、8、9 蛋白活性
分別於 HL-CZ 細胞轉染 pE、pNS2B、 pNS3-180，pNS2BNS3-180， 經蛋白表現後，觀察caspase 3、8、9 蛋白表現量。利用ㄧ抗 anti－caspase 3、8、9，二抗 anti－mouse co-AP 確認 caspase 3、8、9 蛋白活性，並以 β-actin 當作 internal control。發現在 HL-CZ 細胞當病毒蛋白 NS2B 及 NS3-180表現會活化 caspase 3、8 蛋白；而病毒蛋白 NS2BNS3-180表現會 活 化 c a s p a s e 3 、 8 、 9 蛋 白 產 生 。（ 圖 十 六 ）。
另外在 TE-671 細胞轉染 pE、pNS2B、 pNS3-180，pNS2BNS3-180， 經蛋白表現後，觀察caspase 3、8、9 蛋白表現量，分別利用ㄧ抗 anti－
caspase 3、8、9，二抗 anti－mouse co-AP 確認 caspase 3、8、9 蛋白活性，
並以 β-actin 當作 internal control。發現在 TE-671 細胞當病毒蛋白 E、
NS3-180，NS2BNS3-180 有表現會活化 caspase3、9 蛋白。（圖十七）。
第八節 探討日本腦炎病毒蛋白引發細胞凋亡之分子機制。
利用流式細胞儀分析活性氧化物。在 TE-671 細胞病毒蛋白 NS2B、
NS2BNS3-180 表現時產生活性氧化物（圖十八）。另外當病毒蛋白 NS2BNS3-180, 在 HL-CZ 細胞表現時有鈣離子濃度上升的趨勢（圖十 九）。利用流式細胞儀分析粒線體膜電位的變化。病毒蛋白 E Protein ，
NS2BNS3-180 在 HL-CZ 細胞表現時有膜電位下降的情形產生（圖二十）。
第九節 病毒蛋白表現 TE-671 細胞之免疫螢光染色
分別將pE、pNS2B、pNB3-180、pNS2BNS3-180：pDsRed-Mito 以 9 比1 的比例在 TE-671 細胞進行共同轉染，兩天後以共軛焦分光光譜顯微 鏡觀察。綠色螢光為anti：His（FITC）所表現出來的 E、NS2B、NB3-180、
NS2BNS3-180 蛋白（D、G、J、M）。紅色螢光為 E、NS2B、NB3-180、
NS2B3-180 表現 pDsRed-Mito 的情形（B、E、H、K、N），merge 後呈現 出黃色螢光（C、F、I、L、O）代表病毒基因在細胞都有表現（圖二十）。
另外，又分別將pE、pNS2B、pNB3-180、pNS2B3-180：pDsRed-Mito 以9 比 1 的比例在 TE-671 細胞進行共同轉染，兩天後以共軛焦分光光譜 顯微鏡觀察。綠色螢光為anti：Cytochrome c（FITC）所表現出來的 E、
NS2B、NB3-180、NS2B3-180 蛋白（D、G、J、M）。紅色螢光為 E、NS2B、
NB3-180、NS2B3-180 表現 pDsRed-Mito 的情形（B、E、H、K、N）。當 病毒基因在細胞有表現且誘導細胞凋亡產生走粒線體路徑就能促使 Cytochrome c 從粒線體釋放出來，由（圖二十一 C、F、I、L、O）看出 merge 後並沒有完全呈現黃色螢光，代表 E、NS2B、NB3-180、NS2B3-180 基因表現會促使Cytochrome c 從粒線體釋放出來，證明能引起細胞凋亡。