第五章 討論
第二節 建議
第二節 建議
對於本篇的實驗，在未來，我們可以利用西方墨點法做一些本篇沒使 用到的調控細胞凋亡的其他抗體，更進一步探究調控細胞凋亡因子。
而後也可以做抗體的抑制劑，去看他抑制抗體的現象。例如加入caspase 3抑制劑Ac-DEVD-CHO，去看它抑制caspase 3的現象。對於病毒蛋白 誘導細胞凋亡更進一步確認。
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表
表一 MOI 為 0.1 時日本腦炎病毒感染 HL-CZ 細胞之細胞週期分析
MOI = 0.1 0 24 48 72 96
1 0 0 1.71 17.47 52.76
2 0.38 0.59 1.13 12.55 38.47
3 2.32 2.5 1.72 11.46 39
AVERAGF 0.9 1.03 1.52 13.82667 43.41
STDEV 1.244347 1.30679 0.337787 3.201942 8.101673
表二 MOI 為 0.1 時日本腦炎病毒感染 TE-671 細胞之細胞週期分析
MOI = 0.1 0 24 48 72 96
1 0 0 0 0.87 0.54
2 0 0.34 0.57 0.31 1.54
3 0 1.35 1.44 1.12 1.63
AVERAGF 0 0.563333 0.67 0.766667 1.236667
STDEV 0 0.702163 0.72519 0.414769 0.605007
表三 MOI 為 1 時日本腦炎病毒感染 HL-CZ 細胞之細胞週期分析
MOI = 1 0 24 48 72 96
1 1.12 1.38 5.14 21.34 25
2 0.8 1.6 11.79 12.29 29.54
AVERAGF 0.96 1.49 8.465 16.815 27.27
STDEV 0.226274 0.155563 4.70226 6.399316 3.210265
表四 MOI 為 1 時日本腦炎病毒感染 TE-671 細胞之細胞週期分析
MOI = 1 0 24 48 72 96
1 0.17 0.27 0.31 3.76 4.46
2 0.33 1.03 6.52 9.41 8.96
AVERAGF 0.25 0.65 3.415 6.585 6.71
STDEV 0.113137 0.537401 4.391133 3.995153 3.181981
表五 病毒蛋白表現 HL-CZ 之細胞週期分析
Apoptosis% pcDNA3.1 pE pNS1 pNS2B pNS3-180 pNS2BNS3-180 pNS4A pNS4B
1 4 7.64 7.13 18 25.92 31.23 7 0
2 2.1 10.77 7.63 12 18 27.07 9.77 2.18
AVERAGF 3.05 9.205 7.38 15 21.96 29.15 8.385 1.09
STDEV 1.343503 2.213244 0.353553 4.242641 5.600286 2.941564 1.958686 1.541493
表六 病毒蛋白表現 TE-671 之細胞週期分析
Apoptosis% pcDNA3.1 pE pNS1 pNS2B pNS3-180 pNS2B3-180 pNS4A pNS4B
1 0.01 0.26 0.12 0.15 7.78 15.26 0.06 0
2 0 0.07 0.07 1.13 6.71 21.33 0.4 0.07
AVERAGF 0.005 0.165 0.095 0.64 7.245 18.295 0.23 0.035
STDEV 0.007071 0.13435 0.035355 0.692965 0.756604 4.292138 0.240416 0.049497
表七 日本腦炎病毒蛋白表現HL-CZ 細胞誘導 Caspase 3 蛋白產生的比例 Caspase
3 pcDNA3.1 pE pNS1 pNS2B pNS3-180 pNS2B3-180 pNS4A pNS4B
1 48.8 75.8 60 70 153 173 42 45
2 21.1 68 53 59 113 110 48 60
AVERAGF 34.95 71.9 56.5 64.5 133 141.5 45 52.5
STDEV 19.58686 5.515433 4.949747 7.778175 28.28427 44.54773 4.242641 10.6066
表八日本腦炎病毒蛋白表現TE-671 細胞誘導 Caspase 3 蛋白產生的比例 Caspase
3 pcDNA3.1 pE pNS1 pNS2B pNS3-180 pNS2B3-180 pNS4A pNS4B
1 56 73 59 85 121 136 80 76
2 24 39 50 74 89 76 49 48
AVERAGF 40 56 54.5 79.5 105 106 64.5 62
STDEV 22.62742 24.04163 6.363961 7.778175 22.62742 42.42641 21.92031 19.79899
表九 利用流式細胞儀測JEV 蛋白在 HL-CZ 細胞表現後測活性氧化物的 產生與否。
pcDNA3.1 pE pNS2B pNS3-180 pNS2BNS3-180 pNS4B
1 50 47.2 50.7 52 44 29
2 49.4 48.2 46.6 44.2 41.6 41.1
3 48.5 45 47.2 42.8 42.7 37.8
AVERAGF 5 4.74645 5.146011 4.809689 4.615108 4.204988 STDEV 0.150997 0.327414 0.442869 0.99143 0.240278 1.250973
表十 利用流式細胞儀測JEV 蛋白在 TE-671 細胞表現後測活性氧化物的 產生與否。
pcDNA3.1 pE pNS2B pNS3-180 pNS2BNS3-180 pNS4B
1 50 24.6 93.6 23.1 90 50
2 53 17.7 93.3 22 91 40
AVERAGF 5 2.053398 22.0922 1.206528 20.06652 2.486188 STDEV 2.12132 4.879037 0.212132 0.777817 0.707107 7.071068
表十一 利用流式細胞儀測JEV 蛋白在 HL-CZ 細胞表現後測細胞鈣離子 的變化。
pcDNA3.1 pE pNS2B pNS3-180 pNS2BNS3-180 pNS4B
1 49 53 57 43 59 40
2 50 52 46 47 64 32
AVERAGF 5 5.30303 4.904762 4.368932 6.833333 2.926829 STDEV 0.141421 0.141421 1.555635 0.565685 0.707107 1.131371
表十二 利用流式細胞儀測JEV 蛋白在 TE-671 細胞表現後測細胞鈣離子 的變化。
pcDNA3.1 pE pNS2B pNS3-180 pNS2BNS3-180 pNS4B
1 49 12.3 1.8 1.8 19.6 1
2 50 12.7 1.7 3.6 10.5 1.5
AVERAGF 5 1.262626 0.176768 0.272727 1.520202 0.126263 STDEV 0.141421 0.056569 0.014142 0.254558 1.286934 0.070711
表十三 利用流式細胞儀測JEV 蛋白在 HL-CZ 細胞表現後測膜電位的變 化
。 pcDNA3.1 pE pNS2B pNS3-180 pNS2BNS3-180 pNS4B
1 49 68 44.5 50 52 45
2 50 65 46.8 54 53 42
AVERAGF 5 6.717172 4.611111 5.252525 5.30303 4.393939 STDEV 0.141421 0.424264 0.325269 0.565685 0.141421 0.424264
表十四 利用流式細胞儀測JEV 蛋白在 TE-671 細胞表現後測膜電位的變 化。
pcDNA3.1 pE pNS2B pNS3-180 pNS2BNS3-180 pNS4B
1 52 42.3 54.2 58 83 45
2 46 41.7 60.6 53 68 31
AVERAGF 5 4.285714 5.857143 5.663265 7.704082 3.877551 STDEV 0.848528 0.084853 0.905097 0.707107 2.12132 1.979899
圖
圖一 分析日本腦炎病毒分別在MOI 為 0.1 及 1 的條件下感染 HL-CZ 及 TE-671 細胞，在 24-96 小時誘導細胞凋亡程度。
0 10 20 30 40 50 60
0 24 48 72 96
時間 (hr)
Apoptosis %
TE-671 MOI=0.1 TE-671 MOI=1 HL-CZ MOI=0.1 HL-CZ MOI=1
M NS2B M NS3-180 M NS2BNS3-180
（A） （B） （C）
圖二 NS2B（A）、NS3-180（B）、NS2BNS3-180（C）PCR 電泳圖 將PCR DNA 產物跑 2%瓊酯凝膠（2% agarose gel）進行電泳分析，確定 PCR 產物片段大小正確。
400bp
1kb
600bp 1kb
1kb 393bp
540bp
933bp
M NS2B M NS3-180 M NS2BNS3-180
（A） （B） （C）
圖三 基因轉殖電泳分析
分別利用BamHΙ、EcoRΙ限制內切酶處理接到相同切位的pcDNA 載體上 經轉型到勝任細胞上，再利用基因轉殖電泳分析進行質體選殖。
NS2B/pcDNA3.1（A）、NS3-180/pcDNA3.1（B）、NS2BNS3-180/pcDNA3.1
（C）
933bp 6Kb
500bp 300bp
500bp
6Kb 6Kb
1kb
393bp 5514bp
540bp
5514bp 5514bp
A：pcDNA/His C E：pE
B： pcDNA/His C（EGFP） F：pE（EGFP）
C：anti：His（Rhodamine） G：anti：His（Rhodamine）
D：B＋C merge H：F＋G merge
圖四E 蛋白表現 HL-CZ 細胞之免疫螢光染色
在HL-CZ 細胞分別進行（pcDNA/His C，pE）：pEGFP 以 9 比 1 的比例 進行轉染，培養兩天後以螢光顯微鏡觀察。綠色螢光為EGFP 蛋白（圖 B、
F），紅色螢光利用 anti：His（Rhodamine）表現出來的 E 蛋白（圖 G），
merge 後呈現黃色螢光（圖 D、H）。
A：pNS1 E：pNS2B
B：pNS1（EGFP） F：pNS2B（EGFP）
C：anti：His（Rhodamine） G：anti：His（Rhodamine）
D：B＋C merge H：F＋G merge
圖五NS1、pNS2B 蛋白表現 HL-CZ 細胞之免疫螢光染色
在HL-CZ 細胞分別進行（pNS1，pNS2B）：pEGFP 以 9 比 1 的比例進行 轉染，培養兩天後以螢光顯微鏡觀察。綠色螢光為EGFP 蛋白（圖 B、F）， 紅色螢光利用anti：His（Rhodamine）表現出來的 NS1、pNS2B 蛋白（圖 C、G），merge 後呈現黃色螢光（圖 D、H）。
A：pNS3-180 E：pNS2bns3-180
B：pNS3-180（EGFP） F：pNS2BNS3-180（EGFP）
C：anti：His（Rhodamine） G：anti：His（Rhodamine）
D：B＋C merge H：F＋G merge
圖六 NS3-180、NS2BNS3-180 蛋白表現 HL-CZ 細胞之免疫螢光染色 在HL-CZ 細胞分別進行pNS3-180，pNS2BNS3-180 與pEGFP以 9 比 1 的比
例進行轉染，培養兩天後以螢光顯微鏡觀察。綠色螢光為EGFP 蛋白（圖 B、F），紅色螢光利用 anti：His（Rhodamine）表現出來的 NS3-180、
NS2BNS3-180 蛋白（圖 C、G），merge 後（圖 D、H）。
A：pNS4A E：pNS4B
B：pNS4A（EGFP） F：pNS4B（EGFP）
C：anti：His（Rhodamine） G：anti：His（Rhodamine）
D：B＋C merge H：F＋G merge
圖七 NS4A、NS4B 蛋白表現 HL-CZ 細胞之免疫螢光染色
在HL-CZ 細胞分別進行（pNS4A，pNS4B）：pEGFP 以 9 比 1 的比例進 行轉染，培養兩天後以螢光顯微鏡觀察。綠色螢光為EGFP 蛋白（圖 B、
F），紅色螢光利用 anti：His（Rhodamine）表現出來的 NS4A、NS4B 蛋 白（圖C、G），merge 呈現黃色螢光（圖 D、H）。
A： pcDNA/His C（EGFP） D：pE（EGFP）
B：anti：His（Rhodamine） E：anti：His（Rhodamine）
C：A＋B merge F：D＋E merge
圖八 E 蛋白表現 TE-671 細胞之免疫螢光染色
在TE-671 細胞分別進行（pcDNA/His C，pE）：pEGFP 以 9 比 1 的比例 進行共同轉染，培養兩天後以螢光顯微鏡觀察。綠色螢光為EGFP 蛋白
（圖A、D），紅色螢光利用 anti：His（Rhodamine）所表現出來的 E 蛋 白（圖E），merge 後呈現出黃色螢光（圖 C、F）。
A：pNS1（EGFP） D：pNS2B（EGFP）
B：anti：His（Rhodamine） E：anti：His（Rhodamine）
C：A＋B merge F：D＋E merge
圖九NS1、NS2B 蛋白表現 TE-671 細胞之免疫螢光染色
在TE-671 細胞分別進行（pNS1，pNS2B）：pEGFP 以 9 比 1 的比例進行 共同轉染，培養兩天後以螢光顯微鏡觀察。綠色螢光為EGFP 蛋白（圖 A、
D），紅色螢光利用 anti：His（Rhodamine）所表現出來的 NS1、pNS2B 蛋白（圖B、E），merge 後呈現出黃色螢光（圖 C、F）。
A：pNS3-180（EGFP） D：pNS2BNS3-180（EGFP）
B：anti：His（Rhodamine） E：anti：His（Rhodamine）
C：A＋B merge F：D＋E merge
圖十 NS3-180、NS2BNS3-180 蛋白表現 TE-671 細胞之免疫螢光染色 在TE-671 細胞分別進行 pNS3-180，pNS2BNS3-180：pEGFP 以 9 比 1 的 比例進行共同轉染，培養兩天後以螢光顯微鏡觀察。綠色螢光為EGFP 蛋白（圖A、D），紅色螢光利用 anti：His（Rhodamine）所表現出來的 NS3-180、NS2BNS3-180 蛋白（圖 B、E），merge 後呈現出黃色螢光（圖 C、F）。
A：pNS4A（EGFP） D：pNS4B（EGFP）
B：anti：His（Rhodamine） E：anti：His（Rhodamine）
C：A＋B merge F：D＋E merge
圖十一 NS4A、NS4B 蛋白表現 TE-671 細胞之免疫螢光染色
在TE-671 細胞分別進行（pNS4A，pNS4B）：pEGFP 以 9 比 1 的比例進 行共同轉染，培養兩天後以螢光顯微鏡觀察。綠色螢光為EGFP 蛋白（圖 A、D），紅色螢光利用anti：His（Rhodamine）所表現出來的 NS4A、NS4B 蛋白（圖B、E），merge 後呈現出黃色螢光（圖 C、F）。
A： pcDNA/His C F：pcDNA/His C（FITC）
B：pE G：pE（FITC）
C：pNS2B H：pNS2B（FITC）
D：pNS3-180 I：pNS3-180（FITC）
E：pNS2BNS3-180 J：pNS2BNS3-180（FITC）
圖十二 E、NS2B、NB3-180、NS2BNS3-180 蛋白表現 TE-671 細胞之免 疫螢光染色
分別將pE、pNS2B、pNB3-180、pNS2BNS3-180 轉染在 TE-671 細胞，
培養兩天後以螢光顯微鏡觀察。自然視野下觀察到E、NS2B、NB3-180、
NS2BNS3-180 蛋白表現在 TE671 細胞（圖 B、C、D、E）。綠色螢光為 利用anti：JEV（FITC）所表現出來的 E、NS2B、NB3-180、NS2BNS3-180 蛋白（圖G、H、I、J）。
圖十三 日本腦炎病毒蛋白分別對 HL-CZ 細胞與 TE671 細胞誘導細胞凋 亡程度。
0 5 10 15 20 25 30 35 40
pcDNA3.1 pE pNS1 pNS2B pNS3-180 pNS2B3-180
pNS4A pNS4B
JEV protein expressing in HL-CZ and TE-671 cells
Apoptosis%
HL-CZ TE-671
A： pcDNA/His C F：pcDNA/His C（Annexin V）
B：pE G：pE （Annexin V）
C：pNS2B H：pNS2B（Annexin V）
D：pNS3-180 I：pNS3-180（Annexin V）
E：pNS2BNS3-180 J：pNS2BNS3-180（Annexin V）
E：pNS2BNS3-180 J：pNS2BNS3-180（Annexin V）