第二章 文獻查證
第五節 活性氧化物與細胞凋亡相關性
活性氧化物（Ractive Oxygen Species 簡稱 ROS）為氧的化學反應之衍 生物，它包括自由基（free radicals）像是超氧離子、氫氧自由基，過 氧化氫。它們的高化學反應會使的 DNA、蛋白質、碳水化合物和脂質 遭受破壞。細胞則利用抗氧化防禦系統去對抗活性氧化物，經由直接 或是間接去對抗氧化性傷害。當活性氧化物去克服這些防禦系統，結 果產生氧化壓力（oxidative stress）。氧化壓力包含病理引起的疾病如 AIDS、帕金森氏症（Parkinson＇s disease）、阿茲海默症（Alzheimer＇
s disease）和一些退化性神經性疾病。氧化壓力主要的來源為活性氧化 物，故調節活性氧化物對於調控氧化壓力扮演著重要角色，亦可以使 用技術去調控細胞凋亡有關的氧化壓力。活性氧化物會調節多種細胞
第六節 粒線體膜電位與細胞凋亡相關性
在凋亡研究的早期，從形態學觀察上粒線體沒有明顯的變化。隨著凋 亡機制的深入研究，在細胞凋亡過程中粒線體跨膜電位（Mitochondria membrane potential 簡稱 MMP）會改變，主要是由於粒線體內膜發生 動態的通透性轉變，這是因為生成了由粒線體各部分的蛋白質與細胞 質中蛋白質聯合組成的通透性轉變孔道（mitochondria permeability transition pore 簡稱 PTpore），PT 孔道位於粒線體內膜與外膜接觸位 點。PT 孔道主要功能調控粒線體內容物的釋放，包括了兩大部分：ㄧ 個是粒線體內膜與 adenine nucleotide translocator（ANT）相關之蛋白 質；另一個為外膜蛋白質（porin、voltage-dependent anion channel，
VDAC）。當粒線體基貭的 ATP/ADP 通道打開時，藉由粒線體氧化磷 酸化產生 ATP。當 ATP/ADP 通道打開時，粒線體內膜兩側氫離子梯度 消失、粒線體膜電位下降，使粒線體外膜漲破，而 caspase-inducing factors cytochrome c 和 AIF 釋放到細胞貭液中造成細胞凋亡。故粒線 體 膜 電 位 下 降 在 細 胞 凋 亡 中 為 一 重 要 指 標 （ 4 2 - 4 3 ）。
第七節 鈣離子測定與細胞凋亡相關性
對於多數的生理狀況而言，細胞內鈣離子（Calcium）信號扮演著一個 重要角色，經由調節鈣離子依賴型酵素像是磷脂酶、蛋白酶，核酸酶
導致細胞受傷和細胞凋亡。粒線體沿著內貭網的路徑對調節細胞內鈣 離子的含量扮演著關鍵角色。粒線體為鈣離子運送機制主要位子，經 由粒線體而釋出鈣離子進入內膜。當細胞鈣離子過量時，細胞內液的 鈣離子會佔據著粒線體，此時會誘發細胞膜孔道打開，會產生粒線體 膜電位改變。粒線體會釋出 cytochrome c，隨後活化 caspase，但抑制 細胞死亡。Bcl-2 家族蛋白在調控細胞凋亡上扮演著重要角色。這些蛋 白會出現在調控細胞內鈣離子上。當 Bcl-2 蛋白在細胞內表現減少就 會調控鈣離子上升而誘導細胞凋亡（43）。
第八節 研究架構
首先，利用流式細胞儀研究日本腦炎病毒誘導HL-CZ 及 TE-671 細胞 產生細胞凋亡現象。隨後，我們利用分子選殖技術，建立日本腦炎病 毒蛋白 E、NS1、NS2B、NS3-180、NS2B-NS3-180、NS4A 及 NS4B 個別表現細胞株，並以免疫螢光染色來確認病毒蛋白表現。再利用流 式細胞儀觀察病毒蛋白表現細胞是否也能獨自引發細胞凋亡。進一 步，若病毒蛋白表現能獨自引發細胞凋亡，藉由偵測早期細胞凋亡的 Annexin V 染色與 Caspase-3 活性分析來更加確認細胞凋亡的產生。接 著由西方墨點法探討病毒蛋白引發細胞凋亡的路徑。最後由流式細胞 儀觀察病毒蛋白表現可能引起活性氧化物產生、細胞粒線體膜電位的 改變及細胞鈣離子釋引發細胞凋亡之分子機制。
流程圖：
第三章、研究方法
第一節 研究設計 1
研究標的I 之設計目的：日本腦炎病毒誘導 HL-CZ 及 TE-671 細胞產生細胞凋亡？
方法：將日本腦炎病毒感染TE-671 及 HL-CZ 細胞。條件為（1）MOI 為0.1，病毒數為 1×104 pfu/ml 細胞數為 1×105個cell / T30 flask
（2）MOI 為 1，病毒數為 4×104 pfu/ml 細胞數為 4×104個cell / T30 flask，分別培養 24、48、72 與 96 小時。依不同時間點收 下細胞，加入2-3ml 70％酒精，進行細胞固定。放置在-20℃冰 箱存放。第二天，加入propidium iodide（PI）染劑，37℃避光 反應30 分鐘後，再以流式細胞儀進行分析。
2 研究標的 II 之設計
目的：何種病毒蛋白是否能獨自引發細胞凋亡？
方法：1 利用分子選殖技術，建立日本腦炎病毒蛋白 E、NS1、NS2B、
NS3-180、NS2BNS3-180、NS4A 及 NS4B 個別表現細胞株。
2 將病毒蛋白各別 cDNA 轉染於 2×105cell/well 中，使病毒蛋白 表現在TE-671 及 HL-CZ 細胞。48 小時將細胞收下，加入 2-3ml 70％酒精，進行細胞固定。放置在-20℃冰箱存放。第二天，加
入propidium iodide（PI）染劑，37℃避光反應 30 分鐘後，再 以流式細胞儀進行分析。
3 進一步，若病毒蛋白表現能獨自引發細胞凋亡藉 Caspase-3 活性分析、Annexin V 染色確認病毒蛋白造成細胞凋亡。再由 西方墨點法得知病毒蛋白造成細胞凋亡的傳遞路徑。
3 研究標的 III 之設計
目的：病毒蛋白表現細胞引發細胞凋亡分子機制為何？
方法： 利用流式細胞儀分析病毒蛋白表現細胞可能促使活性氧化物 增加、粒線體膜電改變、鈣離子濃度上升引發細胞凋亡之分 子機制。
第二節 研究材料
1 病毒株：日本腦炎病毒 （Japanese encephalitis virus , JEV）
放大條件：利用日本腦炎病毒感染 BHK-21 細胞至 CPE 現象出現（約 兩天），離心收取上清液，冰至-80 冰箱。
2 細胞株 ( cell line )：
HL-CZ：人類單核球細胞 （Human promonocytic leukemia cell）購於 BCRC NO.60043。
培養條件：含 10 %的 FBS（fetal bovine serum）的 RPMI -1640 培養
液，置於 5％CO2、37℃恆溫培養箱。
TE-671:人類腦胚胎瘤細胞（Human Caucasian medulloblastoma），
感謝本校 楊文光教授提供。
培養條件：含有 2 mM L-glutamine、1.5 g/L sodium bicarbonate、0.1 mM non-essential amino acids、1.0 mM sodium pyruvate 、5 %的 FBS（fetal bovine serum）的 Minimum essential medium (MEM)培養液，置於 5
％CO2、37℃恆溫培養箱。
3 大腸桿菌菌株（ Escherichia coli ）
Top10 : 基因型為 F-，mcrA，∆(mrr-hsdRMS-mcrBC)，φ80lacZ ，∆M1，
∆lacX74， recA1，araD139，galU，galK ，∆(ara-leu)7697，rpsL (StrR)， endA1, nupG，用於質體轉形（transformation）、質體製備。
4 質體 ( Vector )
1pcDNA3.1/His C 含 有 5.5kb 個 鹼 基 配 對 ， 可 在 哺 乳 動 物 細 胞
（mammalian cells）中，經 human cytomegalovirus immediate-early (CMV)promoter表現蛋白質，N’端帶Anti-Xpress epitope tag、His-tag。
2pEGFP-N1含有4.7個鹼基配對，可在哺乳動物細胞中，經CMV promoter表現Enhanced green fluorescent protein (EGFP)蛋白質，在顯
微鏡下產生綠色螢光。
5 引子(primer)
F: NS2bNS3-180-pcDNA3.1（BamHΙ）
ACCGGATCCGGGTGGCCAGCTACTGAG R:myc-NS2bNS3-180-pcDNA3.1（EcoRΙ）
TGCAGAATTCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCG GTATAAGCTTCTGGGACTGG
F- NS3-180- pCDNA3.1-c﹙BamH I﹚
ACCCGGATCCGGAGGCGTGTTTTGGGACACG R:myc-NS3-180-pcDNA3.1（EcoRΙ）
TGCAGAATTCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCG GTATAAGCTTCTGGGACTGG
F: NS2B-pcDNA3.1（BamHΙ）
ACCGGATCCGGGTGGCCAGCTACTGAG R- NS2B- pcDNA3.1-c﹙EcoRI﹚
TGCAGAATTCTCTTTTTGTTGTCTTTAGAGT
6 抗體(Antibody)
Mouse Anti-His tag antibody (Novagen TM)
Anti-mouse IgG（goat），AP labeled antibody(PerKlin-ElmerTM) Anti-Rabbit IgG AP-linked(Cell Signaling)
Rhoamone anti mouse IGg Ab (PerKlin-ElmerTM)
Anti-β-actin antibody（SIGMA）
Anti-caspase3 antibody(IMGENEX) Anti-caspase8 antibody(upstate) Anti-caspase9 antibody(MDBio,inc)
7 實驗試劑及緩衝液 試劑與緩衝液於附錄一 8 儀器、器材
實驗所用儀器、器材於附錄二
第三節 實驗方法
1 細胞培養
（1）懸浮細胞培養
將HL-CZ 培養於含有 10 %的 FBS（fetal bovine serum）的 RPMI -1640 培養液中，置於 5％CO2、37℃恆溫培養箱。當細胞生長在培養盤 70
％至80％時，利用培養盤裡原有的培養液將細胞沖離培養盤底部，吸 起所有舊培養液，放置在 15ml 離心管，離心 1200rpm 5 分鐘，去除 上清液，以1xPBS（phhosphate buffer saline）清洗細胞後，離心去除 上清液，再加入 3-4ml 培養液輕輕打散細胞，保留 1ml 並補培養液至 10ml 放回培養箱作繼代培養。當細胞數過多時，可以做細胞冷凍。
（2）貼細胞培養
將 TE-671 培 養 於 含 有 2 mM L-glutamine 、 1.5 g/L sodium bicarbonate、0.1 mM non-essential amino acids、1.0 mM sodium pyruvate 、10 %的 FBS（fetal bovine serum）的 Minimum essential medium (MEM)培養液中，置於 5％CO2、37℃恆溫培養箱。當細胞 生長在培養盤70％至 80％時，吸起舊的培養液，以 1xPBS 清洗細 胞後，加入1ml 的 trypsin 於培養箱作用 2 分鐘，再以 3-4ml 培養液 中和trypsin 後，輕輕打散細胞，保留 1ml 並補培養液至 10ml 放回 培養箱作繼代培養。當細胞數過多時，可以做細胞冷凍將其冷凍在 液態氮中。
2 細胞週期測定（1）
病毒感染細胞－流式細胞儀（Flow Cytometry Assay）
將細胞培養在 T30 內，MOI 為 0.1：細胞數為 1×105個 cell / T30 flask，並於每個 T30 加入 1×104 pfu/ml 日本腦炎病毒液；MOI 為 1：
細胞數為 4×104個cell / T30 flask，並於每個 T30 加入 4×104 pfu/ml 日本腦炎病毒液分別培養 24、48、72 與 96 小時。依不同時間點收 下細胞，以trypsin 將細胞打下（懸浮細胞則否）放入試管中，離心 1200rpm，5 分鐘去除上清液，再以 1X PBS 清洗兩次，離心
Channels (PE-A) propidium iodide（PI）染劑【25μl PI（1mg/ml），0.5μl RNase（10mg/ml）
於 500μl PBS 中】視細胞數多寡而定。移至 FACS 管，37℃避光反
3 質體純化 ( plasmid purification )
取含有質體的單一菌落，以3ml LB 在 37°C 培養箱培養至 log phase 後取出，離心 12,000rpm 3 分鐘，倒掉上清液，用 Gene-SpinTM Miniprep Purification Kit 來純化質體。1）以 solution I 溶液 200μl resuspend pellet，2）solution II 溶液 200μl 上下倒置數次 3）solution III 溶液 200μl 上下輕搖數次，離心 12,000rpm 15 分鐘。4）將 spin column 插入一收集管（collection tube）中，並將離心後的上清液移 至spin collumn 中，離心 12,000rpm 1 分鐘，去除上清液。
5）加入 700μl Washing solution，離心 12,000rpm 1 分鐘，去除上 清液，再離心 12,000rpm 3 分鐘，去除上清液。
6）再將收集管以 1.5ml 微量離心管置換，加入 20μl ddH2O 放置 2 分鐘，4℃離心 12,000rpm 5 分鐘。
7）回收質體放置在-20 冰箱備用。
4 聚合酵素連鎖反應 （polymerase chain reaction，PCR）
在 0.5ml 微量離心管中，取病毒反轉錄的 cDNA 5 μl 做為模版 (template)，依序加入 ddH2O 79μl，10X Optipol buffer 10 μl ，dNTP (10mM) 1 μl，Primer F 與 Primer R (10mM)各 2 μl ，最後加 Optipol Taq polymerase 1 μl，總體積為 100 μl。混合均勻後加入約 20 μl 的礦物油在置於聚合酵素連鎖反應器（thermohybrid）的反應槽中。
反應條件：
1. 94℃作用五分鐘
2. 94℃作用 1 分鐘的 DNA 變性反應 3. 52℃作用一分鐘三十秒的鏈合反應
4. 72℃作用一分鐘的 DNA 合成反應，進行 40 個反應週期。
5 之後以 72℃作用十五分鐘將 DNA 片段補齊。
6 最後設定 4℃保存。
將PCR DNA 產物跑 2%瓊酯凝膠（2% agarose gel）進行電泳分 析。確定PCR 產物片段大小正確，以 Spin PCR Clean-Up system 試劑套組（Viogene）將 DNA 純化。
5 限制酵素的處理
PCR 得到的產物，以 Spin PCR Clean-Up system 試劑套將 DNA 純 化後，以30 μl 的 ddH2O 將 DNA 溶出，加入 10X reaction buffer 10μl 及切位的限制酵素依照最佳比例配製，使總體積為 100 μl，以 37℃
作用三小時。相對應的質體載體亦以同樣的方式進行限制酵素的水 解，來構築實驗的表現載體。
6 質體的構築
10X ligation buffer 1μl、ligase 1μl、質體載體 1μl，加上欲接合的
Target DNA 7μl，16℃作用一個晚上。
7 大腸桿菌之轉型 （transformation）
將構築好的質體 10μl 加到 200μl 適應性細胞（Top10）中，混合後 放在冰上作用三十分鐘。再放置在42℃水浴槽反應 90 秒後，迅速 放置冰上三分鐘，之後在flow 中加入 800μl 不含抗生素的 LB 培養 液。在37℃ 培養箱培養一小時後，離心 5000rpm 5 分鐘去除上清 液，均勻塗在含抗生素的LB 培養基
8 DNA 轉染（DNA transfection）
細胞的轉染是利用Arrest In(AI) Transfection Kit 試劑。
將 2×105cell/well 轉染於 6-well plate 中培養至隔夜（懸浮細胞則
將 2×105cell/well 轉染於 6-well plate 中培養至隔夜（懸浮細胞則