2-1-1 化學藥品與材料
QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit 購自於 Stratagene 培養液的成分Trypton、Yeast Extract 購自於 DIFCO
建構質體的限制酵素購自於 New England BioLabs Inc.
接合酵素 T4 DNA ligase 購自於 Promega 洋菜凝膠 ( Agarose ) 購自於 USB
DNA 染色劑 ( SYBR Green I ) 購自於 Roche
聚合連鎖反應試劑dNTP 及引子 ( Primer ) 購自於誠樺實業有限公司 Biobasic Inc.
GFX Micro Plasmid Prep Kit 、 Gel Band Purification Kit 購 自 於 Amersham Pharmacia Biotech
Sodium sulfate ( NaSO4 )、Ethyl acetate ( EA )、Ether、Hexane、Potassium hydroxide ( KOH ) 、 Dichloromethane ( CH2Cl2 ) 、 Silver nitrate ( AgNO3 )、Acetone、Sea sand 購自於默克
Ergosterol 、 Glucose 、 Adenine 、 Lysine 、 Histidine 、 Trptophan 、 Methionine、Uracil、Pyrogallol 購自於 Sigma
Hemin Chloride 購自於 CALBIOCHEM
2-1-2 儀器
微量旋轉式真空濃縮機 ( EYELA, rotary vaccum evaporator N-N series )
數位照相系統 ( Kodak, DC120 Kodak Electrophoresis Documentation and Analysis System 120 )
震盪培養箱( Firstek Scientific, orbital shaking incubator Model-S302R ) PCR ( Perkin Elmer, GeneAmp PCR System 9700 )
紫外光/可見光光譜儀 ( Beckman, DU 7500 Spectrophotometer ) 高速離心機 ( Beckman, Allegra 21 Series )
電泳槽 ( Amersham Pharmacia Biotech ) 脈衝控制器 ( BioBad , Pulse Controller )
2-1-3 菌株與載體
菌株與載體及培養基成分 菌株:
XL1-Blue：
大腸桿菌之一株，購自於Stratagene 公司。
CBY57：
為酵母菌的一種菌株 ( MATa or MATα ERG7△:: LEU2 ade2-101 his3-△200 leu2-△1 lys2-801 trp1-△63 ura3-52〔pZS11〕 )，可供菌 株選殖篩選之用。另外，此菌中含有質體 pZS11 帶有 ERG7 可彌補 酵母菌體中 ERG7 的缺陷。
TKW14C2：
his3-△200 leu2-△1 lys2-801 trp1-△63 ura3-52 hem1△::kanR )，可供菌 株選殖篩選之用，並以此為宿主大量培養含突變的 OSC，用以獲得 突變產物。
載體 RS314：
購自於 New England BioLabs 公司。載體 RS314 是一可穿梭於酵母 菌 S. Cerevisiae 和大腸桿菌 E.coli 間的載體 ( Shuttle Vector )，帶有選 擇性標記 Trp1。
2-1-4 溶液與緩衝液
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl β-D-Galactoside ( X-Gal ) :
取X-gal 溶於 Dimethylformamide ( DMF )，濃度為 20 mg/mL，避光 儲存於-20 ℃。
20 % Isopropyl β-D-Thiogalactopyranoside ( I PTG )：
將 2 g IPTG 溶於 8 mL 二次去離子水中，再用二次去離子水補至 10 mL，以 0.2 µm 的濾膜過濾，使其呈無菌狀態。
100 mg/mL Ampicillin：
將Ampicillin 溶於二次去離子水，再用 0.2 µM 濾膜過濾，去除雜菌，
儲存於 -20 ℃。
TAE Buffer：
40 mM Tris acetate，2 mM EDTA，pH 8.5，存於室溫。
80 % Glycerol：
80 mL Glycerol 加入 20 mL 一次去離子水混勻，高壓滅菌後存於室溫。
50 X ALTH：
0.2 % Adenine，0.3 % Lysine，0.2 % Tryptophan，0.2 % Histidine，經 高壓滅菌後存於4 ℃。
50 X ALHU：
0.2 % Adenine，0.3 % Lysine，0.2 % Histidine，0.2 % Uracil，經高壓 滅菌後存於4 ℃。
50 X ALH：
0.2 % Adenine、0.3 % Lysine、0.2 % Histidine 經高壓滅菌後存於 4 ℃。
50 X ALTHMU：
0.2 % Adenine，0.3 % Lysine，0.2 % Tryptophan，0.2 % Histidine，0.2
% Methionine，0.2 % Uracil，經高壓滅菌後存於 4 ℃。
50 X ALHMU：
0.2 % Adenine，0.3 % Lysine，0.2 % Histidine，0.2 % Methionine，0.2
% Uracil，經高壓滅菌後存於 4 ℃。
20 % EA：
Ethyl Acetate : Hexane = 1 : 4。
TLC 染液：
95 % Alcohol : Sulfonic Acid (conc.) : p-Anisaldehyde = 18 : 1 : 1。
5 X Sequence Buffer：
400 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、pH 9.0
Tris-HCl 取 4.85g、MgCl2 取0.203g 溶於 100 mL 的一次水調 pH 至 9。
2-1-5 培養基
LB Media：
每升培養液的成份含10 g Trypton、5 g Yeast Extract、5 g NaCl、2 g Glucose，均為滅菌後，於使用前加入抗生素 Ampicillin ( 最後總濃度 為100 µg/mL )。
SD：
ALH Plate：
0.17 % Yeast Nitrogen Base ( without amino acids or ammonium sulfate )， 1.5 % Agar ( 固體培養基 )，經高壓滅菌後加入 2 % 50X ALH，2 % Glucose，1M Sorbitol ( 於進行電穿透作用時使用 )。
ALHU Plate：
0.17 % Yeast Nitrogen Base ( without amino acids or ammonium sulfate )， 1.5 % Agar，經高壓滅菌後加入 2 % 50X ALHU，2 % Glucose。
ALHU / FOA Plate：
0.17 % Yeast Nitrogen Base ( without amino acids or ammonium sulfate )， 2 % Glucose，1.5 % Agar，經高壓滅菌後加入 2 % 50X ALHU 以及每 1mL 培養液加 1 mg 5’- FOA。
ALHMU / Heme / Ergosterol Plate：
0.17 % Yeast Nitrogen Base ( without amino acids or ammonium sulfate )， 1.5 % Agar，經高壓滅菌後加入 2 % 50X ALHMU，2 % Glucose，13 µl / 1 c.c 培養液 Heme，13 µl / 1 c.c 培養液 Ergosterol。
2-2 實驗方法
2-2-1 重組質體的建構
(The construction of recombinants)
選殖策略一 飽和突變實驗
飽和突變實驗策略(Saturated mutagenesis strategies)
引子設計 ( primer design )
QuickChange PCR
膠體電泳確認 PCR 產物
Dpn I 去除母股 DNA
轉入大腸桿菌 XL1-Blue
挑單一菌落，抽取重組質體DNA
DNA 膠體電泳
利用設計的限制酵素截切( Mapping )做確認
DNA 定序確認突變序列
第一種方法是利用 Stratagene ( Merck 代理 )的 QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit。先設計含有靜默突變 ( Silent Mutation ) 及定點突變的互補引子( Primer )，以 RS314WT( 含有正常 OSC 序列 的載體 )為模板，利用 QuickChange PCR 的方法，加入 Pfu polymerase 聚合酶以PCR 方式 ( 表 2-1, 2-2 ) 放大而得到的 DNA 產物，再利用 DpnI 限制酶截切甲基化 DNA 之特性，去除母股，只留下含有定點 突變之突變點(表 2-3)。以此方式建構飽和突變( Saturated mutagenesis ) 突變株 ( 圖 2-1 )。
Wild-type Plasmid (TKRMY57),
Mix
PCR Cycle
(Pfu DNA polymerase)
Temperature cycle to extend and incorporate mutation pirmers resulting in nicked circular strands
Mutation pirmers
Digest
(DpnI enzyme)
Digest parental DNA template
Mutated plasmid
Transform
Transform the resulting annealed double-stranded nicked DNA molecules
After transformation, XL1-Blue E.coli cell repairs nicks in plasmid
Wild-type Plasmid (TKRMY57),
Mix
PCR Cycle
(Pfu DNA polymerase)
Temperature cycle to extend and incorporate mutation pirmers resulting in nicked circular strands
Mutation pirmers
Digest
(DpnI enzyme)
Digest parental DNA template
Mutated plasmid
Transform
Transform the resulting annealed double-stranded nicked DNA molecules
After transformation, XL1-Blue E.coli cell repairs nicks in plasmid
圖2-1 選殖策略一 QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit
引子設計 ( primer design ) Wildtype
P M H P G R W W V H T
5` CCC ATg CAT CCg ggg AgA Tgg Tgg gTT CAT ACT 3`
MTY W232 primer 1(Sma I )
P M H P G R W # V H T
5` CCC ATg CAT CCC ggg AgA Tgg NNN gTT CAT ACT 3`
Sma I MTY W232 primer 2
5`AgT ATg AAC NNN CCA TCT CCC ggg ATg CAT ggg3`
Sma I
MTY W232 CFY 1 (Sma I )
P M H P G R W # V H T
5` CCC ATg CAT CCC ggg AgA Tgg T(g/A/T)C gTT CAT ACT 3`
Sma I MTY W232 CFY 2
5`AgT ATg AAC g(A/T/C)A CCA TCT CCC ggg ATg CAT ggg3`
Sma I
MTY W232 DKIM 1 (Sma I )
P M H P G R W # V H T
5` CCC ATg CAT CCC ggg AgA Tgg (g/A) ( A/T) (g/C) gTT CAT ACT 3`
Sma I MTY W232 DKIM 2
5`AgT ATg AAC (g/C) (A/T) (T/C) CCA TCT CCC ggg ATg CAT ggg3`
將突變處設計在primer 上，利用 PCR 放大可直接得到突變點。突 變處在 primer 上前後約各需 3~5 個胺基酸距離，以利黏合反應
基，因此primer 包含了 64 種可能性。在 primer 上設計靜默突變，可 被特定限制酵素截切，而原本的模板RS314WT 不會被切，利用此方 法區分突變點與RS314WT(未突變的 OSC)。
反應物 體積(單位µL)
Template 1 Primer 1 (1 µg/µl) 0.125
Total reaction volume 50
表2-1 : QuickChange Site-Directed Mutagenesis 聚合酶連鎖反應組成
部分 循環次數 溫度 時間
1 cycle 18 cycle
表2-2 : QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit 使用之聚合酶連鎖 反應放大程式
反應物 體積(單位µL)
PCR 產物 25 25 50 10× NE Buffer 4 3 3
DDW 1 1
DpnI 1 1
表2-3 : QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit PCR 產物處理
選殖策略二
第二種方法是參考質體上限制酵素之切點，挑選適當的限制酵素 進行基因片段的置換，利用此法將 W232A 與 Y510A、W232A 與 Y510K、H234A 與 Y510A 進行切接置換，完成含雙點突變之突變株 ( 圖 2-2 )。
雙點突變建構策略:
選取適合的限制酵素截切質體，獲得含突變點的區段
以DNA 膠體電泳分離限制酵素作用後的片段
Gel Extraction 獲得 insert DNA 及 vector
接合( Ligation ) 轉入大腸桿菌 XL1-Blue
挑單一菌落，抽取重組質體DNA
DNA 膠體電泳
方法一: Band Purification Kit 純化 膠體中之 DNA，以一定比
接合反應完成後，將反應產物以熱導入( heat shock )方式轉入大腸 桿菌XL1-Blue，於 37℃，1 毫升 LB 培養液培養一小時，待菌長起後 稍微離心去除上清液，將pellet 回溶塗於 Amp/LB 盤上培養 16~20 小 時，待菌長起後，挑單一菌落入3 毫升 Amp/LB 溶液培養約 12 小時，
使菌達至一定濃度後抽取質體 DNA。選取適合的限制酵素截切做初 步確認，之後以DNA 定序方式進一步確認雙點突變序列的正確性。
反應物 體積(單位µL) Plasmid DNA 2
10× NE Buffer 1 Restrict Enzyme 1
BSA 1 加水體積補至10 µL
表 2-4 : 接合反應前以適當限制酵素處理質體 DNA 的條件
2-2-2 質體 DNA 轉殖入活細胞中
(Introduction of DNA into living cells)
→ 將質體導入大腸桿菌(E coli)或酵母菌(yeast)主要利用二種方式，
Heat -shock(熱導入)及電穿孔(Electroporation)
1. 大腸桿菌勝任細胞的製備(Preparation of competent E. coli cell) 活化欲轉形的大腸桿菌XL1-Blue cell，取少許在 Tetracycline ( 100g / 1 mL )的 LB 培養皿上畫 4 區，於 37 ℃隔夜培養。由 Tetracycline / LB plate 挑取單一菌落，接種於 500 ml SOB 培養液，在固定轉速 ( 200~250 rpm ) 的 37 ℃培養箱震盪培養，至 O.D 值達到 A600 = 0.5
~ 0.6，將菌液冰浴 10 分鐘，在轉速 2500 xg，4 ℃下離心 10 分鐘 去上清液，細胞沈澱物以160 ml TB Buffer 沖洗再懸浮，置於冰上 10 分鐘，以相同條件再離心一次，去上清液，小心地加入 40 ml TB Buffer 使細胞沈澱物再懸浮，再加入抗凍劑 DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 2.8 ml，使其最後濃度約 7%，冰浴 10 分鐘，將細胞懸 浮液以每 300 µl 分裝，立即放入液態氮中急速冷凍，將此凍結的 XL1-Blue cell 凍存於-80℃冰箱，此為熱導入 heat-shock 用的勝任 細胞
2. 轉形作用--大腸桿菌吸收重組質體 ( Transformation -- the uptake of recombinant DNA by E.coli )
a. 熱導入 ( Heat shock )
質體轉入勝任細胞XL1-Blue 置於冰上緩慢融解，與要送入的質 體 DNA 混合冰浴 20 分鐘，XL1-Blue 利用冰浴及 CaCl2處理，使
得質體DNA 沈澱於細胞外藉由溫度短暫提高至 42 ℃1 分鐘，此時 膜的通透性增加，膜的孔洞變大，使得附著於細胞外面的質體DNA 可被吸收進入 E.coli 中，再立刻冰浴 1 分鐘，使膜的孔洞通透性變 小，轉形細胞利用此熱導入方法，可將重組質體 DNA 轉入 E.coli 中。將此轉殖勝任細胞置於1 毫升 LB 培養液中，於 37 ℃，200 rpm 培養1~2 小時，取 200 µl 塗於 Ampicillin / LB plate (若菌不濃，則 先稍微離心，去上清液，回溶菌體再塗盤) 在 37 ℃培養 16~20 小 時後，挑單一菌落入3 毫升 Amp / LB 養 12~16 小時，利用 GFXMicro Plasmid Prep kit 抽取質體 DNA，再利用設計好的限制酵素切位確 認重組DNA 的正確性。由於 XLI-Blue 含 tetr gene ( XL1-Blue 帶有 Tetracycline 抗性基因 ) 而質體 PRS314 帶有抗 Ampicillin 的基因，
因此可利用Amp / LB plate 篩選轉形細胞，只有轉型成功的細胞可 同時在Amp / LB plate 及 Tet / LB plate 生長。
b. 酵母菌株 CBY57 及 TKW14C2 的電穿孔作用
此方法將重組質體利用脈衝控制器以電穿孔的方式進入酵母菌 菌株 CBY57。在 30 ℃的培養箱中將 CBY57 培養於 SD 含 Ade + Lys + Trp + His + Glucose 的培養液，當菌液之 OD 值達到 A600 = 1∼1.5 間。此時將菌液分裝至四個 50 mL 的離心瓶中，於 4 ℃下 以 3000 rpm 十分鐘將細胞離心下來，再以 50 mL 之 4 ℃無菌水 將細胞懸浮，重複前述方法將細胞離下。利用 25 mL 的 4 ℃無菌 水將細胞懸浮，重複前述方法將細胞離下。以 4 mL 無菌的 1M Sorbitol 將細胞懸浮，將四管合併成一管再度以前述方法將細胞離 下。用 50 µL 乘以重組質體樣品數的無菌 1M Sorbitol 體積將細
鐘，接著將混合液置入 2 mm 的電穿透玻璃管，設定玻璃管入脈衝 控制器以1.5 kV，200 mA，25 µF 進行電穿透作用。在電擊後立刻 加入500 µL 無菌的 1M Sorbitol 將細胞懸浮混勻，各取 50 µL 與 200 µL 塗於含 ALH ( Ade + Lys + His ) 之培養皿，待菌液稍乾，
反置入30 ℃恆溫箱中培養 3 至 5 天，經成功轉化之細胞會長至 清晰可見之菌落。
將重組質體以電穿孔方式轉入酵母菌菌株 TKW14C2 的方法同 上述，但TKW14C2 與 CBY57 相比，其不含正常的 OSC 功能 ( 不 含 ERG7 基因 ) 且 Heme 基因被置換掉，因此培養液要額外補充 Hemin + Ergosterol + Met ( Methionine 在體內的生合成與 Heme 基 因相關，當 Heme 基因被置換掉，Methionine 的生合成會受影響，
故要額外補充 )。因此將 TKW14C2 培養在 SD+ Glucose + Ade + Lys + Trp + His + Met + Hemin + Ergosterol 於 30 ℃培養，其餘步驟 同CBY57，而後塗盤在 Glucose + ALHMU ( Ade + Lys + His + Met + Ura ) + Hemin + Ergosterol 之培養皿，等待成功轉化之細胞長至 清晰可見之菌落。
2-2-3 質體交換 (Plasmid Shuffle)
/ 死/活篩選 ( Die / Live selection )
將已進行轉化作用之酵母菌取 200 µL 塗於含有 SD + Ade + Lys + His + 1M Sorbitol 的培養皿上，於 30 ℃下培養三至五天，待 培養皿長出清晰可見之菌落，將每種質體轉化作用的酵母菌挑數 顆菌落個別培養於3 mL 含有 SD + Glucose + Ade + Lys + His + Ura 的培養液中，培養 24 小時。將過夜之菌落各取 100 μL 塗於含
SD + Glucose + Ade + Lys + His + Ura ( 對照組 ) 與 SD + Glucose + Ade + Lys + His + Ura + 5-FOA ( 實驗組 ) 之選擇性的培養皿 上，放入30 ℃培養箱下培養三至五天。由於含 pZS11 的質體無 法在含 5-FOA 的環境中生長﹔因此，能於 SD + Ade + Lys + His + Ura + 5-FOA ( 實驗組 ) 選擇性培養皿上生長的含突變 OSC 重 組質體之酵母菌，即表示此突變 OSC 仍具有 OSC 功能可補足 CBY57 中缺少 ERG7 之環化酶的功能。若重組質體中之 OSC 功能之基因不具功能性，即無法生長在SD + Ade + Lys + His+ Ura + 5-FOA ( 實驗組 ) 之選擇性的培養皿上，此可能代表突變位置 會影響正常的OSC 環化功能，導致無法生成下游產物供菌生長，
透過此種死/活的篩選方式，初步篩選哪些突變位置在 OSC 催化機 制上具有重要影響性。
2-2-4 麥角固醇補充篩選
將含突變OSC 重組質體以電穿透方式轉入酵母菌 TKW14C2，
將含突變OSC 重組質體以電穿透方式轉入酵母菌 TKW14C2，