我主要是想要藉由定點突變的技術，探討氧化鯊烯環化酵素表面 活性區胺基酸的催化功能，探討其殘基在環化重組機制扮演何種決定 性的角色。因此利用 SHC 環化酵素 X-ray 結構為模板，藉由分子模 擬的方式尋找 OSC 可能的活性區域位置，再將這些位置的胺基酸突 變成丙胺酸，或其他具有特殊意義官能基的胺基酸進行產物分析。實 驗 室 先 前 已 依 照 此 種 策 略 建 構 了 一 個 突 變 點 基 因 庫(mutant library)(圖 3-1)，我將這些突變點作為研究氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化 酵素催化機制的初步篩選目標，利用質體交換/反向篩選的方式篩選 探討哪些 OSC 表面活性區域上的殘基在環化重組機制具有決定性的 功能。
圖3-1 : 以 SHC X-ray 結構為模板，分子模擬出 OSC 可能的活性區域 位置對照圖，及所建構的突變株
3-2 質體交換(Plasmid shuffle)/反向篩選(counter selection)
質體交換為一種有效的篩選方法，主要是將一個帶有野生型基因 的質體與帶有突變型基因的質體進行交換作用，利用兩階段的篩選將 野生型的質體交換成為帶有突變型的質體(圖)。本實驗室已成功建構 出 單 倍 體 酵 母 菌 菌 株 CBY57 (MATa/α ERG7∆::LEU2 ade2-101 his3-∆200 leu2-∆1 lys2-801 trpl-∆63[pZS11]) ，此菌株除含有可供篩選 的胺基酸之外，菌體內含質體 pZS11。質體 pZS11 擁有野生型 OSC 基因ERG7 和 URA3 基因，能夠產生 OSC 活性以彌補酵母菌 CBY57 的缺乏，並可自行合成 Uracil，使得在缺乏 Uracil 也能存活。質體 RS314 是一個穿梭載體(shuttle vector)，可攜帶基因片段轉入酵母菌或 大腸桿菌中，此質體上帶有一胺基酸篩選標記基因Trp1。當我們將含 突變之OSC 質體轉入 CBY57，利用 Tryptophan 的選擇性篩選將不含 突變點 OSC 質體的酵母菌去除，此時菌體中除了質體 pZS11 之外也 含OSC 定點突變之 RS314 質體。我們利用 pZS11 上的 URA3 做為反 向 篩 選(counter selection) 的 標 記 基 因 。 Orotidine-5 ，-Phosphate Decarboxylase 是 URA3 基因轉譯的酵素，且是尿嘧啶(Uracil)生合成 的重要酵素。當酵母菌中含 URA3 基因，培養液中若含有 Fluoroorotic Acid(5’-FOA) ，Orotidine-5，-Phosphate Decarboxylase 會將 5’-FOA 轉 變成具有毒性的5-Fluorouracil，使得菌體無法生存，而原本不含 pZS11 的酵母菌，由於 URA3 基因已被剔除，所以可在含有 5’-FOA 的培養 液中正常生長。當培養液中額外添加Uracil，酵母菌的正常生長過程
中含URA3 基因的 pZS11 質體每代約有 1%會隨機的失去，而擁有兩
個質體的菌體在5’-FOA 的添加下會全數的死亡。此時我們可篩出只 含突變點 OSC 的酵母菌，因此菌體存活與否，則取決於此活性區胺
壞OSC 的活性，使其無法正常合成麥角固醇(Ergosterol) ，而麥角固 MATa ERG7 ::LEU2
SD / ALTH MATa ERG7 ::LEU2
trp MATa ERG7 ::LEU2
trp MATa ERG7 ::LEU2
trp
5’’--FOA counter selectionFOA counter selection
Survive MATa ERG7 ::LEU2
SD / ALTH MATa ERG7 ::LEU2
SD / ALTH MATa ERG7 ::LEU2
trp MATa ERG7 ::LEU2
trp MATa ERG7 ::LEU2
trp MATa ERG7 ::LEU2
trp MATa ERG7 ::LEU2
trp MATa ERG7 ::LEU2
trp
5’’--FOA counter selectionFOA counter selection
Survive
以 OSC 假設活性區所建構的突變點為材料，進行前述的質體交 換/ 反 向 篩 選 ， 篩 選 結 果 ( 表 3-1) 發 現 有 九 個 突 變 株 無 法 在 SD+Ade+Lys+Trp+Ura+5’-FOA 的培養皿中生長，但其中 H146A 及 Y707A 二個突變株在培養較長天數後，發現有生長的情形，只是生 長狀況較差，初步推論此可能這二個突變點只是輕微地影響了此酵素 的功能，又或者此二者對酵素的環化重組機制只是間接的調控或擔任 協助的角色。
Mutant site Restriction Enzyme
Counter selection
Ergosterol complement
TLC、GC-MS analysis
OSCF104T Apa I Die Die --
OSCH146A Sal I Live Live --
OSCW232A Sma I / Xho I Live Live New product
OSCW232R Sma I / Xho I Die Die --
OSCH234A Sma I / Xho I Die Die New product
OSCM532A Pst I Die Die --
OSCW587A Bam H I Die Die --
OSCF699A Cla I Die Die --
OSCY707A Cla I Live Live
--
表 3-1 : 以 OSC 假設活性區建構的突變點進行質體交換/反向篩選的 篩選結果。並且將酵母菌 CBY57 篩出的突變株，轉入酵母 菌TKW14C-2 進行產物分析
由於在 OSCW232R的篩選結果是無法存活，而OSCW232A可存活，
且在 1997 年 Matsuda 在 JACS 發表的研究中提到 W232 可能利用其 富含電子特性的殘基(側鏈)[72]，藉由碳陽離子-π 電子效應穩定高能的 環化中間物。所以我想利用此二個突變點去驗証質體交換/反向篩選 的方法是否為一有效可行的策略。故將此九個突變株轉入另一酵母菌 表現系統TKW14C2 菌株進行產物分析。
TKW14C-2 (MATa/α ERG7∆::LEU2 HEM1∆::G418 ade2-101 his3-∆200 Leu2-∆1 lys2-801 trp-∆63)是實驗室所建構的一個酵母菌表 現系統[73]。其不帶有 pZS11 質體，且把原先酵母菌中的 ERG7 基因剔 除掉，所以不具 OSC 活性，無法自行生成麥角固醇，必須額外補充 提供，但發現若只單純剔除ERG7 基因，外界給予麥角固醇補充時，
酵母菌不會自行吸收。參照其他的論文[73]，發現必須將Heme 基因也 一起剔除，酵母菌才可由外界吸收麥角固醇，而 Heme 與甲硫胺酸 (Methionine ; Met)在代謝途徑上有其相關性[74]，因此當 Heme 基因被 剔除，Met 的生合成也會受破壞，故此也要額外補充 Met，因此，把 由CBY57 篩出的突變株，轉入酵母菌 TKW14C-2 做產物分析探討，
同時，利用功能性補充的方法再次確認這些突變株是否喪失 OSC 催 化功能，由功能性補充篩出的結果同於質體交換的結果(表 3-1)。
我們選擇將突變點 OSC 置入 TKW14C-2 進行產物分析，而不轉 入CBY57 中分析，是因為 CBY57 帶有 pZS11 質體，具有正常的 OSC 活性，假若產物分析的表現系統同時含有突變及正常的 OSC 功能，
或許彼此之間會有交互影響，很有可能氧化鯊烯會先被正常 OSC 催 化有初步產物，繼而再被突變 OSC 代謝生成非自然界的產物。為了 避免這種可能的協同作用影響，故要利用一個沒有正常 OSC 功能的 菌株，可以更直接的說明產物是完全由突變效應而造成。
3-3 產物分析與探討
篩選出的含定點突變 OSC 基因的酵母菌 TKW14C-2，以 8 L 的 SD+Ade+Lys+His+Met+Ura+Hemin+Ergosterol 培養液培養五~七天，
之後將菌體離心下來，約每升可得 4 克菌體重。接著用熱迴流(Reflux) 的方式，即利用強鹼高溫打破酵母菌，萃取其中的非皂化脂質，得到 粗萃取物後，藉由TLC 片(薄層層析平板)展佈粗萃取物，用以確認矽 膠管柱液相層析(Silica column liquid chromatography)最適的分離條 件，並且可概略初步獲知突變點的產物分佈情形(圖 3-3)。
W232R Y707A H146A RS314 TkW
14C2 W232A
H234A W587F699A F104T
M532A LA Erg LA WT
圖 3-3 : 篩出的九個突變株轉入 TKW14C2 後，以 TLC 片展佈得到 初步產物分布
我們利用矽膠管柱液相層析將產物純化分離，分成幾個部分收起 後，與正負控制組做比對，在 GC-MS 光譜上可發現 OSCF104T、 OSCH146A、OSCW232R、OSCM532A、OSCW587A、OSCF699A與OSCY707A其 GC-MS 的圖與控制組的圖譜相似，由這個結果而有以下的初步推 論:(1)可能這些位置被改變後，會使環化重組機制完全瓦解，反應受 質在突變酵素中不能摺疊成最適的構形以形成碳陽離子中間物;(2)也 許因為這些胺基酸的特性因突變而被改變，喪失了原本π-電子穩定高 能量中間物，或者影響了開環的起始作用，所以即使反應受質有正確 的折疊，也無法使環化反應開始。(3)這些位置的突變可能影響蛋白 質的構形，使其失去OSC 活性而無產物生成。
但我們在 OSCW232A、OSCH234A這二個突變株產物分析中，除了有
野生型產物羊毛硬脂醇生成之外，還有發現新產物生成。我們利用實 驗室既有的標準品，比對GC 的滯留時間(Retention time)及 MS 的質 荷 比 圖 譜 ， 發 現 OSCW232A 的 產 物 為 Protosta-12,24-dien-3ß-0l 、 Lanosterol(LA) 、Parkeol(PK) ，而 OSCH234A的產物除了前述三者之 外，又多了一個新產物 ( 圖 3-4 )。
圖3-4 : 以 GC-MS 進行產物分析，建構產物圖譜。上圖為 OSCW232A 突變株產物及比例分布，下圖為 OSCH234A突變株產物及比例
故此，其後的實驗將分成二個方向進行，其一為解出 OSCH234A 新產物的結構，建構 OSCH234A 產物圖譜及比例，希望能進一步說明 H234 在環化重組機制所執行的功能。另一方面，OSCW232A有得到除 野生型產物外的新產物，與實驗室另一突變株 OSCH234Y 有相同的突 變產物，但產物比例不同，而 OSCW232R則沒有任何環化產物的生成，
因此，我們想針對W232 這個位置，進行更細部的探討。因而進行了 飽和突變( Saturated mutagenesis )實驗，將 W232 此活性區上胺基酸，
突變成其他十九種胺基酸，再分別對此十九個突變點利用上述方法進 行產物分析，各自建構出產物圖譜與比例，之後滙整在一起並佐以能 量最小化的電腦模擬，更深入地探討W232 此胺基酸殘基在環化重組 上的影響。
解析 OSC
H234A新產物的結構
我們將含 OSCH234A 突變質體的 TKW14C2 以 150 L 的培養液
SD+Ade+Lys+His+Met+Ura+Hemin+Ergosterol 大量培養，以一系列的 離心、熱迴流破菌、非皂化脂質(NSL)萃取、矽膠管柱層析純化、
GC-MS 分析各部分的分離物…等流程，先初步分出 H234A-LA 部分 (fraction)。但利用矽膠管柱層析仍無法將產物個別分離成單一化合 物。參考其他論文的方法，發現銀染的 TLC 片及銀染的矽膠管柱層 析常被用來分離不飽和脂肪酸及三酸甘油酯、酯類…等脂質衍生物。
因此我們嘗試利用與硝酸銀混合的 TLC 片及銀染的矽膠管柱層析將 H234A-LA fraction 進一步分離成單一化合物。對照論文所描述以及 從實驗印証出的結果，發現銀染 TLC 的展佈分離與化合物的不飽和 度(環數與雙鍵數) 、雙鍵位置(環內或環外雙鍵、共軛雙烯或雙烯的
雙鍵位置分開) 具有相關性。飽和脂質無雙鍵，不會與銀螯合形成極 fraction 的產物要先進行乙醯化反應(Acetylation) ，因為這些產物的 碳 3 有-OH 基團，極性大會影響分離效果，所以用乙酸酐(Acetic
乙醯化的 H234A-LA fraction 經銀染矽膠管柱層析分離後，成功
們再將此新產物進行去乙醯化反應(deacetylation) ，使其碳 3 變回-OH 基團，再次以GC-MS 確認是否與未乙醯化反應前相同。從上述我們 可得到純的單一化合物，因此將此新產物送測 NMR，希望能獲得此 新產物進一步的結構資訊。透過1H-NMR、13C-NMR、DEPT、HMQC、
HMBC、TOCSY、H-H COSY 的圖譜，經交叉比對後，解析出新產物 的結構(圖 3-6 ~ 3-11)，並藉由測 1D NOE 確認產物的立體構形。
圖3-6 : GC-MS 確認 H234-unknown acetate 經銀染矽膠管柱層析分離
1H NMR
圖3-7 : H234A-unknown 1HNMR
圖3-8 : H234A-unknown 13CNMR
圖3-10 : H234A-unknown 專一的結構訊息
C17 cation 的反應途徑，而不是經 Chair-Chair-Chair 生成 Dammarenyl cation 的反應途徑:
從 OSCH234A突變株的產物分析，我們可發現其均會生成四環產
從 OSCH234A突變株的產物分析，我們可發現其均會生成四環產