1-1 固醇類及三萜類化合物對生物體的重要性
固醇類的組成通常是四環~六環的固性結構，外有一個 8 個碳的 側鏈，且在 C-3 有一羥基(-OH)者稱之。自然界的固醇類，例如：膽 固醇、麥角固醇、β-麥胚固醇、植物固醇，以及其生合成代謝途徑中 的上游產物與衍生物-三萜類天然物(Triterpenes)，他們的作用機制、
生合成途徑、代謝調節，一直是近幾十年來的重要研究課題。
許多研究指出，這些固醇類及三萜類天然物，在生物體具有重要 的 生 理 功 能 。 自 然 界 固 醇 類 的 生 合 成 ， 是 由 兩 個 碳 的 乙 醯 輔 酶 -A(Acetyl-CoA)開始合成，在幾個步驟的反應縮合後，經速率決定步 驟HMG-CoA 還原酶（HMG-CoA reductase）催化生成 3-甲基-3,5-羥 基戊酸(Mevalonate)，再經一連串的 ATP 水解參與反應，生成異戊二 烯類的中間物(Isoprenoid intermediates)，隨後六個五碳的異戊二烯單 元體經過縮合及還原反應，產生疏水性的鯊烯(Squalene)，從鯊烯開 始，固醇類生合成中間物變為未磷酸化、強疏水性、油脂狀的化合物，
因此在生物體內需細胞外固醇攜帶蛋白(sterol carrier protein)來維持 運送的溶解度。鯊烯再經氧化代謝生成氧化鯊烯，而後經由環化及一 連串反應，合成其最終產物[1]。在不同物種間，會分別利用鯊烯或氧 化鯊烯作為環化起始物。細菌、一些原核生物及低等植物會利用鯊烯 環化生成蛇麻烯(Hopene)，而在高等植物、真菌、動物…等會由氧化 鯊烯進行環化，經一連串反應生成植物固醇(phytosterol)、麥角固醇 (Ergosterol)、膽固醇(圖 1-1)。
過去文獻指出固醇類生合成途徑的中間物參與很多重要的生理 反 應[2]。 如 異 戊 二 烯 類 中 間 物(Isoprenoid intermediates) 是 泛 醌
(Ubiquinone)、多萜醇(Dolicol) 、血基質(Heme)及植物脂質萜類、胡 蘿蔔素(β-carotene)…等數種重要化合物的前驅物。血基質與紅血球的 形 成 、 攜 氧 及 合 成 數 種 血 基 質 蛋 白 質 有 關(如 ： 細 胞 色 素 P450 (cytochrome P450)、電子傳遞鏈上的蛋白複合體…等)。泛醌，亦為輔 酶Q(Coenzyme Q)，廣泛存於大部分的細胞中，參與能量代謝的電子 傳遞，可傳遞電子協助氧化還原反應[1]，目前己被製成健康食品，其 具有抗氧化、強化免疫的功效，可抑制氧化型低密度脂蛋白，預防心 血管疾病。多萜醇與內質網中蛋白質的醣化有關，負責作為 N-醣苷 鍵(N-linked glycosides)的多醣攜帶者。植物固醇(phytosterol)可與食物 中的膽固醇競爭其與膽酸的結合，因此可阻礙膽固醇吸收，降低心血 管疾病的風險，且植物固醇可提高免疫能力，幫助自然殺手細胞(NK cell)運作。鯊烯是一種三萜類化合物，為一種強力的攜氧物質，由於 其結構的特殊性，與水作用可產生 3 個氧，因此主要的功能為細胞活 化及生氧作用，可提高內臟功能，避免細胞缺氧，以及調節膽固醇總 量，預防心血管疾病。此外，在動物體內產生的膽固醇參與體內許多 新陳代謝的重要生理調控，它是細胞膜上重要組成份，調控細胞膜的 流動性，影響胞內外物質的滲透，並且可藉此調控膜上蛋白質或膜結 合酵素，使其有最適活性去進行訊息傳遞、代謝反應與催化作用[3]。 另外，膽固醇也是膽汁、固醇類荷爾蒙、胞內生理代謝調控的重要物 質。膽固醇在體內代謝生成膽汁而幫助脂質及脂溶性維生素的吸收，
它也是體內五種固醇類激素的前驅物：糖皮質固醇(Glucocorticoids；
如：皮質醇 Cortisol)、礦物皮質固醇(Mineralocorticoids；如：醛固酮 Aldosterone) 、 雄 性 激 素 (Androgens) 、 雌 激 素 (Estrogens) 與 黃 體 酮 (Progestins)，透過這些激素，使人體可面對不同的生理壓力，它們可
份、礦物質吸收再利用與排出，使其代謝平衡，並影響男女性徵成熟 與發育。而人體也可利用膽固醇，自行合成脂溶性維生素 D，維生素 D 是一群具有激素樣功能的固醇，繼而影響鈣質吸收，血鈣與骨鈣迴 饋循環平衡，刺激基因表現與骨質的強度[1]。此外，膽固醇也是目前 正被積極研究的Lipid raft(脂質筏)的組成分。Lipid raft 是指細胞膜上 一塊固性區域，當細胞膜上膽固醇比例增加，細胞膜的流動性會減 少，許多研究發現，細胞膜上有一塊區域富含膽固醇，因而較不具流 動性，就像筏在流動性的膜上移動，故此稱為脂質筏[4]。Lipid raft 普 遍存於所有細胞膜上，許多文獻的研究指出，其可能與訊息傳遞、發 炎反應、細胞移動(Migration)、神經傳導…等反應有關，如：阿茲海 默症(Alzheimer，s disease)[5]，目前很多文獻在探討阿茲海默症與Lipid raft 的相關性，實驗証實當 Lipid raft 被破壞或組成改變，β-amyloid (β-類澱粉樣蛋白)在腦中的的含量會減少，阿茲海默症的成因就是因為 這種蛋白不正常的沈積在腦中而造成的，目前許多研究都傾向此疾病 是某些物質透過 Lipid raft 引發訊息傳遞，繼而造成此種絲狀病變蛋 白形成的假說[4, 6]。而膽固醇則是Lipid raft 的主要組成份，因此，針 對固醇類的研究更是日益重要[5]。此外，在酵母菌的實驗也發現，部 份具特定結構的固醇類，以及其相應的激素，對於細胞分裂增生週期 的調控，有密切的相關性。因此，固醇類及三萜類天然物在酵母菌、
動、植物細胞一直被廣泛的注意著[7, 8]。
固醇類在生命體具有一自然的迴饋調節機制，使體內的固醇含量 達一恆定，假若此調節機制失效，又或人體長期攝食高膽固醇飲食，
會使得血液中膽固醇含量升高，而人體血液裡主要負責膽固醇運輸的 脂蛋白-LDL(Low density lipoproteins；低密度脂蛋白)也會相應增加，
此時若人體受到自由基攻擊，又或處於高氧化壓力之下，血液循環中
的 LDL 會被修飾化，也就是進行乙醯化作用或 LDL apo B (LDL apolipoprotein B，低密度脂蛋白表面脂蛋白 B)被氧化形成 ox-LDL(氧 化型低密度脂蛋白)，此時會被循環中的巨噬細胞(Macrophages)所帶 有的清道夫受器(Scavenger receptor)所辨識而引發內噬作用，移入血 管內皮的巨噬細胞攝取了這些修飾型的 LDL，而這些修飾型的 LDL 並無法參與細胞內膽固醇正常代謝的迴饋調節機制，因而他們所攜帶 的膽固醇會過量聚積在巨噬細胞內，造成巨噬細胞轉形變成泡沫細胞 (foam cell)，泡沫細胞在內皮細胞的沈積釋出生長因子，刺激平滑肌 的分化及血管壁上鈣化斑痕的形成，使得血管變狹窄阻塞、彈性變 差，有粥狀斑塊出現，因而造成了高血壓、心臟病、動脈粥狀硬化、
中風…等心血管疾病的發生。而在黴菌當中，其終產物麥角固醇 (Ergosterol)為黴菌胞膜上的重要組成，也是不可或缺的存活因子，因 此，目前許多先進的分子生物技術已被大量用來研究生命體中固醇類 及三萜類天然物的重要性，了解其代謝上的反應途徑，而能用以發展 抗黴菌及降膽固醇的藥物[9, 10]。因為心血管疾病為國人十大死因之 一，也是許多已開發國家的主要致死因素。另一方面，由於院內感染、
癌症治療、器官移植或其他治療，導致免疫力降低引發的黴菌感染日 益嚴重，故此，抗黴菌及降膽固醇的藥物的研究一直被持續進行著[11]。
近年來，固醇類生合成代謝途徑中的環化酵素--氧化鯊烯環化酵 素(Oxidosqualene Cyclase)，已逐漸成為抗黴菌及降膽固醇的藥物研發 標的。先前所發展的藥物及相關研究的抑制劑，多針對固醇類生合成 途徑的限速步驟酵素 HMG-CoA Reductase 做抑制，但此方式會影響 其下游的異戊二烯中間物與三萜類化合物的生成，繼而影響具重要生 理功能的二次代謝物的形成與調節，如：泛醌、多萜醇…等。所以，
受抑制所引起的副作用[11]。此外，由於此環化酵素的環化反應，涉及
Dolichol Isopentenyl tRNA
Isoprenoid intermediate Ubiquinone Heme A
Squalene-Hopene cyclase
Hopene Squalene
Bacteria
Phytosterol Ergosterol Cholesterol
圖 1-1: 固醇類生合成途徑
1-2 三萜類環化酵素家族的簡介
近半世紀以來，三萜類環化酵素家族所催化鯊烯(Squalene)或氧 化鯊烯((3S)-2,3-oxidosqualene)環化形成多環多烯類(terpenes)的催化 機制，一直是分子生物家及化學家認為最迷人及最具挑戰性的生化轉 化反應之一。三萜類化合物(Triterpenoid)是一群由三十個碳前驅物衍 生而來的多烯類產物，目前，由天然來源、酵素立體結構相關的環化 作用轉化而來的有近200 個不同多烯類骨架的三萜類化合物[12]。這些 具多烯類骨架的三萜類化合物，是由自然界三萜類環化酵素家族，經 單一步驟酵素催化反應，藉酵素與受質間的鏡像或立體選擇性環化及 骨架重排，生成了如此多樣的產物，而這些產物泛存於自然界的各物 種中形成產物多樣性。
在不同物種間依其所使用之酵素，將直鏈多烯類的鯊烯或環氧化 物的氧化鯊烯以單一生物轉化過程，催化多個不對稱立體中心的環化 及 1,2-氫化基(hydride)、甲基轉移，而獲得不同結構的多環脂醇或三 萜類化合物[13]。整個環化過程包括雙鍵或 Epoxide(環氧物)質子化 (Protonation)以活化誘導開環、環化(Cyclization)、甲基與氫鍵之重組 (Rearrangement) 、 脫 除 (Elimination) 之 終 止 反 應 。 這 些 同 源 性 (Homologous)的三萜類環化酵素，可將直鏈狀的鯊烯或氧化鯊烯(OS) 轉化成多樣產物，且在蛋白質序列上有相似的胺基酸保留區域位置。
這些物種催化生成的物種專一性產物(圖 1-2)，依反應的產物骨 架的複雜性區分，有6-6-6-5 四環、6-6-6-6-5 五環、6-6-6-6-6 五環及 單環、雙環、三環與六環的三萜類化合物[12]。例如在動物、真菌、甲 基營生菌(methylotrophic bacterium) ，氧化鯊烯會藉氧化鯊烯-羊毛硬 脂 醇 環 化 酵 素(Oxidosqualene-Lanosterol Cyclase;OSC) 催 化 生 成
中，氧化鯊烯可被環阿屯醇合成酵素(Cycloartenol Synthase；CAS) 環 化生成 6-6-6-5 四環的環阿屯醇(cycloartenol)，或是藉羽扇醇合成酵 素(Lupeol Synthase；LUS ) 合成 6-6-6-6-5 五環的羽扇醇(Lupeol)，或 是藉香桂素合成酵素(Amyrin Synthase；AMS) 生成 6-6-6-6-6 五環的 α- 香桂素(α-Amyrin) 或 ß-香桂素(ß-Amyrin)，又或藉其他環化酵素 環化形成四環~六環的產物。而在較低等的植物、部分原蟲類(Protozoa) 及細菌中,藉由鯊烯-蛇麻烯環化酵素(Squalene - Hopene Cyclase；SHC) 將直鏈的鯊烯環化生成6-6-6-6-5 五環的蛇麻烯(Hopene)， 或藉其他 環化酵素反應生成蛇麻醇(Hopanol) 和里白醇(diplopterol) 等環狀產 物。另外在 Achillea odorata 及 Camellia sasanqua 之中，雖然無法獲 得Achilleol synthase 及 Camelliol synthase 的選殖株，但仍可從其中分 離出單環的Achilleol A 及 Camelliol C[14](圖 1-3)。
Animals and Fungi higher plants
higher plants higher plants higher plants Bacterial
β
圖 1-2 : 環化酵素家族在不同物種間的產物專一性
這些三萜類環化酵素家族催化生成的產物多樣性，開始是藉環化 酵素中所含殘基(Residue)，使得親核性的雙鍵或 Epoxide 藉親電性作 用 進 行 開 環 起 始 反 應 ， 經 一 連 串 的 碳 陽 離 子- 烯 烴 環 化 作 用 (cation-olefin cyclization)生成高能帶正電的碳陽離子中間物(cation
這些三萜類環化酵素家族催化生成的產物多樣性，開始是藉環化 酵素中所含殘基(Residue)，使得親核性的雙鍵或 Epoxide 藉親電性作 用 進 行 開 環 起 始 反 應 ， 經 一 連 串 的 碳 陽 離 子- 烯 烴 環 化 作 用 (cation-olefin cyclization)生成高能帶正電的碳陽離子中間物(cation