圖表 - 探討白細胞介素 IL-32 於 EB 病毒感染 B 細胞中之調控機制及細胞功能

圖一、LMP1 之結構及其下游訊息傳遞路徑

LMP1 蛋白質結構包含位於細胞質內的 N 端區域、6 段疏水性胺基酸所組成的穿膜區域及一長片段位於細胞質內的 C 端區域 (C-terminal domain)。C 端區域主要包含三個活化區域(C-terminal activating region)，縮寫分別為 CTAR1、CTAR2 及 CTAR3，主要功能為活化下游訊息傳遞路徑及誘發轉錄因子的活化。CTAR1 可活化 PI3K/Akt 訊息傳導路徑及 MAPK/p38 訊息傳導路徑，CTAR2 能活化 JNK 訊息傳導路徑，其中 CTAR1 及 CTAR2 皆可活化 NFκB 訊息傳遞路徑及 MAPK/Erk 訊息傳遞路徑，CTAR3 可透過 JAK3 活化轉錄因子 STAT。LMP1 活化不同的訊息傳導路徑，接著調控下游基因之表現，進而調控各種細胞生理功能圖片修改自(Capello and Gaidano, 2009; Young and Rickinson, 2004) 。

圖二、IL-32 之六種剪接變異體

IL-32 基因位於人類第 16 號染色體 p arm 13.3 位置，由 IL-32 之 DNA 所轉錄出的前 mRNA (pre-mRNA)含有 8 個外顯子 (exon)片段，命名為 E1~E8，可做變異性剪接 (alternative splicing) 利用不同外顯子片段轉錄出不同剪接變異體 (splice variant)，分別為 IL-32α、β、γ、δ、ε及ζ 。圖中 ATG 為轉譯起始位，TGA 為位在 E8 外顯子片段上的轉譯停止位。(Shoda et al., 2007)

圖三、IL-32 在發炎反應的正向回饋作用

發炎相關的細胞激素，如 TNFα，能誘發 IL-32 表現，推測可能的機制為活化發炎反應的 NFκB 訊息傳導路徑。接著 IL-32 可能再透過 NF-κB 的訊息傳遞路徑活化更多細胞激素的產生，或是誘發許多和細胞黏附有關的因子，使白血球等免疫細胞能聚集在發炎的血管內皮，進而造成發炎反應的增強，並使整個訊息傳遞路徑形成正向回饋。(Kobayashi et al., 2010)

圖四、探查 IL-32 mRNA 及蛋白質在 EB 病毒感染 CD19⁺ B 細胞各不同時間點 時的表現情形

自捐血中心取得白血球濃厚液以 CD19⁺ 磁珠純化出 B 細胞。取 1 ml 含 1x10⁶細胞置於 12 孔盤中，取 40 µl B95.8 strain EB 病毒感染後收取 1、2、3、7、14、

21、28 天之細胞，並收取各天數之 RNA 及蛋白質， (A) 以 RT-qPCR 分析 IL-32 mRNA 表現變化，以 β-actin 數據為內控制組，並將 primary B0 所得之相對訊號設為 1 作基準進行量化，得到 IL-32 RNA 表現讀值的相對倍數。(B) 以西方墨點法分析細胞內 IL-32 表現情況，同時偵測 p-IκB 表現探查 NFκB 細胞訊號的變化，偵測 EBNA1、LMP1、EA-D、Zta 及 Rta 用以探測各 EB 病毒蛋白的變化。

西方墨點法由β-actin 為內控制組。

A B

圖五、以西方墨點法探查 EB 病毒轉型 CD19⁺ B 細胞後 28 天 IL-32 表現情況 自捐血中心取得四位健康捐血者之白血球濃厚液以 CD19⁺ 磁珠純化出 B 細胞，

四位捐血者分別以 A、B、C 及 D 代表之，轉型成的 LCL 依序為 LCL-54、LCL-55、

LCL-48 及 LCL-49。純化出之 B 細胞取 1 ml 含 1x10⁶細胞置於 12 孔盤中，取 40 µl B95.8 strain EB 病毒感染 28 天形成 LCL 後收取蛋白質，以西方墨點法偵測 IL-32、EBNA1、LMP1 及β-actin 的表現情形，β-actin 為內控制組。

圖六、以西方墨點法探察 IL-32 在 LCL 中細胞核質分佈的情形

從兩株 LCL 中 (LCL-22 及 LCL-45) 收取 1x10⁷顆細胞，以細胞核質分離萃取出細胞核及細胞質的樣本，以西方墨點法偵測 PARP、α-tubulin 及 IL-32 的表現。

PARP 為細胞核樣本的內控制組，α-tubulin 為細胞質樣本的內控制組。

圖七、以西方墨點法探查 EB 病毒潛伏膜蛋白 LMP1 在不同表現量下對 IL-32 的 影響

取 1 ml 含 1x10⁶顆 Akata 細胞置於六孔盤中，將包裹 pSIN 或 pSIN-LMP1 質體的慢病毒以 MOI = 0.0625、0.125、0.25、0.5 感染 Akata 細胞，轉導 EB 病毒基因 LMP1，5 天後收取蛋白質，以西方墨點法偵測 IL-32、LMP1 及β-actin 的表現。

β-actin 為內控制組。

圖八、以西方墨點法探察 IL-32 在轉導 EB 病毒潛伏膜蛋白 LMP1 shRNA 的 LCL 中表現情況

從 LCL-22 及 LCL-45 中取 1 ml 含 1x10⁶顆細胞置於六孔盤中，將包裹 pLKO-shLuc 或 pLKO-shLMP1 質體的慢病毒以 MOI=4 的數量感染 LCL-22 及 LCL-45，轉導 EB 病毒 LMP1 shRNA，5 天後收取蛋白質，以西方墨點法偵測 IL-32、

LMP1 及β-actin 的表現。β-actin 為內控制組。

圖九、以 RT-qPCR 探查 IL-32 RNA 在 CD19⁺ B 細胞以不同的活化物刺激後的 表現情況

(A)自捐血中心取得白血球濃厚液以 CD19⁺ 磁珠純化出 B 細胞，取 1 ml 含 1x10⁶ 細胞置於 12 孔盤中，加入不同活化物 (B95.8 strain EB 病毒: 40 µl；αCD40 : 1 µg/ml；IL4 : 10 ng/ml；LPS : 200 ng/ml；Poly I:C : 20 µg/ml) 並收取 1、2 及 3 天的細胞 RNA。qPCR 以 β-actin 數據為內控制組，並將 primary B0 所得之相對訊號設為 1 作基準進行量化，得到 IL-32 RNA 表現讀值的相對倍數。(B)取 1 ml 含 1x10⁶顆 Akata 細胞置於六孔盤中，並加入 αCD40 (1 µg/ml)及 IL4 (10 ng/ml) 刺激物，未加刺激物的組別補等體積之 PBS 視為負控制組，在刺激物作用後 48 小時及 72 小時收取細胞蛋白質樣本，以西方墨點法偵測 IL-32 及 GAPDH 的表現，GAPDH 為正控制組。

圖十、以西方墨點法探查 LMP1 活化 IL-32 的主要蛋白區域

取 1 ml 含 1x10⁶顆 Akata 細胞置於六孔盤中，將包裹 pSIN、pSIN-LMP1、

pSIN-LMP1dCTAR1、pSIN-LMP1dCTAR2 及 pSIN-LMP1dCTAR1/2 質體的慢病毒以 MOI=2 的數量感染 Akata 細胞，轉導 EB 病毒基因 LMP1 野生型、刪除 CTAR1、

刪除 CTAR2 及刪除 CTAR1/2 到 Akata 細胞，5 天後收取蛋白質。以西方墨點法偵測 IL-32、LMP1、LMP1-dCTAR1、LMP1-dCTAR2、LMP1-dCTAR1/2、p-IκB、

t-IκB 及β-actin 的表現。β-actin 為內控制組。(西方墨點法蛋白質樣本由本實驗室 周雅菁學姐提供)

圖十一、以抑制劑探查 LMP1 活化 IL-32 的細胞訊號傳導路徑

取 1 ml 含 1x10⁶顆 Akata 細胞置於六孔盤中，將包裹 pSIN 或 pSIN-LMP1 質體的慢病毒以 MOI=1 的數量感染 Akata 細胞，轉導 EB 病毒基因 LMP1，5 天後加入(A) IκB 抑制劑 Bay11-7082 (5 µM)、(B) MEK 抑制劑 U0126 (25µM)及(C) JNK 抑制劑 Sp600125 (25µM)，2 天後收取蛋白質，以西方墨點法偵測 IL-32、LMP1、

p-JNK、t-JNK、p-Erk、t-Erk、p-IκB、t-IκB 及β-actin 的表現。β-actin 為內控制組。

A B

圖十二、以螢光酵素報導分析法探查 LMP1 對 IL-32 啟動子活化的影響

(A) IL-32 啟動子報導基因示意圖，以 PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/) 軟體預測 IL-32 啟動子序列-548 至+495 之間可能相關的轉錄因子，其中包括 c-Jun、c-Fos、

CREB、NFκB、Sp1 及 AP-1 轉錄因子的結合位。(B)取 1 ml 含 1x10⁵顆 HEK 293T 細胞置於 12 孔盤中，以 T-Pro NTRII 同時轉染 0.25 µg pSG5 或 pSG5-LMP1 質體、

0.5 µg 報導質體，轉導 EB 病毒基因 LMP1，包括 IL-32 啟動子及其不同刪除片段、突變的 NF-κB 結合位及 0.05 µg pEGFP-C1 做為內控制組，以三重複進行實驗並比對誤差，轉染 3 天後收取細胞進行螢光酵素報導基因分析。各組冷光讀值以 GFP 讀值較正後，以 pGL2-basic 組別為 1 作為基準得到螢光酵素活性的相對 倍數。

圖十三、以螢光酵素報導分析法探查 Rta 對 IL-32 啟動子活化的影響

取 1 ml 含 1x10⁵顆 HEK 293T 細胞置於 12 孔盤中，以 T-Pro NTRII 同時轉染 0.25 µg pSG5 或 pSG5-Rta 質體、0.5 µg 報導質體，轉導 EB 病毒基因 Rta，包括 IL-32 啟動子及其不同刪除片段、突變的 NF-κB 結合位和 CRE 結合位及 0.05 µg pEGFP-C1 做為內控制組，以三重複進行實驗並比對誤差，轉染 3 天後收取細胞進行螢光酵素報導基因分析。各組冷光讀值以 GFP 讀值較正後，以 pGL2-basic 組別為 1 作為基準得到螢光酵素活性的相對倍數。

圖十四、以染色質免疫沉澱法分析 p65 轉錄因子結合在 IL-32 啟動子之情形 取 10 ml 含 5x10⁶顆 Akata 細胞置於 25T Flask 中，將包裹 pSIN 或 pSIN-LMP1 質體的慢病毒以 MOI=1 的數量感染 Akata 細胞，轉導 EB 病毒基因 LMP1，5 天後收取蛋白質並以超音波震盪打破細胞核及震斷 DNA，接著收取細胞核萃取樣本。(A) 取 100 µg 細胞核萃取樣本以 1 µg NF-κB p65 抗體或 1 µg rabbit IgG (rIg) 進行免疫沉澱，之後以 Chloroform 萃取 DNA，再以 PCR 偵測 IL-32 啟動子基因片段-85/+98 和對照組 GAPDH 啟動子片段-93/+64。實驗中取 0.1% 核萃取樣本為正控制組 (input control)。(B) 以西方墨點法偵測 LMP1 和 IL-32 的表現。β-actin 為內控制組。

B A

圖十五、以西方墨點法探察外送 NF-κB p65 對 IL-32 表現之影響

(A) 取 1 ml 含 1x10⁶顆 Akata 細胞置於六孔盤中，將包裹 pSIN 或 pSIN-p65 質體的慢病毒以 MOI=1 的數量感染 Akata 細胞，轉染轉錄因子 p65，5 天後收取蛋白質，(B) 取 1 ml 含 2x10⁵顆 HEK 293T 細胞置於六孔盤中，將 0.5 µg 的 pCDNA 3 或 pCDNA 3-HA-p65 質體以 T-Pro NTRII 進行轉染，轉導轉錄因子 p65，3 天後收取蛋白質。以西方墨點法分析 p65、IL-32 及β-actin 的表現。β-actin 為內控制組

B A

圖十六、以西方墨點法探察轉導 p65 shRNA 對 LMP1 誘導之 IL-32 的影響 取 1 ml 含 1x10⁶顆 Akata 細胞置於六孔盤中，同時感染包裹 pLKO-shLuc 或 pLKO-shRelA 質體的慢病毒(MOI=4)及包裹 pSIN 或 pSIN-LMP1 質體慢病毒感染 (MOI=1)Akata 細胞，轉染 EB 病毒基因 LMP1 及轉錄因子 p65 shRNA，5 天後收取蛋白質，以西方墨點法偵測 IL-32、LMP1、RelA (p65)及β-actin 的表現。β-actin 為內控制組。

圖十七、以西方墨點法探察 IL-32 在抑制轉錄因子 p65 的 LCL 中表現影響 從三株 LCL (A) LCL-13 (B) LCL-33 (C) LCL-34 取 1 ml 含 1x10⁶顆細胞置於六孔盤中，，將包裹 pLKO-shLuc 或 pLKO-shRelA 質體的慢病毒以 MOI = 4 的數量感染 LCL-13、LCL-33 及 LCL-34，轉導轉錄因子 p65 shRNA，5 天後收取蛋白質，以西方墨點法偵測 IL-32、LMP1、RelA (p65)及β-actin 的表現。β-actin 為內 控制組。

B A

圖十八、探察抑制 IL-32 對 LCL 中 EB 病毒溶裂期基因表現之影響

從三株不同 LCL(A) LCL-51 (B) LCL-52 (C) LCL-53 取 1 ml 含 1x10⁶ 顆細胞置於六孔盤中，將包裹 pLKO-shLuc 或 pLKO-shIL32 質體的慢病毒以 MOI=4 的數量感染 LCL-51、LCL-52 及 LCL-53，轉染 IL-32 shRNA，5 天後收取蛋白質，以西方墨點法偵測 IL-32、Zta、BGLF4、BMRF1 及β-actin 的表現。β-actin 為內控制組。

C A B

圖十九、以螢光酵素報導基因分析 IL-32 抑制 Zta 啟動子的情況

(A)Zta 啟動子片段示意圖，轉錄因子 Sp1/Sp3 及 MEF2D 可結合在 ZID 上，C/EBP 可結合在 ZII 及 ZIIIB 上，ATFs 及 CREB 可結合在 ZII 上，而 Zta 能結合在 ZIIIA 及 ZIIIB 上。Zta 啟動子片段示意圖來自本實驗室蔡佩芳學姐碩士論文圖七 (B)取 1 ml 含 1x10⁵顆 HEK 293T 細胞置於 12 孔盤中，以 T-Pro NTRII 同時轉染 0.25 µg 的 pSG5 或 pSG5-Zta 及 0.4 µg pCDH 或 0.1、0.2、0.4 µg 不同數量的 pCDH-IL32 (不足 0.4 µg 組別補 pCDH 至 0.4 µg) 和 0.5 µg 報導質體 pGL2-basic 或 pGL2-Zp，轉染 3 天後收取細胞進行螢光酵素報導基因分析。各組冷光讀值以 GFP 讀值較正後，以 pSG5-pCDH 組別為 1 作為基準得到螢光酵素活性的相對倍數。

B A

圖二十、以螢光酵素報導基因分析 IL-32 抑制 Rta 啟動子的情況

取 1 ml 含 1x10⁵顆 HEK 293T 細胞置於 12 孔盤中，以 T-Pro NTRII 同時轉染 0.25 µg 的 pSG5 或 pSG5-Rta 及 0.4 µg pCDH 或 0.1、0.2、0.4 µg 不同數量的 pCDH-IL32 (不足 0.4 µg 組別補 pCDH 至 0.4 µg) 和 0.5 µg 報導質體 pGL2-basic 或 pGL2-Rp，轉導 3 天後收取細胞進行螢光酵素報導基因分析。各組冷光讀值以 GFP 讀值較正後，以 pSG5-pCDH 組別為 1 作為基準得到螢光酵素活性的相對 倍數。

圖二十一、探察加入 Zp 活化物後 IL-32 抑制 Zp 的情況

取 1 ml 含 1x10⁵顆 HEK 293T 細胞置於 12 孔盤中，以 T-Pro NTRII 同時轉染 0.25 µg pSG5 或 pSG5-Zta 及 0.4 µg pCDH 或 pCDH-IL32 和 0.5 µg 報導質體 pGL2-Zp，

隔天加入 DMSO 或 TSA (125 µM)，轉導 2 天後收取細胞進行螢光酵素報導基因分析。各組冷光讀值以 GFP 讀值較正後，以 pSG5-pCDH 組別為 1 作為基準得到 螢光酵素活性的相對倍數。

在文檔中探討白細胞介素 IL-32 於 EB 病毒感染 B 細胞中之調控機制及細胞功能 (頁 55-0)