序論 - 探討白細胞介素 IL-32 於 EB 病毒感染 B 細胞中之調控機制及細胞功能

1.1 EB 病毒發現史

EB 最早於 1958 年由英國外科醫生 Denis Burkitt 在非洲小孩身上發現一種惡性淋巴瘤，並且提出此淋巴瘤可能為病毒所引發的假說，因此將此惡性腫瘤命名為 Burkitt’s lymphoma (Burkitt and O'Conor, 1961)。而後於 1964 年，英國的病理學家 Michael Anthony Epstein 及 Yvonne Barr 等人從腫瘤檢體中成功培養出淋巴瘤細胞株，並以電子顯微鏡發現到細胞株具有類似疱疹病毒的顆粒 (Epstein et al., 1964)。隨後 Henle 等人進一步利用血清學抗體反應等實驗方法，發現此 Burkitt’s 淋巴瘤中的病毒和其他已知的疱疹並不同 (Henle and Henle, 1966)，說明 Burkitt’s 淋巴瘤中含有一種新的疱疹病毒，將其命名為 EB 病毒，Epstein-Barr Virus。

1.2 EB 病毒的分類、組成結構及基因體

EB 病毒分類屬於疱疹病毒科 (herpesviridae) 中γ 疱疹病毒亞科 (γ-herpesvirinae) 的一員，也被稱為人類第四型疱疹病毒 (human herpesvirus 4, HHV-4) (Fields et al., 2007)。

EB 病毒顆粒最外層結構是來自宿主細胞的套膜 (outer envelope)，套膜上則嵌有病毒產生的醣蛋白 (glycoproteins) ，位於病毒蛋白質外殼以及套膜中間的間質為蛋白質被膜 (tegument proteins)(Dolyniuk et al., 1976)，病毒的蛋白質核外殼 (nucleocapsid) 是由 162 個次蛋白質衣 (capsomers) 所形成的二十面體結構。

蛋白質核外殼內包裹 EB 病毒全長約 172 kb 的雙股線性 DNA 基因體，基因體的兩端為約 0.5 kb 的末端重複序列 (terminal repeats, TRs)，內部含有約 3 kb 的重複序列 (internal repeats, IRs) 及可轉譯出超過 85 個基因產物的獨特序列 (unique sequence, US) (Dambaugh and Kieff, 1982; Given et al., 1979)。1980 年為了 對基因研究的通用性，Dambaugh 等人以 BamHI 限制酶切割 B95.8 病毒株的基因 體，並完成此病毒株的限制酶圖譜，以 BamHI 限制酶切割後 DNA 片段長短以英

文字母順序排列 (A 至 Z) (Dambaugh et al., 1980)，並根據基因的轉錄方向及其位 mononucleosis, IM)、移植後淋巴組織增生症 (post-transplant lymphoproliferative disease, PTLD)、愛滋病相關的口腔髮狀白斑症 (oral hairy leukoplakia, OHL)、柏金氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma, BL)及霍杰金氏症(Hodgkin disease, HD)(Geser et al., 1982; Greenspan and Greenspan, 1989; Henle and Henle, 1966; Hjalgrim and Engels, 2008; Mueller et al., 1989; Nalesnik, 1998; Niederman et al., 1968;

Niedobitek et al., 1989; Purtilo, 1987)，除了淋巴性疾病之外，EB 病毒也被認為和鼻咽癌 (Nasopharyngeal carcinoma, NPC)有高度相關性 (Wolf et al., 1975)，另外近年研究指出在胃腺癌 (gastric adenocarcinoma)和乳癌 (breast cancer)病人檢體中曾經檢驗出 EB 病毒的基因體，是可能引發胃癌的感染性病原之一。其和乳癌之關係則尚待進一步探查 (Fukayama et al., 1994; Labrecque et al., 1995; Shibata and Weiss, 1992)。

1.4 EB 病毒生活史

EB 病毒具有感染宿主 B 細胞的能力，以病毒表面的醣蛋白 gp350/220 與 B 細胞表面之 CD21 受體 (CD21 receptor) 結合 (Hutt-Fletcher et al., 1983; Micklem et al., 1985; Yefenof et al., 1976)，另外再以病毒外套膜上的 gp42 扮演輔助受體 (co-receptor) 和宿主的 MHC class II 結合後進入 B 細胞 (Nemerow et al., 1987)。

在人體中根據 Thorley-Lawson 等人的理論，EB 病毒藉可由唾液感染上皮細胞後

進入扁桃體，即可感染休眠期 B 細胞 (resting B cell)(Thorley-Lawson and Allday, 2008; Thorley-Lawson and Gross, 2004)。EB 病毒感染 B 細胞後可以分為潛伏期以及溶裂期兩種生活週期。

EB 病毒之潛伏期 (Latent stage)

EB 病毒在潛伏期主要表現十一種病毒基因，六種分布於宿主細胞核內的核蛋白 (EBV nuclear antigen proteins, EBNAs) 、三種位在宿主細胞膜上的膜蛋白 (Latent membrane proteins, LMP1, LMP2A, LMP2B)以及病毒所轉錄之核醣核酸 (RNA) (EBV-encoded RNAs, EBERs 及 BamHI A right-ward transcripts, BARTs)。依照不同 EB 病毒基因表現的模式，將潛伏期分為四型 (Thorley-Lawson and Gross,

主要表現 EBERs、BARTs 及 EBNA1，EB 病毒相關之柏金氏淋巴瘤屬於此型。

(2) 潛伏期第二型 (Latency II) :

主要表現 EBERs、BARTs 及 EBNA1、LMP1、LMP2，EB 病毒相關之鼻咽癌及霍杰金氏症屬於此型。

(3) 潛伏期第三型 (Latency III) :

所有潛伏期病毒基因均會表現，淋巴球增多症 (Lymphoproliferative disease)、

移植後淋巴增生疾病 PTLD、感染性單核球增多症細胞及活體外感染 B 細胞使之不朽化成的淋巴母芽細胞株 (lymphoblastoid cell line, LCL) 中之 EB 病毒屬於此型。

EB 病毒之溶裂期 (Lytic stage)

在潛伏期的 EB 病毒可能因為環境的壓力，自發性的進入溶裂期。亦可能於培養基中加入化學藥劑佛波酯 (phorbol esters, TPA)、Sodium butyrate、抗免疫球蛋白抗體 (anti-immunoglobulin antibody, IgG) 或轉染 EB 病毒轉錄活化因子 Zta 或 Rta 均能使 EB 病毒再活化而進入溶裂期 (Countryman and Miller, 1985;

Hardwick et al., 1988; Luka et al., 1979; zur Hausen et al., 1978)。溶裂期表現之基因依表現時序可分為三類。第一類為極早期基因 (immediately early gene) : EB 病毒進入溶裂期最先表現的基因為 BZLF1 及 BRLF1，其基因產物分別為 Zta 及 Rta 是重要的轉活化因子 (transactivator)，可與 EB 病毒基因上的 ZRE (Zta response element) 或 RRE (Rta response element) 結合，單獨或協同活化更多溶裂期基因表現(Chevallier-Greco et al., 1986; Countryman and Miller, 1985; Fixman et al., 1992)。第二類為早期基因 (early gene) : 早期基因所表現的蛋白質大多參與病毒膜醣蛋白 (membrane antigens, MA)(Hummel and Kieff, 1982; Tsurumi et al., 2005;

Vroman et al., 1985)。

EB病毒在體外 (in vitro) 能將B細胞轉型 (transformation) 為具有不斷增生能力的淋巴芽母細胞株 LCL，此一體外轉型的模式是於1973年Miller等人以周邊血液單核球細胞 (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) 加入B95.8 EB病毒，感染其中的休眠期B細胞 (resting B-lymphocyte) 建立而成的 (Miller and Lipman, 1973)。LCL相較於未受EB病毒感染的休眠B細胞型態上具有明顯的變化，如表面有不規則的突起 (protrusion)、細胞明顯較大及體外靜置培養下會有聚集球狀 (clump topology) 的現象 (Fields et al., 2007)，除了型態上的變化，LCL也表現許多B細胞的活化標誌，如CD23、CD40、CD44及細胞附著分子ICAM-1和LFA-1 等(Calender et al., 1987; Davies et al., 2010; Halder et al., 2009; Peng and Lundgren, 1992)。潛伏在LCL中的EB病毒表現的是EB病毒潛伏期第三型基因，其會使細胞具有不朽化及不斷增生的能力，近年來的研究發現EB病毒具有抑制細胞凋亡的能力，例如LMP2A可利用PI3K的訊息傳遞路徑活化抑制凋亡 (anti-apoptosis) 的蛋白質Bcl-xL (Portis and Longnecker, 2004)，另外許多潛伏期基因，如EBNA1、

EBNA2、EBNA3A、EBNA3C和LMP1也指出對EB病毒不朽化B細胞是重要的 (Cahir McFarland et al., 1999; Cohen et al., 1989; Hammerschmidt and Sugden, 1989;

Lee et al., 1999; Mannick et al., 1995; Tomkinson et al., 1993; Wang et al., 1985) 1.6 EB 病毒感染後誘發之細胞激素 (cytokine)

過去研究已指出許多 EB 病毒蛋白能活化不同的細胞激素，這些細胞激素大多被認為對 B 細胞的不朽化及增生是重要的。例如 EB 病毒潛伏膜蛋白 (LMP1) 能透過活化下游 NFκB 訊息傳遞路徑及 AP-1 轉錄因子，進一步活化 IL-1β、IL-6、

IL-8 及 IL-10 (Eliopoulos et al., 1999; Huang et al., 2010; Nakagomi et al., 1994)等細胞激素的表現，EBNA2 可與轉錄因子RBP-Jκ 結合 (Hsieh and Hayward, 1995)，

進一步促進 IFN-α/β的產生 (Kanda et al., 1999)，其他能與 DNA 結合的 EB 病毒蛋白如 Zta 及 Rta，過去也被報導能增加 IL-6、IL-8 和 IL-10 (Jones et al., 2007;

Mahot et al., 2003) 的表現，顯示當 EB 病毒進入溶裂期能誘發更多的細胞激素，

另外本實驗室過去研究指出 Zta 可以直接結合在 IL-13 基因的啟動子 AP-1 結合

位，進一步誘導 IL-13 的表現 (Tsai et al., 2009)，研究中也指出 IL-13 對 B 細胞的增生是重要的，顯示 EB 病毒利用其蛋白能調控宿主細胞之細胞激素的表現，

進而影響宿主細胞的增生。

1.7 EB 病毒潛伏膜蛋白(latent membrane protein 1, LMP1)之生理功能

EB 病毒之 LMP1 蛋白，結構可分為位於細胞質內的 N 端區域、六段由疏水性胺基酸所組成的穿膜區域 (transmembrane domain)及一長片段位於宿主細胞質內的 C 端區域 (C-terminal domain) 等三個部分。N 端區域位在宿主細胞質內，

功能為幫助 LMP1 導向及穩定嵌至宿主細胞膜上，由疏水性胺基酸所組成的六個穿膜區域，結構上能幫助 LMP1 嵌在宿主細胞膜上，C 端區域主要包含三個活化區域 (C-terminal activating region)，縮寫分別為 CTAR1、CTAR2 及 CTAR3，主要功能為活化下游訊息傳遞路徑及誘發轉錄因子的活化，如 MAPK 訊息傳遞路徑或 NFkB 訊息傳遞路徑。藉此 LMP1 能經由活化不同的訊息傳導路徑，接著調控下游基因之表現，進而調控細胞各種生理功能 (Dawson et al., 2012; Huen et al., 1995; Li and Chang, 2003; Young and Rickinson, 2004)(圖一)。

LMP1 的構造和 CD40 類似，所以活化的下游訊息傳遞路徑也類似 (Kilger et al., 1998)，CD40 為一腫瘤壞死因子受體 (tumor necrosis factor receptor, TNFR) 的其中一員，下游以腫瘤壞死因子受體相關因子 (TNFR associated factors, TRAFs) 傳遞細胞訊號，LMP1 則可直接利用 TRAF1、TRAF2、TRAF3 及 TRAF6，以及腫瘤壞死因子受體相關致死區域蛋白 (TNFR associated death domain protein, TRADD) 活化下游訊息傳遞路徑(Devergne et al., 1998)。有別於 CD40 受體，

LMP1 不需要任何受質 (ligand)即可自發性的活化下游相似的訊息傳遞路徑 (Mosialos et al., 1995)，CTAR1 及 CTAR2 下游可活化 p38、JNK 及 ERK 三條 MAPK 訊息傳遞路徑，也能活化 AP-1 及 ATFs 等轉錄因子 (Eliopoulos and Young, 1998;

Kieser et al., 1997)，另外 CTAR1 也可活化 PI3K/Akt 的訊息傳遞路徑 (Dawson et al., 2003)，CTAR3 則是可能與 Janus kinase 3 (JAK3)結合進一步活化 signal

transducer and activator of transcription 1 (STAT-1)的訊息傳遞 (Gires et al., 1999)，

IL-8 及 IL-10 的表現 (Eliopoulos et al., 1999; Huang et al., 2010; Mosialos, 2001;

Nakagomi et al., 1994)，在 LCL 中，IL-6 能利用自分泌性 (autocrine) 的生長因子

接著利用互補 DNA (complementary DNA, cDNA)的定序 (sequencing) 解開其 cDNA 圖譜以及推測出蛋白質序列。由於是在 NK 細胞上所發現的新基因，因此段，分別命名為 E1~E8，可利用不同外顯子片段做變異性剪接 (alternative

splicing)，轉錄出不同剪接變異體 (splice variant)，分別為 IL-32α、β、γ、δ、ε 及ζ (圖二)，而目前對於這六種變異體之間的功能差異仍不清楚，目前只知道不同種類的細胞能表現出不同的變異體，IL-32γ為最早被報導的變異體，當時由於是在ΝΚ細胞上所發現，名稱暫為ΝΚ4 (Dahl et al., 1992)，IL-32β則在活化後的 T 細胞中能觀察到有大量被誘導的現象 (Goda et al., 2006)，IL-32α則在肝癌細胞 (hepatocellular carcinoma) 中觀察到有大量表現 (Kang et al., 2012)。

從最早 1992 年對 IL-32 蛋白質序列定序的結果和 2005 年 Kim 等人對其序列胞可能利用 IL-32 蛋白質序列上不同的修飾位做轉譯後修飾 (post-translational modification)，所以在西方墨點法偵測 IL-32 表現時，可能因為偵測到不同的變異體及 IL-32 本身轉譯後的修飾，造成 IL-32 分子量大小的不一。

RGD 區域主要存在於和細胞貼附相關蛋白質中，目前針對 IL-32 及 RGD 區域的研究發現，IL-32 可能藉由 RGD 區域和整合素 (integrin) 結合，接著活化整合素下游的黏著激酶 (focal adhesion kinase, FAK)，黏著激酶接著活化細胞貼附相關蛋白的表現，因此 IL-32 的 RGD 區域目前推測可能與整合素下游訊息傳遞以及細胞貼附有關 (Heinhuis et al., 2012)。

有別於其他細胞激素，IL-32 在蛋白質序列上並未發現具有分泌訊號序列 (signal sequence)，也沒有任何的穿膜區域 (transmembrane domain)(Kim et al., 2005)。另外至今為止的研究也未發現有關 IL-32 的受體。直到 2007 年 Shioya 等人發現，IL-32 雖然能存在於細胞外，但是其含量是遠低於細胞內的，推測存在於細胞外的 IL-32 可能也只是細胞凋亡後細胞內的 IL-32 釋放出來的結果 (Netea

et al., 2006; Shioya et al., 2007)，因此目前的研究假說偏向 IL-32 是位在細胞內並執行其功能。

2.3 IL-32 的誘導及活化

IL-32 最早在被 IL-2 所刺激的 NK 細胞中發現能被誘導 (Dahl et al., 1992)，

近年來的研究發現，在周邊血液單核球細胞 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中以 LPS (lipopolysaccharide) 刺激並活化 TLR4 (toll-like receptor 4) 下游訊息傳遞路徑，發現 IL-32 可被誘導出來 (Netea et al., 2006)。在血管的內皮細胞中以 IL-1β、IFNγ或 LPS 刺激後能活化下游 NFκB 及 MAPK 的訊息傳遞路徑，

進而活化 IL-32 的表現 (Nold-Petry et al., 2009)。在胰腺癌細胞株中以 IL-1β、IFNγ 或 TNFα刺激後能活化 PI3K-Akt 的訊息傳遞路徑，進一步活化轉錄因子 NFκB

在文檔中探討白細胞介素 IL-32 於 EB 病毒感染 B 細胞中之調控機制及細胞功能 (頁 8-19)