國立臺灣大學醫學院微生物學所微生物及免疫學組 碩士論文
Graduate Institute of Microbiology College of Medicine
National Taiwan University Master Thesis
探討白細胞介素 IL-32 於 EB 病毒感染 B 細胞中 之調控機制及細胞功能
The regulatory and biological functions of IL-32 gene in EBV-infected cells
賴坤詣 Kun-Yi Lai
指導教授：蔡錦華 博士 Advisor: Ching-Hwa Tsai, Ph.D.
中華民國 103 年 7 月
July, 2014
致謝
一轉眼兩年的碩士生活就這樣過去了，過程中經歷的許多喜怒哀樂，真的很 開心能與實驗室的大家以及微生物所的同學師長們一起度過，在各位的分享、學 習以及指導下，覺得自己比剛進入微生物所前進步了不少，自己也漸漸能夠維持 獨立思考並解決問題。這本論文由非常多人的支持以及指導才得以完成，雖然過 程失敗了不少實驗，也迷途過許多次，但是很謝謝有你們大家的幫助。
謝謝蔡老師這兩年來的指導，雖然有時候，應該說常常，我會惹老師生氣，
但是老師最後還是很有耐心的向我解釋，在實驗方面也能給予相當多的建議，同 時也給予我十分充足的思考空間不斷的嘗試錯誤，也謝謝美如老師在每一次的 Group Meeting 給予實驗結果相當多的肯定與建議，謝謝長庚大學的素珍老師能 參加我的 Committee，並給予相當多且十分有用的建議，謝謝董老師在這兩年的 所有指導，包括所上 seminar 的報告、committee 進度報告、Defense 報告以及好 多好多數不清的幫助，真的很謝謝老師們。謝謝實驗室的君翰學長，雖然一開始 進實驗室我滿不知所措的，但是學長仍然很有耐心且很細心的指導，也點提出很 有建設性的問題及幫忙標上星號，謝謝雅菁學姐在實驗上給予的眾多幫助，雖然 我標底片的方式常常讓學姐非常頭大，謝謝雅琪學姐在科學實驗上所提供的建議 及 Reagent，謝謝奂勻學姐的植樹人，謝謝劉怡、羅敏、維筑及宇馨學姐在我一 開始進實驗室的細心指導，謝謝同桌的佩頤，讓各種 Reagent 和 Tips 都會自動填 滿，在實驗之餘也能夠跟你打幾場架，謝謝哞子同伴，雖然常被你排擠、被嗆被 打被罵，但是你仍然像是女生，謝謝小昱真的幫助以及辛苦妳照顧哞哞了，也謝 謝宜芳在 PCR 技術上給的建議，謝謝學弟彥儒在實驗上給予相當多參考的網址，
實驗的問題也時常幫我紀錄在手機裡，謝謝楷敏在英文方面給的建議，以及說說 彥儒笑話所帶來的歡樂，謝謝實驗室重霈學長、洲維學長、美慈學姐、伶詩學姐 給予的幫助，最後謝謝我的家人們，爸爸、媽媽和姐姐在背後給予的後盾和陪伴，
謝謝俐旻在這兩年的陪伴，雖然這兩年比較忙碌比較少理你。謝謝大家這兩年的 幫助以及指導。
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摘要
EB 病毒是一具有致癌能力的人類皰疹病毒，能夠感染人類初代 B 細胞 (primary B cell) ，並使其不朽化成淋巴芽母細胞株 (lymphoblastoid cell line，
LCL)。過去許多研究證實，轉形成 LCL 後細胞中會有許多細胞激素及細胞介素 被誘導表現，而這些細胞激素主要被認為和 LCL 細胞增生及不朽化有關。本實 驗室先前在 cDNA 微陣列結果中發現，其中一個細胞激素，白細胞介素 32 (interleukin 32，IL-32) 在 EB 病毒感染後的 B 細胞有明顯增加的現象。IL-32 在 近年來被報導的功能為促發炎細胞激素的一員，能在不同的細胞內誘發各種細胞 激素及細胞介素的產生，甚至具有影響細胞生長的能力。本研究目的是為了瞭解 IL-32 於 EB 病毒感染 B 細胞中之調控機制及細胞功能。實驗研究發現，隨著 EB 病毒感染 B 細胞的天數增加，IL-32 的表現量也有隨之上升的現象。另外在 四位健康捐血者的 B 細胞以 EB 病毒感染後不朽化成的 LCL 中也能看到 IL-32 皆有大量表現，顯示 EB 病毒具有活化 IL-32 表現的能力且此一現象是存在所有 EB 病毒感染後的 LCL 中。以免疫螢光染色法及細胞核質分離法發現在 LCL 內 的 IL-32 主要位在細胞質而非細胞核。進一步發現 EB 病毒的潛伏膜蛋白 1 ( Latent membrane protein 1， LMP1)及溶裂期極早期基因 Rta 對誘發 IL-32 的 mRNA 及 蛋白質表現是重要的，另外，隨著表現越多的 LMP1 能以正相關的現 象誘導越多 IL-32 表現，且在 IL-32 大量表現的 LCL 中，以 shRNA 抑制 LMP1 的表現後也可以看到 IL-32 表現有隨之下降的現象，以上結果顯示 LMP1 具有 活化 IL-32 表現的能力。在 LMP1 分子調控機制上，我們發現 LMP1 能透過 C 端活化區域 CTAR1 以及 CTAR2 活化 IL-32 表現。以螢光酵素報導基因分析 發現 IL-32 基因的啟動子上 -8 至+2 的核甘酸鹼基對之 NF-κB 結合位對於基因 表現是重要的，進一步我們利用染色質免疫沉澱法，發現 NF-κB p65 能夠結合 在 IL-32 啟動子上，在 LMP1 表現的 Akata 細胞中，另外在 LCL 及 LMP1 表 現的 Akata 細胞中以 shRNA 使 p65 基因受抑制後也可以看到 IL-32 表現有下 降的現象，顯示 LMP1 活化 IL-32 是透過 NFκB 訊息傳遞路徑。在細胞功能研究
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部分，我們在 LCL 中以 shRNA 抑制 IL-32 表現後，觀察到 EB 病毒溶裂期基因 的表現量皆有上升的現象，顯示 LCL 內 EB 病毒進入溶裂期，接著進一步發現 溶裂期極早期基因 Zta 的啟動子(Zp)的活性，在經過 Zta、TSA 藥物刺激及蛋白 激酶 C (protein kinase C, PKC)的大量表現後會有增加的現象，重要的是這些 Zp 活化的現象會受到 IL-32 的抑制，顯示 IL-32 可能藉由抑制 Zp 的方式進而抑制 EB 病毒進入溶裂期，另外以共軛焦顯微鏡可以觀察到 IL-32 具有抑制 PKC 進入 細胞核的現象，暗示 IL-32 確實能夠抑制 PKC 所造成的活化現象。除此之外，
在 LCL 中以 shRNA 抑制 IL-32 表現後也觀察到 IL-6 有活化的現象，但 IL-10 及 TNFα則沒有太大的影響，顯示 IL-32 具有影響細胞激素表現的能力。同樣在 LCL 中以 shRNA 抑制 IL-32 表現後則發現 IL-32 不會影響細胞增生。以上對生理功能 的研究顯示，IL-32 可能主要功能為抑制 LCL 中的 EB 病毒進入溶裂期及 IL-6 的 表現。由於 IL-6 對 LCL 的生長及不朽化是重要的，且進入溶裂期有助於 EB 病 毒的擴散及形成 EB 病毒相關之惡性腫瘤，幫助 EB 病毒形成適合存在的環境，
IL-32 可能扮演宿主抑制 EB 病毒入侵的角色。
關鍵字: EB 病毒、LMP1、細胞激素、白細胞介素-32
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Abstract
Epstein-Barr virus (EBV) is a human oncogenic herpesvirus, which has the potential to immortalize primary B cells into unlimitedly proliferating lymphoblastoid cell lines (LCLs). Previous study shows that several cytokines are induced during immortalization and these cytokines are required for cell proliferation and B cell immortalization. Our previous cDNA microarray results show that interleukin 32 (IL-32), a newly discovered proinflammatory cytokine, is upregulated after EBV infection. Recent studies show that IL-32 is a proinflammatory cytokine which can induce other cytokines and effect cell proliferation. So, we wonder what is the role of IL-32 in EBV-infected cells. The expression of IL-32 is up-regulated during EBV infection. B cells purified from four different donors are infected by EBV for 28 days (defined as LCL), and also, IL-32 is up-regulated in these LCLs. The cellular localization of IL-32 is mainly in the cytoplasm of LCLs. Furthermore, the EBV latent membrane protein 1 (LMP1) and Rta are responsible for inducing IL-32 expression in both mRNA and protein levels. LMP1 also induces IL-32 expression in a dose-dependent manner. Knockdown of endogenous LMP1 in LCLs with shRNA approach suppresses the IL-32 expression. These data suggest that LMP1 is critical for induction of IL-32 expression. We also demonstrated that the carboxy-terminal activating region (CTAR) 1 and CTAR2 of LMP1 are required to induce IL-32. The NF-κB site located at the -8 to +2 nucleotide locus of IL-32 promoter is crucial for activating IL-32 in the reporter assays. Moreover, using ChIP assay, we demonstrate that NF-κB p65 binds to IL-32 promoter region in LMP1-expressing Akata cells.
Knockdown of p65 with shRNA suppresses IL-32 expression. These data show that NF-κB p65 is critical for IL-32 expression. In biological function study, knockdown of IL-32 in LCL induces EBV lytic protein expression. Moreover, the promoter acitivity of immediately early gene Zta is induces via the expressing of Zta, treating
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TSA, and PKC stimulation. However, these activations on Zta promoter (Zp) activity are suppressed by IL-32 expression. Also, overexpressing IL-32 in Hela cells blocks the translocation of PKC into nuclear. These data indicate that IL-32 suppresses EBV lytic cycle by suppressing Zp activity. Furthermore, depletion of IL-32 in LCL also induces the expression of IL-6 instead of IL-10 or TNFα. This result shows that IL-32 can affect particular cytokine production in LCL, which may be different from other cell types. However, depletion of IL-32 dose not have impact on cell proliferation.
Overall, IL-32 inhibits the lytic cycle of EBV and partial IL-6 expression. IL-6 is critical for the proliferation and immortalization of LCL. EBV lytic cycle progression is important for EBV evation and formation of EBV-associated malignancies. These concepts indicate that IL-32 might play a role in EBV life cycle.
Key words: EBV, LMP1, cytokine, IL-32
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目錄
中文摘要……….….…………II 英文摘要……….…IV
第一章 序論………....1
第二章 實驗材料與方法………12
第三章 實驗結果………31
第四章 討論………42
第五章 圖表………48
第六章 參考文獻………85
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第一章 序論 一、 EB 病毒 (Epstein-Barr Virus, EBV) 1.1 EB 病毒發現史
EB 最早於 1958 年由英國外科醫生 Denis Burkitt 在非洲小孩身上發現一種惡 性淋巴瘤，並且提出此淋巴瘤可能為病毒所引發的假說，因此將此惡性腫瘤命名 為 Burkitt’s lymphoma (Burkitt and O'Conor, 1961)。而後於 1964 年，英國的病理 學家 Michael Anthony Epstein 及 Yvonne Barr 等人從腫瘤檢體中成功培養出淋巴 瘤細胞株，並以電子顯微鏡發現到細胞株具有類似疱疹病毒的顆粒 (Epstein et al., 1964)。隨後 Henle 等人進一步利用血清學抗體反應等實驗方法，發現此 Burkitt’s 淋巴瘤中的病毒和其他已知的疱疹並不同 (Henle and Henle, 1966)，說明 Burkitt’s 淋巴瘤中含有一種新的疱疹病毒，將其命名為 EB 病毒，Epstein-Barr Virus。
1.2 EB 病毒的分類、組成結構及基因體
EB 病 毒 分 類 屬 於 疱 疹 病 毒 科 (herpesviridae) 中γ 疱 疹 病 毒 亞 科 (γ-herpesvirinae) 的一員，也被稱為人類第四型疱疹病毒 (human herpesvirus 4, HHV-4) (Fields et al., 2007)。
EB 病毒顆粒最外層結構是來自宿主細胞的套膜 (outer envelope)，套膜上則 嵌有病毒產生的醣蛋白 (glycoproteins) ，位於病毒蛋白質外殼以及套膜中間的 間質為蛋白質被膜 (tegument proteins)(Dolyniuk et al., 1976)，病毒的蛋白質核外 殼 (nucleocapsid) 是由 162 個次蛋白質衣 (capsomers) 所形成的二十面體結構。
蛋白質核外殼內包裹 EB 病毒全長約 172 kb 的雙股線性 DNA 基因體，基因 體的兩端為約 0.5 kb 的末端重複序列 (terminal repeats, TRs)，內部含有約 3 kb 的 重複序列 (internal repeats, IRs) 及可轉譯出超過 85 個基因產物的獨特序列 (unique sequence, US) (Dambaugh and Kieff, 1982; Given et al., 1979)。1980 年為了 對基因研究的通用性，Dambaugh 等人以 BamHI 限制酶切割 B95.8 病毒株的基因 體，並完成此病毒株的限制酶圖譜，以 BamHI 限制酶切割後 DNA 片段長短以英
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文字母順序排列 (A 至 Z) (Dambaugh et al., 1980)，並根據基因的轉錄方向及其位 在的開放譯讀架 (open reading frames, ORF) 將 EV 病毒的基因命名 (Baer et al., 1984)。
1.3 EB 病毒及其相關疾病
EB 病毒主要傳染途徑是藉由唾液傳染，目前已知世界上將近 90 % 的成年 人都曾受到 EB 病毒的感染，雖然多數人被感染並無明顯的臨床病徵，但會終生 帶 原 。 和 EB 病 毒 相 關 之 人 類 疾 病 包 含 感 染 性 單 核 球 增 多 症 (infectious mononucleosis, IM)、移植後淋巴組織增生症 (post-transplant lymphoproliferative disease, PTLD)、愛滋病相關的口腔髮狀白斑症 (oral hairy leukoplakia, OHL)、柏 金氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma, BL)及霍杰金氏症(Hodgkin disease, HD)(Geser et al., 1982; Greenspan and Greenspan, 1989; Henle and Henle, 1966; Hjalgrim and Engels, 2008; Mueller et al., 1989; Nalesnik, 1998; Niederman et al., 1968;
Niedobitek et al., 1989; Purtilo, 1987)，除了淋巴性疾病之外，EB 病毒也被認為和 鼻咽癌 (Nasopharyngeal carcinoma, NPC)有高度相關性 (Wolf et al., 1975)，另外 近年研究指出在胃腺癌 (gastric adenocarcinoma)和乳癌 (breast cancer)病人檢體 中曾經檢驗出 EB 病毒的基因體，是可能引發胃癌的感染性病原之一。其和乳癌 之關係則尚待進一步探查 (Fukayama et al., 1994; Labrecque et al., 1995; Shibata and Weiss, 1992)。
1.4 EB 病毒生活史
EB 病毒具有感染宿主 B 細胞的能力，以病毒表面的醣蛋白 gp350/220 與 B 細胞表面之 CD21 受體 (CD21 receptor) 結合 (Hutt-Fletcher et al., 1983; Micklem et al., 1985; Yefenof et al., 1976)，另外再以病毒外套膜上的 gp42 扮演輔助受體 (co-receptor) 和宿主的 MHC class II 結合後進入 B 細胞 (Nemerow et al., 1987)。
在人體中根據 Thorley-Lawson 等人的理論，EB 病毒藉可由唾液感染上皮細胞後
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進入扁桃體，即可感染休眠期 B 細胞 (resting B cell)(Thorley-Lawson and Allday, 2008; Thorley-Lawson and Gross, 2004)。EB 病毒感染 B 細胞後可以分為潛伏期以 及溶裂期兩種生活週期。
EB 病毒之潛伏期 (Latent stage)
EB 病毒在潛伏期主要表現十一種病毒基因，六種分布於宿主細胞核內的核 蛋白 (EBV nuclear antigen proteins, EBNAs) 、三種位在宿主細胞膜上的膜蛋白 (Latent membrane proteins, LMP1, LMP2A, LMP2B)以及病毒所轉錄之核醣核酸 (RNA) (EBV-encoded RNAs, EBERs 及 BamHI A right-ward transcripts, BARTs)。依 照不同 EB 病毒基因表現的模式，將潛伏期分為四型 (Thorley-Lawson and Gross, 2004)。
(1) 潛伏期第零型 (Latency 0) :
主要表現 EBERs 及 BARTs，亦有研究發現可能會表現 EBNA1 及 LMP2 之 mRNA，常見於健康的 EB 病毒帶原者之休眠期記憶性 B 細胞 (quiescent memory B cells)。
(2) 潛伏期第一型 (Latency I) :
主要表現 EBERs、BARTs 及 EBNA1，EB 病毒相關之柏金氏淋巴瘤屬於此 型。
(2) 潛伏期第二型 (Latency II) :
主要表現 EBERs、BARTs 及 EBNA1、LMP1、LMP2，EB 病毒相關之鼻咽 癌及霍杰金氏症屬於此型。
(3) 潛伏期第三型 (Latency III) :
所有潛伏期病毒基因均會表現，淋巴球增多症 (Lymphoproliferative disease)、
移植後淋巴增生疾病 PTLD、感染性單核球增多症細胞及活體外感染 B 細胞使 之不朽化成的淋巴母芽細胞株 (lymphoblastoid cell line, LCL) 中之 EB 病毒屬於 此型。
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EB 病毒之溶裂期 (Lytic stage)
在潛伏期的 EB 病毒可能因為環境的壓力，自發性的進入溶裂期。亦可能於 培養基中加入化學藥劑佛波酯 (phorbol esters, TPA)、Sodium butyrate、抗免疫球 蛋白抗體 (anti-immunoglobulin antibody, IgG) 或轉染 EB 病毒轉錄活化因子 Zta 或 Rta 均能使 EB 病毒再活化而進入溶裂期 (Countryman and Miller, 1985;
Hardwick et al., 1988; Luka et al., 1979; zur Hausen et al., 1978)。溶裂期表現之基因 依表現時序可分為三類。第一類為極早期基因 (immediately early gene) : EB 病毒 進入溶裂期最先表現的基因為 BZLF1 及 BRLF1，其基因產物分別為 Zta 及 Rta 是重要的轉活化因子 (transactivator)，可與 EB 病毒基因上的 ZRE (Zta response element) 或 RRE (Rta response element) 結合，單獨或協同活化更多溶裂期基因 表現(Chevallier-Greco et al., 1986; Countryman and Miller, 1985; Fixman et al., 1992)。第二類為早期基因 (early gene) : 早期基因所表現的蛋白質大多參與病毒 DNA 複製有關，包含病毒 DNA 聚合酶 BALF5、具有 DNA 螺旋酶 (helicase) 功 能的 BBLF4、聚合酶輔助因子 BMRF1、穩定單股 DNA 結構之 DNA 結合蛋白 BALF2 及具有引子酶 (primase) 功能的 BSLF1 等 (Fixman et al., 1992; Goodman et al., 1978; Kallin et al., 1985; Zeng et al., 1997)。第三類為晚期基因 (late gene) : EB 病毒溶裂期晚期基因所表現的蛋白大多是構成病毒套膜及核膜，參與在 EB 病毒顆粒包裹 (package) 有關，如病毒套膜抗原 (viral capsid antigens, VCA)及套 膜醣蛋白 (membrane antigens, MA)(Hummel and Kieff, 1982; Tsurumi et al., 2005;
Vroman et al., 1985)。
EB 病毒進入溶裂期後，依照上述時序表現不同溶裂期基因，從大量複製病 毒 DNA 開始至結構蛋白的產生，經過運送、組裝、修飾以及包裹產生新的 EB 病毒顆粒，並以胞外分泌作用 (exocytosis) 或是細胞溶裂 (cell lysis) 的方式離開 宿主細胞，進行下一個生命週期。
1.5 EB 病毒體外不朽化 B 細胞之特性
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EB病毒在體外 (in vitro) 能將B細胞轉型 (transformation) 為具有不斷增生能力 的淋巴芽母細胞株 LCL，此一體外轉型的模式是於1973年Miller等人以周邊血液 單核球細胞 (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) 加入B95.8 EB病毒，感 染其中的休眠期B細胞 (resting B-lymphocyte) 建立而成的 (Miller and Lipman, 1973)。LCL相較於未受EB病毒感染的休眠B細胞型態上具有明顯的變化，如表 面有不規則的突起 (protrusion)、細胞明顯較大及體外靜置培養下會有聚集球狀 (clump topology) 的現象 (Fields et al., 2007)，除了型態上的變化，LCL也表現許 多B細胞的活化標誌，如CD23、CD40、CD44及細胞附著分子ICAM-1和LFA-1 等(Calender et al., 1987; Davies et al., 2010; Halder et al., 2009; Peng and Lundgren, 1992)。潛伏在LCL中的EB病毒表現的是EB病毒潛伏期第三型基因，其會使細胞 具有不朽化及不斷增生的能力，近年來的研究發現EB病毒具有抑制細胞凋亡的 能力，例如LMP2A可利用PI3K的訊息傳遞路徑活化抑制凋亡 (anti-apoptosis) 的 蛋白質Bcl-xL (Portis and Longnecker, 2004)，另外許多潛伏期基因，如EBNA1、
EBNA2、EBNA3A、EBNA3C和LMP1也指出對EB病毒不朽化B細胞是重要的 (Cahir McFarland et al., 1999; Cohen et al., 1989; Hammerschmidt and Sugden, 1989;
Lee et al., 1999; Mannick et al., 1995; Tomkinson et al., 1993; Wang et al., 1985) 1.6 EB 病毒感染後誘發之細胞激素 (cytokine)
過去研究已指出許多 EB 病毒蛋白能活化不同的細胞激素，這些細胞激素大 多被認為對 B 細胞的不朽化及增生是重要的。例如 EB 病毒潛伏膜蛋白 (LMP1) 能透過活化下游 NFκB 訊息傳遞路徑及 AP-1 轉錄因子，進一步活化 IL-1β、IL-6、
IL-8 及 IL-10 (Eliopoulos et al., 1999; Huang et al., 2010; Nakagomi et al., 1994)等細 胞激素的表現，EBNA2 可與轉錄因子RBP-Jκ 結合 (Hsieh and Hayward, 1995)，
進一步促進 IFN-α/β的產生 (Kanda et al., 1999)，其他能與 DNA 結合的 EB 病毒 蛋白如 Zta 及 Rta，過去也被報導能增加 IL-6、IL-8 和 IL-10 (Jones et al., 2007;
Mahot et al., 2003) 的表現，顯示當 EB 病毒進入溶裂期能誘發更多的細胞激素，
另外本實驗室過去研究指出 Zta 可以直接結合在 IL-13 基因的啟動子 AP-1 結合
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位，進一步誘導 IL-13 的表現 (Tsai et al., 2009)，研究中也指出 IL-13 對 B 細胞 的增生是重要的，顯示 EB 病毒利用其蛋白能調控宿主細胞之細胞激素的表現，
進而影響宿主細胞的增生。
1.7 EB 病毒潛伏膜蛋白(latent membrane protein 1, LMP1)之生理功能
EB 病毒之 LMP1 蛋白，結構可分為位於細胞質內的 N 端區域、六段由疏水 性胺基酸所組成的穿膜區域 (transmembrane domain)及一長片段位於宿主細胞質 內的 C 端區域 (C-terminal domain) 等三個部分。N 端區域位在宿主細胞質內，
功能為幫助 LMP1 導向及穩定嵌至宿主細胞膜上，由疏水性胺基酸所組成的六個 穿膜區域，結構上能幫助 LMP1 嵌在宿主細胞膜上，C 端區域主要包含三個活化 區域 (C-terminal activating region)，縮寫分別為 CTAR1、CTAR2 及 CTAR3，主 要功能為活化下游訊息傳遞路徑及誘發轉錄因子的活化，如 MAPK 訊息傳遞路 徑或 NFkB 訊息傳遞路徑。藉此 LMP1 能經由活化不同的訊息傳導路徑，接著調 控下游基因之表現，進而調控細胞各種生理功能 (Dawson et al., 2012; Huen et al., 1995; Li and Chang, 2003; Young and Rickinson, 2004)(圖一)。
LMP1 的構造和 CD40 類似，所以活化的下游訊息傳遞路徑也類似 (Kilger et al., 1998)，CD40 為一腫瘤壞死因子受體 (tumor necrosis factor receptor, TNFR) 的 其中一員， 下游以腫瘤壞死因子受體相關因子 (TNFR associated factors, TRAFs) 傳遞細胞訊號，LMP1 則可直接利用 TRAF1、TRAF2、TRAF3 及 TRAF6，以及 腫瘤壞死因子受體相關致死區域蛋白 (TNFR associated death domain protein, TRADD) 活化下游訊息傳遞路徑(Devergne et al., 1998)。有別於 CD40 受體，
LMP1 不需要任何受質 (ligand)即可自發性的活化下游相似的訊息傳遞路徑 (Mosialos et al., 1995)，CTAR1 及 CTAR2 下游可活化 p38、JNK 及 ERK 三條 MAPK 訊息傳遞路徑，也能活化 AP-1 及 ATFs 等轉錄因子 (Eliopoulos and Young, 1998;
Kieser et al., 1997)，另外 CTAR1 也可活化 PI3K/Akt 的訊息傳遞路徑 (Dawson et al., 2003)，CTAR3 則是可能與 Janus kinase 3 (JAK3)結合進一步活化 signal
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transducer and activator of transcription 1 (STAT-1)的訊息傳遞 (Gires et al., 1999)，
推測可能與發炎相關之細胞激素產生有關。LMP1 對 B 細胞轉型是重要的，但是 已知刪除 CTAR3 對於 EB 病毒生長及 B 細胞轉型沒有影響(Dirmeier et al., 2003;
Izumi et al., 1999)，所以目前對於 CTAR3 的研究及其功能仍不十分清楚。
從 LMP1 訊息傳遞路徑可以觀察到，NFκB 訊息傳遞路徑及 AP-1 轉錄因子 能被 LMP1 所活化及利用(圖一)，其中 NFκB 訊息傳遞路徑對於細胞激素的表現 是非常重要的，目前已知 LMP1 能透過 NFκB 訊息傳遞路徑活化 IL-1β、IL-6、
IL-8 及 IL-10 的表現 (Eliopoulos et al., 1999; Huang et al., 2010; Mosialos, 2001;
Nakagomi et al., 1994)，在 LCL 中，IL-6 能利用自分泌性 (autocrine) 的生長因子 來促進 LCL 的增生 (Scala et al., 1990; Tanner and Tosato, 1992)，顯示 LMP1 所活 化的細胞激素中，含有對 LCL 細胞增生相當重要的角色。
二、 白細胞介素 32 (Interleukin 32, IL-32) 2.1 IL-32 的發現
在 1992 年，Dahl 等人將自然殺手細胞 (natural killer cell, NK cell) 加入 IL-2 細胞激素刺激後，以北方墨點法分析其 mRNA，發現誘導出一新的 mRNA 片段，
接著利用互補 DNA (complementary DNA, cDNA)的定序 (sequencing) 解開其 cDNA 圖譜以及推測出蛋白質序列。由於是在 NK 細胞上所發現的新基因，因此 命名為 NK4 (Dahl et al., 1992)，但其生物功能未明。到了 2005 年，Kim 等人利 用 NK4 的重組蛋白給予 THP-1 單核球細胞株刺激，發現 NK4 能誘導 THP-1 細 胞株產生 TNFα及 IL-8 的表現，推測 NK4 具有細胞激素的基本功能，因此將 NK4 正式歸類在白細胞介素中，命名為 IL-32 (Kim et al., 2005)。
2.2 IL-32 的蛋白質結構特性
IL-32 的基因位在人類第 16 號染色體上，其基因含有 8 個外顯子 (exon) 片 段，分別命名為 E1~E8，可利用不同外顯子片段做變異性剪接 (alternative
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splicing)，轉錄出不同剪接變異體 (splice variant)，分別為 IL-32α、β、γ、δ、ε 及ζ (圖二)，而目前對於這六種變異體之間的功能差異仍不清楚，目前只知道不 同種類的細胞能表現出不同的變異體，IL-32γ為最早被報導的變異體，當時由於 是在ΝΚ細胞上所發現，名稱暫為ΝΚ4 (Dahl et al., 1992)，IL-32β則在活化後的 T 細胞中能觀察到有大量被誘導的現象 (Goda et al., 2006)，IL-32α則在肝癌細胞 (hepatocellular carcinoma) 中觀察到有大量表現 (Kang et al., 2012)。
從最早 1992 年對 IL-32 蛋白質序列定序的結果和 2005 年 Kim 等人對其序列 的預測研究發現，IL-32 因為和其他細胞激素不具有相同或重複的蛋白質序列及 區域 (domain) 因此不屬於任何已知的細胞激素家族 (cytokine family) 成員，目 前推測 IL-32 蛋白質序列上具有 3 個十四烷酸結合位 (myristoylation site)、1 個 醣基結合位 (N-glycosylation site) 以及在 C 端上含有 Arg-Gly-Asp (RGD) 的序 列，稱做 RGD 區域 (RGD domain) (Dahl et al., 1992; Kim et al., 2005)，不同的細 胞可能利用 IL-32 蛋白質序列上不同的修飾位做轉譯後修飾 (post-translational modification)，所以在西方墨點法偵測 IL-32 表現時，可能因為偵測到不同的變 異體及 IL-32 本身轉譯後的修飾，造成 IL-32 分子量大小的不一。
RGD 區域主要存在於和細胞貼附相關蛋白質中，目前針對 IL-32 及 RGD 區 域的研究發現，IL-32 可能藉由 RGD 區域和整合素 (integrin) 結合，接著活化整 合素下游的黏著激酶 (focal adhesion kinase, FAK)，黏著激酶接著活化細胞貼附 相關蛋白的表現，因此 IL-32 的 RGD 區域目前推測可能與整合素下游訊息傳遞 以及細胞貼附有關 (Heinhuis et al., 2012)。
有別於其他細胞激素，IL-32 在蛋白質序列上並未發現具有分泌訊號序列 (signal sequence)，也沒有任何的穿膜區域 (transmembrane domain)(Kim et al., 2005)。另外至今為止的研究也未發現有關 IL-32 的受體。直到 2007 年 Shioya 等 人發現，IL-32 雖然能存在於細胞外，但是其含量是遠低於細胞內的，推測存在 於細胞外的 IL-32 可能也只是細胞凋亡後細胞內的 IL-32 釋放出來的結果 (Netea
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et al., 2006; Shioya et al., 2007)，因此目前的研究假說偏向 IL-32 是位在細胞內並 執行其功能。
2.3 IL-32 的誘導及活化
IL-32 最早在被 IL-2 所刺激的 NK 細胞中發現能被誘導 (Dahl et al., 1992)，
近年來的研究發現，在周邊血液單核球細胞 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中以 LPS (lipopolysaccharide) 刺激並活化 TLR4 (toll-like receptor 4) 下游 訊息傳遞路徑，發現 IL-32 可被誘導出來 (Netea et al., 2006)。在血管的內皮細胞 中以 IL-1β、IFNγ或 LPS 刺激後能活化下游 NFκB 及 MAPK 的訊息傳遞路徑，
進而活化 IL-32 的表現 (Nold-Petry et al., 2009)。在胰腺癌細胞株中以 IL-1β、IFNγ 或 TNFα刺激後能活化 PI3K-Akt 的訊息傳遞路徑，進一步活化轉錄因子 NFκB 及 AP-1 使 IL-32 的表現量上升 (Nishida et al., 2009)。在小腸表皮細胞株中加入 NFκB 訊息傳遞路徑的抑制物後，發現 IL-32 的表現量有下降的現象，顯示 IL-32 可能透過 NFκB 訊息傳遞路徑被誘導出來。
許多病毒也被報導能誘導 IL-32 的表現，流感病毒 (influenza virus) 及人類 乳突狀病毒 (human papillomavirus, HPV) 分別感染人類肺臟上皮細胞株 A549 和子宮頸癌細胞株後能利用環氧合酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2) 誘導 IL-32 的 表現(Lee et al., 2011; Li et al., 2008)。流感病毒也能利用 IκB 酶 (IκB kinase, IKK) 活化 NFκB 訊息傳遞路徑以及轉錄因子 CREB (cAMP response element binding protein)，進一步誘導 IL-32 產生，還能利用表觀遺傳 (epigenetic) DNA 去甲基化 (demethylation) 的方式，使 IL-32 啟動子上去甲基化而被活化 (Li et al., 2010)。B 型肝炎病毒 (hepatitis B virus, HBV) 能利用其病毒蛋白 X (HBx) 活化 NFκB 訊 息傳遞路徑以誘導 IL-32 的表現 (Pan et al., 2011)，另外人類免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency viru, HIV)感染後的 PBMCs、HEK293T 及病人檢體中也 可以發現 IL-32 有大量表現的情況 (Nold et al., 2008a; Rasool et al., 2008)。
9
2.4 IL-32 的生理功能
目前認為 IL-32 的生理功能為一促發炎激素 (pro-inflammatory cytokine)，能 夠誘導下游更多細胞激素的產生，以利發炎反應的進行。2005 年 Kim 等人以 IL-32α/β重組蛋白成功誘導 THP-1 單核球細胞株中 TNFα及 IL-1β的表現，且發 現 IL-32α/β具有誘導 NFκB 及 p38 MAPK 訊號傳遞路徑的能力 (Kim et al., 2005)。
在人類免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency viru, HIV) 感染的周邊血液單核 球細胞中，以 siRNA 抑制內生性 IL-32 的表現可以觀察到 IL-1β、IL-6、IFNγ及 TNFα的表現量受到抑制 (Nold et al., 2008b)。以 siRNA 抑制人類內皮細胞 HUVEC 中的內生性 IL-32，也能觀察到 IL-1β、IL-6 及 IL-8 的表現有降低的現 象 (Nold-Petry et al., 2009)，類似的研究也發現，同樣以 siRNA 抑制 HUVEC 中 內生性 IL-32 後，接著以 LPS 或 TPA 刺激，觀察到 TNFα、IL-6 及 IL-8 的表現 受到抑制 (Hong et al., 2010)。以上研究結果皆顯示 IL-32 可能對誘導細胞激素產 生扮演重要的角色，所以在 2010 年 Kobayashi 等人提出 IL-32 在血管內皮細胞中 發炎反應的假說，推測 TNFα或 IL-1β能透過 NFκB 訊息傳遞路徑活化 IL-32 的 表現，IL-32 表現後能活化更多的細胞激素，如 TNFα或 IL-1β，進而吸引白血球 聚集至發炎位置而促進發炎反應的進行，並且整個發炎反應路徑以正向回饋 (positive feedback) 的方式持續活化 (Kobayashi et al., 2010)(圖三)。
除了誘導細胞激素產生的功能外，也有研究指出 IL-32 可能和細胞增生有關，
在 2009 年 Nishida 利用胰腺癌細胞株，以 shRNA 抑制內生性 IL-32 的表現後觀 察到 IL-32 具有影響胰腺癌細胞株生長的能力，進一步也探察到 IL-32 能活化 Bcl-2 及 Bcl-xL 等存活蛋白 (survival protein) 的表現，顯示 IL-32 可能透過活化 存活蛋白的表現，進而影響細胞生長 (Nishida et al., 2009)。
另外也有研究指出，IL-32 具有抗腫瘤 (anti-tumor) 及抗病毒 (anti-virus) 的 能力。以皮下注射方式使 B16 黑色素瘤細胞株 (B16 melanoma cells) 生長在 IL-32 表現的基因轉殖鼠 (transgenic mice) 身上，觀察到 IL-32 具有抑制腫瘤細 胞中 NFκB 及 STAT3 訊息傳遞路徑的能力進而抑制腫瘤本身生長的能力 (Oh et
10
al., 2011; Yun et al., 2013)。另外在 HIV 感染的周邊血液單核球細胞中，以 siRNA 抑制內生性 IL-32 的表現後發現，IL-32 具有抑制 HIV 核心蛋白 (core protein) p24 的能力，以達到抗病毒的功能 (Nold et al., 2008b; Rasool et al., 2008)。在流感病 毒感染的人類肺臟上皮細胞株 A549 中可以發現 IL-32 除了能被 iNOS 誘導表現，
也能經由負回饋的方式抑制 iNOS 的表現 (Li et al., 2009)。
最近期關於 IL-32 的研究發現，IL-32 不同變異體之間有互相結合的作用，
IL-32 之間的結合對活化下游基因表現也是重要的，目前知道 IL-32δ能透過與 IL-32β之間的結合，抑制 IL-32β所活化的 IL-10 (Kang et al., 2013b)。另外對細胞 生理功能非常重要的蛋白激酶 C (protein kinase C, PKC)，也被報導能與 IL-32β 結合並活化 PKC 下游的轉錄因子 C/EBPα，進而活化 IL-10 的表現 (Kang et al., 2013b)。
2.5 研究目的
過去研究指出 IL-32 具有抑制病毒複製及病毒顆粒產生的能力，也有研究發 現 IL-32 能夠抑制腫瘤的生長，但是也有文獻指出相反的結果，認為 IL-32 具有 增加腫瘤生長、幫助宿主躲避免疫細胞攻擊及造成腫瘤轉移的功能，故目前 IL-32 對腫瘤影響的研究仍不清楚。本實驗室先前利用 cDNA 微陣列分析在 EB 病毒轉 形 B 細胞變成 LCL 的過程中發現，隨著 EB 病毒感染的時間增加 IL-32 的表現 也有上升的趨勢，因此想進一步了解 EB 病毒利用宿主細胞的 IL-32 是否和 B 細 胞之不朽化及轉型有關，及 IL-32 是否影響 EB 病毒的生長週期感到好奇。此研 究主要探討 : (1) IL-32 在 EB 病毒轉形後的 LCL 是如何被調控，以及 (2) 誘導 之 IL-32 對 EB 病毒生長週期、宿主細胞中其他細胞激素及細胞生長的影響。
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第二章 實驗材料與方法 一、 實驗材料
1.1 藥品
2-mercaptoethanol, 2-ME (Sigma) 2-propanol (J.T. Baker)
Acetic acid (J.T. Baker) Agarose (Invitrogen)
Ammonium acetate, NH4OAc (Merck) Ammonium persulfate, APS (Sigma) Ampicillin (Sigma)
Bisacrylamide (Usb)
Bovine serum albumin, BSA (Roche) Bromophenol blue (Sigma)
Chloroform (Merck)
Diethyl pyrocarbonate, DEPC (Sigma) Dimethyl sulfoxide, DMSO (Merck) Dipotassium phosphate, K2HPO4 (Merck) Disodium phosphate,Na2HPO4 (Merck)
Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM (Hyclone) Ethanol (Burnett)
Ethidium bromide, EtBr (Sigma)
Ethylene diamine tetra-acetic acid, EDTA (J.T. Baker) Fast green (Sigma)
Fat-free skim milk (安佳)
Fetal bovine serum, FBS (Hyclone) Glycerol (J.T. Baker)
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Glycine (Bio Basic) Glycogen (Roche)
Hydrochloric acid, HCl (J.T. Baker) Kanamycin (Sigma)
L-glutamine (Sigma) Methanol (J.T. Baker) Opti-MEM® (Invitrogen)
Penicillin:streptomycin solution (Gemini) Peptone (Usb)
Phenol (和光)
Potassium chloride, KCl (J.T. Baker)
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 (Merck) Proteinase K (Roche)
Puromycin (Sigma) RNase A (Sigma)
Roswell Park Memorial Institute medium, RPMI (Hyclone) Sodium acetate, NaOAc (Merck)
Sodium azide (Sigma)
Sodium chloride, NaCl (J.T. Baker) Sodium deoxycholate (Sigma)
Sodium dodecyl sulfate, SDS (Merck) Sodium fluoride, NaF (Merck)
Sodium hydroxide, NaOH (J.T. Baker)
Sodium metabisulfite, Na2S2O5 (Sigma-Aldrich) Sodium orthovanadate, Na3VO4 (Sigma)
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine, TEMED (Sigma)
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Tris (Bio Basic) Triton X-100 (Merck)
TRIzol® reagen (Invitrogen) Trypan blue (Sigma)
Trypsin (Biological Industries) Tween20 (J.T. Baker)
Yeast extract (BD)
1.2 套組試劑
AlamarBlue® (AbD Serotec) Bio-Rad protein assay (Bio-Rad)
Bright-Glo® Luciferase Substrate (Promega)
Calf intestinal alkaline phosphatase, CIP (New England Biolabs) Deoxyribonucleotide triphosphate, dNTP (Protech)
DETACHaBEAD® CD19 (Invitrogen) Dithiothreitol, DTT ( Promega)
Dual-Glo® Luciferase Substrate (Promega) Dynabeads® CD19 Pan B (Invitrogen) Ficoll-Paque (GE Healthcare)
Gel/PCR DNA fragments extraction kit (Geneaid) High-speed plasmid mini kit (Geneaid)
Immobilon-P Transfer Membranes, PVDF (Millipore) KAPA HiFi DNA polymerase (Kapa Biosystems) Klenow fragment (New England Biolabs) Lipofectamine 2000 (Invitrogen)
M-MLV Reverse transcriptase (Promega)
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Non-liposome transfection reagent II, NTR II (T-pro)
Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) QIAGEN Plasmid maxi kit (Qiagen)
ProZyme DNA polymerase (Protech) Random primers (Bionovas)
Rnasin RNase inhibitor (Promega) T4 DNA ligase (New England Biolabs)
Western Lightning enhanced chemiluminescence, ECL (Perkin Elmer)
1.3 質體 pSG5
由 SV40 啟動子表現，並具有 ampicillin 抗藥基因。
pSG5-LMP1
由 SV40 啟動子表現 LMP1，並具有 ampicillin 抗藥基因。 (由英國伯明罕大學 Dr.
Alan B. Rickinson 惠贈) pSG5-Zta
由 SV40 啟動子表現 Zta，並具有 ampicillin 抗藥基因。 (由本實驗室 吳韶文學 姐惠贈)
pSG5-Rta
由 SV40 啟動子表現 Rta，並具有 ampicillin 抗藥基因。 (由本實驗室 吳韶文學 姐惠贈)
pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP
pCDH 為慢病毒表現載體，目標基因由 CMV 啟動子表現，另外帶有以 EF1 啟動 子表現之 copGFP 和 ampicillin 抗藥基因。
pCDH-IL32β
pCDH 為慢病毒表現載體，以 CMV 啟動子表現 IL-32β，另外帶有以 EF1 啟動子
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表現之 copGFP 和 ampicillin 抗藥基因。 (由本實驗室 劉怡學姐惠贈) pSIN-MCS
由慢病毒表現基因之載體，帶有 SFFV 啟動子(spleen focus forming virus promoter)，
並具有 ampicillin 抗藥基因。(由陽明大學 王學偉老師惠贈) pSIN-LMP1
建構於 pSIN 載體上，可表現 LMP1 之慢病毒質體。 (由本實驗室 蔡淑君學姊惠 贈)
pMD2.G
帶有 CMV 啟動子以表現 VSV 套膜醣蛋白，並具有 ampicillin 抗藥基因，為包裹 慢病毒必須之質體。 (由陽明大學 王學偉老師惠贈)
p8.91
帶有 CMV 啟動子以表現 HIV-1 gag、pol、tat、rev，並具有 ampicillin 抗藥基因，
為包裹慢病毒必須之質體。 (由陽明大學 王學偉老師惠贈) pMD.G
帶有 CMV 啟動子以表現 VSV 套膜醣蛋白，為包裹慢病毒必須之質體。質體購 於中研院 RNAi core 核心設施。
pCMV” R8.91
帶有 CMV 啟動子以表現 HIV-1 Gag、Pol、Tat、Rev，為包裹慢病毒必須之質體。
質體購於中研院 RNAi core 核心設施。
pCMV.Tag2B
帶有 CMV 啟動子及 flag 標籤，並具有 neomycin 及 kanamycin 抗藥基因。
pCMV.Tag2B-p65
帶有 CMV 啟動子及表現帶有 flag 標籤的 p65 (RelA) 基因，並具有 neomycin 及 kanamycin 抗藥基因。
pCMV.Tag2B-IL32
帶有 CMV 啟動子及表現帶有 flag 標籤的 IL-32β 基因，並具有 neomycin 及
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kanamycin 抗藥基因。
pEGFP-C1
利用 CMV 啟動子表現綠色螢光蛋白(green fluorescent protein)之質體，具有 neomycin/kanamycin 抗藥基因。
pEGFP-N1
利用 CMV 啟動子表現綠色螢光蛋白(green fluorescent protein)之質體，具有 neomycin/kanamycin 抗藥基因。(由中興大學 陳鴻震老師惠贈)
pEGFP-WT-PKCδ
利用 CMV 啟動子表現綠色螢光蛋白(green fluorescent protein)之質體及 WT-PKCδ，
具有 neomycin/kanamycin 抗藥基因。(由本實驗室 李恆煥學長惠贈) pEGFP-CF-PKCδ
利用 CMV 啟動子表現綠色螢光蛋白(green fluorescent protein)之質體及 CF-PKCδ，
具有 neomycin/kanamycin 抗藥基因。(由本實驗室 李恆煥學長惠贈) pEGFP-DN-PKCδ
利用 CMV 啟動子表現綠色螢光蛋白(green fluorescent protein)之質體及 DN-PKCδ，
具有 neomycin/kanamycin 抗藥基因。(由本實驗室 李恆煥學長惠贈) pGL2-Basic
帶有表現 Luciferase 報導基因載體，帶有 ampicillin 抗藥基因。
pGL2-WT Zp
以 BZLF1 基因啟動子接入 pGL2-basic 載體中，並表現 Luciferase 報導基因。帶 有 ampicillin 抗藥基因。(由本實驗室 李恆煥學長惠贈)
pGL2-Rp
以 BRLF1 基因啟動子接入 pGL2-basic 載體中，並表現 Luciferase 報導基因。帶 有 ampicillin 抗藥基因。(由本實驗室 許翠瑛老師惠贈)
pLKO.1-shLuciferase
表現抑制 luciferase mRNA 之 shRNA 慢病毒質體，目標序列為
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5’-CCTAAGGTTAAGTCGCCCT。購於中研院 RNAi core。
pLKO-shLMP1
為表現專一抑制 LMP1 mRNA 之 shRNA 質體，目標序列為 5’-GCTCTTATTGCTCTCTAT-3’。 (由本實驗室 蔡淑君學姐構築) pLKO-shIL-32
為表現專一抑制 human IL-32 mRNA 之 shRNA 質體。
clone3 的目標序列為 5’-GCAGGCCCTCTGGAAACAGTT-3’
clone5 的目標序列為 5’-GCAGGCCCTCTGGAAACAGTT-3’
(自中研院 RNAi core 購買) pLKO-shRelA
為表現專一抑制 human RelA (p65) mRNA 之 shRNA 質體。
clone1 的目標序列為 5’-CCCTGAGCACCATCAACTATG-3’
clone4 的目標序列為 5’-CACCATCAACTATGATGAGTT-3’
1.4 引子 (表一)
1.5 抗體 (表二)
二、 實驗方法
2.1 質體構築 (Plasmid construct)
設計含有適當限制酶切位之引子 (見表一) 以製備帶有特殊限制酶切位之目 標基因片段。以 300 ng 之質體為模板分別加入 0.2 µM 引子、0.2 mM dNTPs、1X HF buffer、及 2 unit phusion DNA polymerase，並以 ddH2O 將體積補至 100 µl 並 以 25 µl 分為四管進行聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR)。反應完
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利用 Gel/PCR DNA fragments extraction kit 進行 PCR 產物純化，並以適當限制酶 在 37 ℃切割至隔天。再利用 Agarose 膠體電泳作用分離目標基因，從膠體上切 下目標基因片段之 DNA 後，再以 Gel/PCR DNA fragments extraction kit 純化出目 標基因片段，以 50 µl ddH2O 回溶 DNA 並儲存於-20℃。欲切割之載體以適當限 制酶在 37 ℃切割至隔天，隔天加入 2 µl CIP 於 37℃作用 1 小時後，同樣以 Agarose 膠體電泳作用分離切割片段，並利用 Gel/PCR DNA fragments extraction kit 進行純化，以 50 µl ddH2O 回溶 DNA 並儲存於-20℃。
目標載體與目標基因片段以質量 1:6 之比例，取總量 300 ng 混合均勻，加入 1 unit T4 DNA ligase 和 1X T4 ligation buffer 並補 ddH2O 至體積為 50 µl，置於 16℃
水浴槽進行 DNA 接合作用 (ligation) 24 小時候完成質體構築。接合後之產物須 利用轉型作用作進一步篩選。
2.2 細菌轉型 (Transformation)
將 100 ng 質體 DNA 加入含有 100 µl 勝任細胞 (competent cell) 之 1.5 ml 微量離 心管，充分混合後置於冰上 15 分鐘，再置於 42 ℃ 水浴槽 60 秒，立即再置於 冰上 15 分鐘，加入 1 ml LB 培養液並充分混合後置於 37 ℃培養箱一小時，離 心 13200 rpm 一分鐘，去除上清液留下 100 µl 菌液，以微量吸管混合重新懸浮菌 液並加入在含有適量抗生素之 LB 固態培養基中，以塗菌用之玻璃珠將菌液均勻 塗抹在培養基上，置於 37 ℃培養箱 16 小時。
2.3 抽取大量質體 DNA (Maxi-preparation of plasmid) 採用 Geneaid Plasmid Maxi Kit
選取目標質體之菌株，接種於含有適量濃度抗生素之 3 ml 培養液內，於 37
℃培養箱以 170 rpm 震盪 8 小時。取 1 ml 培養完之菌液並種於含有適量濃度抗 生素之 200 ml LB 培養液，在 37 ℃震盪 16 小時。分裝菌液至 250 ml Beckman 離心瓶中，將菌液以 14000 rpm (Beckman JA-14)，4 ℃離心 5 分鐘，去除上清 液後加入 10 ml P1 溶液並以滴管打散細菌沉澱，接著加入 10 ml P2 溶液上下翻
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轉 20 次 (勿 vortex)，靜置室溫 5 分鐘後，再加入 10 ml P3 溶液上下翻轉 20 次，
並置於冰上 20 分鐘。離心 20000 rpm (Beckman JA14)、4 ℃離心 15 分鐘，將上 清液倒入新的 50 ml Beckman 離心管重複以 20000 rpm (Beckman JA25)，4 ℃離 心 30 分鐘，同時以 10 ml QBT 溶液洗滌過濾管柱。離心後將上清液倒入管柱中，
過濾完後以 30 ml QC 溶液清洗管柱兩次，接著以 15 ml QF 溶液回溶質體至含有 10.5 ml 2-propanol 新的 50 ml Beckman 離心管，上下翻轉混合後以轉速 20000 rpm (Beckman JA25.5)、4 ℃離心 30 分鐘，離心後將離心管倒扣再旋開離心蓋倒 出 2-propanol 上清液，倒扣在室溫風乾 15 分鐘，並以 1 ml 滅菌 ddH2O 回溶 DNA pellet，並分裝各 500 µl 至 2 個 1.5 ml 微量離心管，每管加入 1 ml 100% Ethanol 與 20 µl 3M Sodium acetate (NaOAc)於-80℃作用 24 小時析出 DNA，以轉速 13200 rpm 4℃離心 30 分鐘，去除上清液後各加入 1 ml 75% Ethanol 使 DNA pellet 重新 懸浮並使之無菌，以 13200 rpm，4 ℃離心 15 分鐘，去除上清液後風乾，以 150 µl ddH2O 回溶並儲存於-20℃。
2.4 分離 CD19+ B 細胞及建立 LCL 細胞株 (CD19+ B cell purification and LCL establishment)
2.4.1 分離周邊血液單核球細胞 (PBMCs)
由捐血中心取得之健康捐血者的白血球濃厚液 (White blood cells concentrate) 取 45 ml 倒入 50 ml 離心管中，以 1000 rpm (Beckman GS6R)，25 ℃離心 5 分 鐘，去除上層油脂及血漿後移至含有 100 ml FBS-free RPMI 的 75T 培養瓶，同時 以 30 ml FBS-free RPMI 清洗殘留於離心管內的白血球濃厚液回收至同一培養瓶，
混合後各取 30 ml 至含有 15 ml Ficoll-paque 之 50 ml 離心管 (離心管傾斜，緩慢 加入以避免破壞 Ficoll-paque 與白血球濃厚液分層之界線)。以 2400 rpm (Beckman GS6R)，20 ℃離心 30 分鐘。去除上層血漿，將中間白色單核球細胞層移至新的 50 ml 離心管，加入 FBS-free RPMI 補滿至 50 ml 進行清洗，以 2000 rpm (Beckman GS6R)，20 ℃離心 15 分鐘，去除上清液，重複此一步驟兩次，分別逐步降低離
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心轉速、溫度及時間為 1800 rpm、20°C、12 分鐘和 1500 rpm、4°C、5 分鐘，完 成三次離心後合成一管。以事先預冷之 10 ml purify buffer (2 mM EDTA, 0.1%
BSA in PBS)回溶細胞，計數細胞並將濃度調整為 5x107 /ml，即完成周邊血液單 核球細胞分離，接著進行 B 細胞純化。
取適量 CD19+ Dynabeads (Invitrogen, Carlsbad, CA)至 15 ml 離心管，加入等體積 purify buffer 清洗磁珠並置換成原來磁珠濃度後，接著取 25 µl 磁珠與 5x107 PBMCs 於 4°C 轉盤 (DISHUNG)轉速 12 rpm 作用 20 分鐘後，以 0.5 ml purify buffer 清洗磁珠四次，取適量含 10 % FBS 之 RPMI 培養液回溶磁珠。此時 CD19+ B 細胞會吸附於磁珠上，以每 1x107 B 細胞，加入 10 µl DETACHaBEAD 的比例，
將磁珠在室溫下以轉盤 (DISHUNG) 轉速 12 rpm 作用 60 分鐘釋放 B 細胞，以 適量含 10 % FBS 之 RPMI 培養液回溶磁珠四次，收取上清液至新的 15 ml 離心 管，即完成 CD19+ B 細胞之純化。
2.4.2 EB 病毒感染與 B 細胞轉型成 LCL 細胞株
將純化後之 B 細胞以含 10 % FBS 之 RPMI 培養液將濃度調整為 1x106/ml 並 加入 1 ml 於 12 孔盤中，加入 40 µl B95.8 EB 病毒液進行轉型作用，感染後 28 天得到細胞株即可為 LCL 細胞株。
2.5 細胞培養 (Cell culture) 2.5.1 細胞種類及細胞培養液
(1) LCL 細胞株由 EB 病毒感染 CD19+ B 細胞而來 (2) Akata 細胞為柏金氏淋巴瘤建立之細胞株
(3) Human Embryonic Kidney (HEK) 293T 細胞為 293 細胞表現 SV40 之 large T 抗 原轉形而來的細胞株，被廣泛用於轉染質體的接受細胞
RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 培養液 (Hyclone, South Logan, UT)
21
和 DMEM (Dulbecco modified Eagle medium；Hyclone, South Logan, UT)培養液中，
皆內含 10% 胎牛血清 (fetal calf serum，FCS；Hyclone, South Logan, UT)、1 mM L-Glutamine (Merck, Germany)、100 U/mL penicillin (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA) 和 100 µg/mL streptomycin (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA)。
2.5.2 培養方法
所有細胞株皆培養於 37 ℃和含 5 % CO2 之培養箱內，每次繼代前須將細胞 培養液置於 37 ℃水浴槽預先溫熱。
1. 懸浮細胞
淋巴細胞為懸浮性細胞，當細胞生長達到八至九分滿時，吸取細胞培養液至 15 ml 離心管，以 750 rpm，室溫離心 5 分鐘，去除上清液，再以適量培養液稀 釋後繼續培養。
2. 單層附著細胞
當細胞生長達到八至九分滿時，先吸取並丟棄原有的細胞培養液，先以 1x PBS-EDTA 沖洗細胞一次，再加入適量的 1% 胰蛋白酶 (trypsin) 進行胰蛋白水 解作用，靜置 37 ℃培養箱 5 分鐘後，再以細胞培養液中和胰蛋白酶並回溶細胞 置於 15 ml 離心管，以 750 rpm，室溫離心 5 分鐘後去除上清液，再以適量培養 液稀釋後繼續培養。
2.6 細胞轉染 (Transient transfection)
進行細胞轉染前，將培養中的細胞以胰蛋白酶單離化後，計數細胞將 1 ml 含適量數量之細胞分配至 6 孔盤或 12 孔盤，混合均勻後置於 37 ℃培養箱 24 小 時。
LipofectamineTM 2000
22
利用細胞計數器計數細胞並稀釋至 1x105 /ml 細胞，取 1 ml 至 12 孔盤中，
隔天轉染前一小時將原培養液置換為 1 ml FBS-free DMEM。欲轉染之質體與 LipofectamineTM 2000 以 1 µg : 1.5 µl 之比例分別與適量 Opti-MEM 培養液混勻後 於室溫靜置 5 分鐘，再將二者混合，於室溫靜置 20 分鐘。之後吸除原有培養液，
均勻滴入質體 Opti-MEM 混合液，於 37℃培養箱作用 4-6 小時，再將質體混合液 置換為新的含 10 % FBS 之 DMEM 繼續置於 37 ℃培養箱 72 小時。
NTR II
利用細胞計數器計數細胞後並稀釋至 1x105 /ml 細胞，取 1 ml 至 12 孔盤中 隔天進行轉染，將目標質體與適量 Opti-MEM 混合，以質體與 NTR II 為 1 µg : 2 µl 之比例混勻後於室溫靜置 20 分鐘。均勻滴入質體 Opti-MEM 混合液後置於 37
℃培養箱轉染 72 小時。
2.7 慢病毒製備 (Lenti-virus preparation)
放置 8 至 9 成滿的 HEK 293T 細胞於 10 公分培養皿或 75T 培養瓶中，隔天 以 lipofectamine-2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 進行轉染，轉染前一小時將培養 液置換成 9 ml FCS-free DMEM 培養液。包裹帶有表現質體的慢病毒，取 6 µg p8.91 質體、3 µg pMD2.G 質體和 9 µg 構築於 pSIN 或 pCDH 載體之質體至 4 ml OPTI-MEM 中進行轉染。包裹的慢病毒為 mRNA 降解的 shRNA 質體，將 8.1 µg pCMVdeltaR8.91 質體、0.9 µg pMD.G 質體和 9 µg 構築於 pLKO.1-puro 載體之 shRNA 質體轉染至細胞中。轉染步驟同實驗方法 2.7。轉染 16 小時後，更換含 1% BSA 之 complete DMEM 培養液 11 ml，於轉染後 48 及 72 小時收取培養液並 以 0.22 µm 過濾膜過濾，分裝並儲存於-80°C。
2.8 慢病毒感染 (Lenti-virus infection)
慢病毒液主要用轉導目標質體於懸浮細胞中。利用細胞計數器將適量細胞置 於 6 孔或 12 孔盤中，依實驗設定均勻加入所需之病毒感染劑量 (Multiplicity of
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infection, MOI)，加入慢病毒液後以 2250 rpm (BECKMAN GS6R)，室溫離心 30 分鐘，再置於 37 ℃培養箱中培養。
2.9 西方墨點法 (Western Blot)
2.9.1 蛋白質樣本萃取
吸取細胞至 1.5 ml 微量離心管，並以 13200 rpm 轉速，4 ℃離心 1 分鐘，先去除 上清液後加入 1 ml 1x PBS 清洗並沖散細胞，再以 13200 rpm 轉速，4 ℃離心 1 分鐘，去除上清液後以適量 RIPA buffer (50 mM Tris-HCl, pH7.5, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL or NP40, 0.1% SDS, 1% sodium deoxycholate, 1X protease inhibitor cocktail (Roche, Indianapolis, IN), 50 mM NaF, 8 mM Na3VO4)回溶細胞。
RIPA buffer 回溶後所得之細胞蛋白質萃取樣本，先利用超音波以間隔 2 秒、震 盪 2 秒的方式進行震盪 (UP400A Sonicor)，重複 10 個循環後，再將蛋白質萃取 樣本於以 13200 rpm 轉速，4℃離心 30 分鐘，收取上清液至新的 1.5 ml 離心管，
並儲存蛋白質樣本於-80℃。
2.9.1 蛋白樣本配製
取 10 µg 蛋白質至 0.6 µl 微量離心管，加入 4X Sample loading dye (內含 2-Me，
17 µl/ml)，以 RIPA buffer (4 ℃)調整體積至 12 µl 後，於 95 ℃加熱 10 分鐘始蛋白 質變性得到蛋白質樣本。
2.9.2 西方墨點法
先將製作膠體之玻璃模組架起，配置分離層為 10 % 的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯 醯 胺 膠 體 電 泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis ， SDS-PAGE)，將膠體固定於電泳槽中，並加入 running buffer (3 mg/ml Tris, 18.8 mg/ml glycine, 1 mg/ml SDS, pH=8.3)，再將上一步驟預先配置的蛋白質樣本注入，
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先以 80 伏特電壓進行電泳，直到蛋白質樣本聚集於上下層膠體界面時，改為 150 伏特繼續進行電泳。待樣本之蛋白質分離至適當距離後，先以甲醇(Methanol)活 化 PVDF 轉漬膜，再將膠體從電泳槽拆下，小心將活化後之 PVDF 轉漬膜覆蓋 上，再與濾紙、海棉墊片以夾層之方式置入卡夾中，將卡夾放置於電泳轉漬器中，
加入適量 transfer buffer (3 mg/ml Tris, 18.8 mg/ml glycine, 20% methanol, pH=8.3)，
以 300 mA 進行電流進行轉漬作用 (electrotransfer) 90 分鐘。轉漬完成後以 Fast Green 將完成的轉漬膜進行 30 秒染色，以 ddH2O 潤洗後將轉漬膜置於 5% blocking buffer (5% skin-milk in 0.01 M Tris pH=7.4, 9 mg/ml NaCl, 0.2% Tween-20) 中，在 室溫中以 50 rpm 轉速之震盪器作用 1 小時。加入專一性抗體 (配置於 0.2%
sodium azide in 0.5% blocking buffer) 放置於 4°C 作用隔夜。隔天以 washing buffer (0.01 M Tris pH=7.4, 9 mg/ml NaCl, 0.2% Tween-20) 清洗 3 次，每次 5 分鐘，再 加入配置於 5 % blocking buffer 中帶有 horseradish peroxidase (HRP) 的次級抗體 於室溫作用 1 小時後，以 washing buffer 清洗 4 次，每次 10 分鐘，接著利用 Western LightingTM chemiluminescence reagent plus 進行冷光反應，以 X 光片 (Fuji, Shizuoka, Japan)偵測蛋白質表現量。西方墨點法所使用之抗體資訊列於實驗材料 1.4。
2.10 螢光酵素報導分析 (Luciferase reporter assay)
貼附性細胞 HEK293T 利用細胞計數器計數後，取 1 ml 含 1x105顆細胞至 12 孔 盤中，並置於 37 ℃培養箱培養。隔天將需要轉導之質體與 NTR II 以 1 µg : 2 µl 的 比例加入在 60 µl 的 Opti-MEM 溶液中，在室溫中靜置 15 分鐘後進行轉染，再將 轉染中細胞置於 37 ℃培養箱培養 72 小時。每組樣本進行二重複實驗。
72 小時候，將細胞收取至 1.5 ml 離心管，以 4℃的 1x PBS 清洗後，再以 100 µl FBS-free RPMI 重新懸浮並打散細胞，取 50 µl 至白色不透明之 96 孔盤，各加 入 50 µl Bright-Glo® Luciferase Substrate 混合均勻後，以微盤式閃爍冷光分析儀 (PerkinElmer TopCount)測定冷光讀值，並以酵素免疫微量計數器 (Molecular
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Devices SpectraMax M5)以波長 485 nm – 538 nm 之波長測定 GFP 讀值。剩餘約 50 µl 細胞萃取蛋白質，以西方墨點法進行分析。
2.11 免疫染色質沉澱法(Chromatin immunoprecipitation)
將帶有 pSIN 載體和 pSIN-LMP1 以慢病毒感染方式轉染至 Akata 細胞，轉導 EB 病毒 LMP1 到 Akata 細胞，6 天後收取細胞。先取約 5 ml 少部分的細胞以 RIPA buffer 萃 取 蛋 白 質 ， 之 後 進 行 西 方 墨 點 法 分 析 ， 剩 餘 的 細 胞 以 1% 甲 醛 (formaldehyde) 室溫下反應 15 分鐘使蛋白質及 DNA 交叉結合 (cross-link)，再以 0.125M Glycine 室溫作用 15 分鐘中和甲醛所作用的交叉結合反應。將細胞以 1500 rpm (Tsiangtai RS-50 centrifuge)轉速，室溫離心 5 分鐘將細胞收取至 50 ml 離心管 (細胞容積大於 50 ml 則需離心數次)，以 50 ml 預冷之 PBS 清洗 4 次，以 1000 rpm 轉速，室溫離心 5 分鐘，去除上清液後以 5 ml cell lysis buffer (5 mM HEPES pH=8, 85 mM KCl, 0.5% IGEPAL, fresh prepared with 1 mM DTT, 1X protease inhibitor, 0.1 mM PMSF) 回溶細胞並從 50 ml 離心管移至 15 ml 離心管，於 4°C 以 6 rpm 旋轉 (DISHUNG) 作用 30 分鐘後，以 1500 rpm (Tsiangtai RS-50 centrifuge) 轉速，
室溫離心 5 分鐘，去除大部分上清液留剩下 1 ml 之上清液，再移至 1.5 ml 微量 離心管， 以 13200 rpm 轉速，4°C 離心 10 min 後將上清液吸乾，剩下的細胞核 以 600 µl nuclei lysis buffer (50 mM Tris pH=8, 10 mM EDTA, 1% SDS, fresh prepared with 1 mM DTT, 1X protease inhibitor, 0.1 mM PMSF, 0.1 M NaF, 1 mM Na3VO4) 回溶，置於冰上作用 30 分鐘後保存於-80°C。接著以超音波 (Utrasonic professor up 400A，Sonicor) 震盪將 DNA 打碎，震盪條件為 : On 5 秒、Off 10 秒、強度 3-4、output = 40 %，共作用 48 回。震盪完後以 13200 rpm 轉速，4 °C 離心 10 分鐘後收取上清液，並以 1 % Agarose 膠體注入 1 µl 之細胞核樣本測得 DNA 片段約 500-1000 鹼基對的小片段，另外取 1 µl 進行蛋白質定量。
取 400 µg 蛋白質分別加入 1 µg 抗 NF-κB p65 抗體及陰性對照組 rabbit IgG，
另外取 10 分之 1 的的蛋白質 40 µg 做為 ChIP 的總輸入量 (input)，先存放於-80°C。
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欲進行 IP 的組別以 IP dilution buffer (16.7 mM Tris pH=8, 167 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, fresh prepared with 1 mM DTT, 1X protease inhibitor, 0.1 mM PMSF, 0.1 M NaF, 1 mM Na3VO4) 將總體積補至 800 µl，以 6 rpm 轉速旋轉 (DISHUNG) ，4°C 作用至隔天。隔天加入 150 µl 20% slurry protein A beads (GE, Sweden)，以 6 rpm 轉速，4°C 旋轉 2 小時，再以 8000 rpm 轉速，4 °C 離心 20 秒，去除上清液後收取磁珠。磁珠依序以 1 ml RIPA wash A buffer (50 mM Tris pH=8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% IGEPAL, 0.1% SDS, 1% deoxycholic acid) 清洗 2 次、RIPA wash B buffer (50 mM Tris pH=8, 300 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1%
IGEPAL, 0.1% SDS, 1% deoxycholic acid) 清洗 2 次、LiCl wash buffer (50 mM Tris pH=8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 300 mM LiCl, 1% IGEPAL, 0.1% SDS, 1%
deoxycholic acid) 清洗 2 次、TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris pH=8) 清洗 3 次。
清洗時需注意不可直接將各溶液直接沖洗磁珠，每次沖洗後以 6 rpm 轉速於 4°C 旋轉 5 分鐘後再以 13200 rpm 轉速，4 °C 離心 20 秒後去除上清液。
清洗完磁珠並去除上清液後，接著加入 150 µl elution buffer (fresh prepared with 50 mM NaHCO3, 1% SDS) 於 37°C 水浴槽作用 1 小時使抗體與磁珠分開，
重複此步驟 2 次後可收集到 300 µl 的產物。另外取出 input 同樣以 elution buffer 以體積補至 300 µl，各組別每管加入 10 µg RNase 及 300 mM NaCl，於 67°C 水 浴槽作用隔夜，將 DNA-蛋白質複合物的交叉結合消除 (de-crosslink)。隔天各組 別每管加入 1X PK buffer (50 mM Tris pH=7.5, 25 mM EDTA, 1.25% SDS) 及 450 µg proteinase K，於 37°C 水浴槽作用 2 小時使與 DNA 結合之蛋白質衰解 (degrade)。
加入等體積之 phenol/ chloroform/ IAA 350 µl 後劇烈搖晃，室溫靜置 2 分鐘 使水層及有機層分層，再以 13200 rpm 轉速，4 ℃離心 15 分鐘，吸取 300-350 µl 水層後加入 2 倍體積之 100% 酒精、1/10 體積之 3M NaOAc 及 20 µg Glycogen，
於-80 °C 作用至隔夜沉澱 DNA，再以 13200 rpm 轉速，4 °C 離心 15 分鐘、去除 上清液後以 1 ml 75 % 酒精清洗 DNA 沉澱物，因 pellet 通常很細小，要小心避
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免吸掉，再以 13200 rpm，4 °C 離心 10 分鐘後，將得到的 DNA 風乾，以 20 µl ddH2O 回溶 DNA pellet。
得到的 DNA 以聚合酶酵素連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 進行 放大反應。取 0.33% input 或 3 µl ChIP DNA，加入 0.2 µM 正向及反向引子、0.4 mM dNTPs、1X PCR Gold Buffer、2.5 mM MgCl2、1.25 units AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems, Foster City, CA)，以 ddH2O 將體積補至 25 µl 進 行 PCR (Biometra T3 thermocycler)。
論文中使用之 pIL-32 PCR 反應條件為：(1) 95 °C 5 min’ (2) 95 °C 30 sec’
(3) 60 °C 30 sec’ (4) 72 °C 30 sec (第 2 到第 4 步進行 34 循環) ’ (5) 72 °C 5 min
’ (6) 4℃。pGAPDH PCR 反應條件為：(1) 95°C 5 min’ (2) 95°C 30 sec’ (3) 55°C 30 sec’ (4) 72°C 30 sec (第 2 到第 4 步進行 31 循環) ’ (5) 72°C 5 min ’ (6) 4℃。
2.13 細胞質&細胞核分離法(Cytosotic and nuclear fractionation)
依實驗所需收取適量細胞至 15 ml 或 50 ml 離心管 (因細胞培養液容積不同 而定)，1000 rpm 轉速，室溫離心 15 分鐘收取細胞，去除上清液後，再以 1x PBS 清洗細胞並移至 1.5 ml 離心管，取 1/3 數量的細胞以 RIPA 溶液回溶做為 input 正控制組，2/3 數量的細胞留做細胞核質分離，各組以 13200 rpm，4℃離心 1 分 鐘並去除上清液得到細胞樣本。細胞核質分離的細胞樣本，以使用前加入 1x protease inhibitor 之 Buffer A (10 mM HEPES pH=7.9, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 % IGEPAL)共 200 µl (依細胞數量而定)沖散細胞，並置於冰上 30 分鐘，再以 13200 rpm 轉速，4℃離心 10 分鐘，收集上清液至新的 1.5 ml 離心管，此上清液 為細胞質樣本，離心後之沉澱物以 Buffer A 打散清洗 3 次，每次清洗後以 13200 rpm 轉速，4℃離心 5 分鐘並去除上清液，再以 200 µl 之 Buffer B (20 mM HEPES pH=7.9, 0.4 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol)回溶細胞核沉澱物，並以超音波 震盪將細胞核沉澱物打散，樣本置於冰上 30 分鐘後，得到細胞核樣本。之後利
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用西方墨點法偵測各核質樣本的分離產物。
2.15 活細胞增生測量 (Alamar blue assay)
以細胞計數器計數細胞後，稀釋細胞濃度至 1x105/ml 並取 100 µl 細胞至透明 96 孔組織培養盤中，每組樣本重複置入三格進行三重複實驗，再將細胞置於 37 ℃ 培養箱培養。各組別之細胞分別於第 0、24、48、72 及 96 小時各加入 10 µl AlamarBlue®，置回 37 ℃培養箱培養 4 小時後以可見光分光光譜儀 (Beckman Coulter DU 730, 位在第一共同研究室, 14 樓)測定樣本於波長 570 nm 與波長 600 nm 之吸光值，並套用公式算出各組別氧化還原程度
2.16 RNA 純化 RNA extraction
將細胞培養液去除後，以 1x PBS 清洗細胞並將樣本收集至 1.5 ml 離心管，
再以 1 ml TRIzol 溶液將細胞打散 (此步驟後可將 TRIzol 回溶之樣本保存在-80
℃數月)，再加入 200 µl 氯仿 (chloroform；Merck)並劇烈搖晃 30 秒，室溫靜置 2 分鐘後以 13200 rpm 轉速，4℃離心 15 分鐘，離心後會分為上下兩層，上層為透 明含 RNA 之水層，下層為紅色含 DNA 及細胞蛋白質之有機層。小心吸取上層 溶液，約可吸取到 400-450 µl 的水層樣本，並移至新的 1.5 ml 微量離心管，並加 入等體積的異丙醇 (isopropanol；J.T. Baker)，混合均勻後置於室溫 20 分鐘沉澱 RNA，再以 13200 rpm 轉速，4℃離心 20 分鐘，可見白色果凍狀的 RNA 沉澱，
倒去上清液後加入 l ml 75% 酒精 (以 DEPC 水稀釋) 清洗沉澱物，再以 13200 rpm 轉速，4℃離心 20 分鐘，小心吸乾上清液後，於室溫倒扣風乾 10-15 分鐘，
不可將 RNA 沉澱物風乾至 pellet 變成透明，太乾的 RNA pellet 以 EDPC 水難以 回溶，風乾後加入 20 µl DEPC 水，於 60°C 作用 10 分鐘以幫助 RNA 回溶，得到 的 RNA 樣本保存於-80°C 冰箱，也可直接進行反轉錄作用。
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2.17 反轉錄作用 Reverse transcription
取 2.5 µg RNA，加入 1 µl random primer (One-Star, Taiwan)後以 DEPC 水將 體積調整為 10 µl，並於 95°C 作用 90 秒將 RNA 的二級結構打開，馬上置於冰上 1 分鐘，再置於室溫 10 分鐘以利引子和 RNA 結合，加入各反轉錄作用所需之溶 液，10 mM DTT (Promega, Madison, WI)、1X M-MLV RT buffer、0.125 mM dNTPs (Protech, Taiwan)、及 200 units M-MLV reverse transcriptase (Promega, Madison, WI) 後，調整總體積為 25 µl，並於 42°C 作用 90 分鐘及 70°C 10 分鐘，得到的 cDNA 產物，以 ddH2O 將 cDNA 樣本稀釋 10 倍並保存於-20℃冰箱。
2.18 聚合酶酵素連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR)
取適量的 cDNA 樣本作為模版置於 0.2 µl PCR 反應管，並加入 0.2 µM 正向及反 向引子、0.375 mM dNTPs、1X reaction buffer、及 1.4 units prozyme (Protech, Taiwan)，以滅菌之 ddH2O 將體積補至 10 µl 進行聚合酶酵素連鎖反應 (Biometra T3 thermocycler)。產物視片段大小以含有 EtBr 之 1-2% agarose 進行電泳，再利 用紫外光照射顯像 (BioDoc-It 220 Imaging system；UVP, Upland, 位在第一共同 研究室, 14 樓)。PCR 使用之引子序列及其使用條件請見表一。
IL-32 反應條件如下：(1) 95°C 5 min’ (2) 95°C 30 sec’ (3) 65°C 25 sec’ (4) 72°C 30 sec (第 2 到第 4 步進行 26 或 28 循環) ’ (5) 72°C 10 min。
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第三章 實驗結果 一、 IL-32 在 EB 病毒感染後之 B 細胞的表現情形
EB 病毒感染 B 細胞，可利用其病毒 RNA 或蛋白調控宿主細胞的訊號傳遞路 徑及轉錄因子，進而影響 EB 病毒基因及宿主本身基因的表現，最後造成 B 細胞 的增生、活化及不朽化等現象，形成 LCL。本實驗室蔡淑君博士先前利用 cDNA 微陣列分析 (附錄一)，比較初代 B 細胞經 EB 病毒感染 0、3、7 及 28 天這些不 同時間點中 B 細胞內各基因的變化，EB 病毒感染 28 天後即定義此 B 細胞為不 朽化的 LCL，發現其中一種細胞激素，白細胞介素-32 (interleukin-32, IL-32)的表 現量有隨著 EB 病毒感染的時間增加而增加。
為了進一步驗證 cDNA 微陣列分析的結果，本實驗室自捐血中心取得一位健 康捐血者之白血球濃厚液，以 CD19+ 磁珠純化出 B 細胞後再以 B95.8 strain EB 病毒感染，收取感染 0、1、2、3、7、14、21 及 28 天之 B 細胞的 RNA 及蛋白 質樣本進行分析，發現 IL-32 不論是在 RNA 或蛋白質的表現皆在感染後第 7 天 才有些微的上升，直到感染兩周 (14 天) 後 IL-32 的 RNA 及蛋白質表現才有非 常顯著的提升，直至感染 28 天後 B 細胞不朽化成 LCL，IL-32 的表現量相較於 初代 B 細胞在 RNA 層面上表現量大約上升 100 倍，以西方墨點法偵測蛋白質的 表現量方面也有明顯的上升，另外隨著感染天數的增加，各 EB 病毒蛋白的表現 量，例如 EBNA 及 LMP1 也有隨時間增加而上升，顯示 EB 病毒有成功感染 B 細胞，而 IL-32 在 RNA 及蛋白質的表現皆依感染天數而逐步上升的趨勢 (圖四)。
為了更進一步釐清 EB 病毒感染後 IL-32 上升的現象非個體之 B 細胞的差異所引 起，本實驗室再從捐血中心取得四位健康捐血者之白血球濃厚液，同樣以 CD19+ 磁珠純化出個別之 B 細胞後再以 B95.8 strain EB 病毒感染 28 天，收取四株不同 捐血者之 LCL 的蛋白質樣本，經西方墨點法分析後發現，IL-32 皆在 4 株 LCL 中有大量表現的現象，為了證實 EB 病毒感染是否成功，除了偵測目標基因 IL-32 之外，也偵測 EB 病毒蛋白 EBNA1 及 LMP1 的表現 (圖五)。
由於先前研究顯示 IL-32 通常是位在細胞質內，極少位在細胞外，本實驗室
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劉怡學姐以免疫螢光染色法偵測 IL-32 蛋白質在 LCL 中的分布情形，先將 LCL 細胞株置於 12 孔載玻片上，經過風乾、固定及穿孔後將 IL-32 抗體與之作用，
另以 PBS 做為陰性控制組，以螢光顯微鏡觀察後發現，相較於控制組別大部分 的 IL-32 蛋白質皆表現在 LCL 的細胞質中 (附錄二)。接著進一步利用細胞核質 分離法，將兩株 LCL 的細胞核以及細胞質分離並收集各核質蛋白質樣本，以西 方墨點法偵測 IL-32、PARP 及α-tubulin 的表現，發現表現的 IL-32 主要位在細胞 質中。PARP 為偵測細胞核樣本內控制組，α-tubulin 則為細胞質樣本內控制組 (圖六)。
二、 EB 病毒 LMP1 能活化 IL-32 的 mRNA 及蛋白質的表現
從圖四及圖五可以觀察到 IL-32 表現量在 EB 病毒感染後之 B 細胞會有明顯 的上升，進一步為了釐清 EB 病毒感染 B 細胞活化 IL-32 的表現是透過病毒的何 種蛋白，本實驗室周雅菁博士，在柏金氏淋巴瘤細胞株 Akata 中以電穿孔的方 式送入 EBNA1、LMP1、LMP2A、Zta 或 Rta 等表現質體，轉導各 EB 病毒基因 至 Akata 細胞，3 天後收取細胞蛋白質以及 RNA 進行分析，而本實驗室劉怡學 姐利用 RT-qPCR 偵測 IL-32 mRNA 的表現，以西方墨點法偵測 IL-32 及各 EB 病 毒蛋白的表現情形，發現只有在表現 LMP1 的情況下才能明顯的誘導 IL-32 的表 現，其餘的 EB 病毒蛋白表現時，相較於載體控制組 IL-32 的表現則沒有明顯的 上升，為了確認各 EB 病毒在轉導各表現質體後在 Akata 細胞確實能表現，以西 方墨點法同時確認各 EB 病毒確實能在 Akata 中表現，且各基因表現量 0 並無明 顯差異 (附錄三)。
目前已知 EB 病毒除了感染 B 細胞之外，也能感染人類上皮細胞，為了釐清 在上皮細胞中 EB 病毒是透過何種蛋白調控 IL-32 的表現，首先在人類腎臟上皮 細胞株 HEK 293T 及人類鼻咽癌細胞株 TW01 中，分別以 Lipofectamine 2000 試 劑轉染 EBNA1、EBNA2、LMP1、LMP2A、Rta 或 Zta 的表現質體，轉導各 EB 病毒基因至上皮細胞株，2 天後收取細胞之 RNA 及蛋白質進行實驗分析，利用
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