3-1 目標基因建構與鑑定 3-1.1 基因載體的來源：
本實驗所建構的六個基因裡 (CDC20、PP2A substrate B55、Histone 4j、RPS10A、
CDC14A、與 BCL2A1)，CDC20、PP2AB55與 Histone 4j 三株基因載體來自本學院 內的Gene library。PP2A 來源質體為 pCMV-SPORT6，標記基因 (Selection Marker) 為Ampicilin 抗體；CDC20 與 Histone 4j 則為 pOTB7，標記基因為 Chloramphenicol。
CDC14A 與 RPS10A 則是利用實驗室自行設計的基因引子，由 MCF7 細胞抽取而出
Tm 值介於 55 - 80°C；需避免自我黏結 (self-annealing)、Hairpin 與 False priming 的 產生[103]。為了達到以上的要求，我們使用 Primer Premier 5.0 (PREMIER Biosoft) 的軟體輔助我們設計出適合的引子，同時為了達到理想引子的要求，會在某些引子 上做silent mutation。除了注意這方面的問題外，須考慮到接合後的基因片段是否為 正確的密碼子排序序列，方能正確讀到表現基因片段的終止密碼子。實驗室設計之 引子序列如下，紅色標示為silent mutation 的部分，標線部分則為起始密碼子。
H4j
Forward primer 5’-CTC CTA TTG CTC GTA ATG TCC-3’
Reverse primer 5’-GA AAA GGA CGC TCA ACC AC-3’
PP2AB55 fp(466)20: 5’-ACG CAA GTT AGC CTG CTG TC-3’
PP2AB55 rp(1827)22: 5’-CTT GTC CAC TCA GTT GAC CTT G-3’
CDC14a fp(37)18: 5’-TCC CCA GTG CGT ATT TCG-3’
CDC14a rp(655)21: 5’-T TTA GCC TCA CAG TTG CAG TC-3’
CDC20 fp(82)18: 5’-ATG GCA CAG TTC GCT TTC-3’
CDC20 rp(1597)19:5’-G ATG GTG GGT TGG TCT TCA-3’
DnaJ fp(40)18: 5’ –ATG GCA TCC TAC TAC GAG-3’
DnaJ rp(906)18: 5’-ACT GTG AAG CGA TTC AGG-3’
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BCL2A1 fp (183) 5’- ATG ACT GAC TGT GAG TTC GG-3’
BCL2A1 rp (675) 5’- GTT ACA AAG CCA TTT TCC TG-3’
S10 fp(66) 21 5’-GAG ATG TTG ATG CCG AAT AAG-3’
S10 rp(567) 21 5’-TCT ACT GAG GAG GCT GAC CAC-3’
3-1.3 表現質體之建構
本實驗室利用兩種方式建構各個表現蛋白質：TA cloing 與酵素酶切。TA cloning 主要是利用Taq 聚合酶特殊性質，能在 72°C 環境下，在合成的基因 3’尾端加上腺
本實驗室建構之pET30a-EAM 質體，可利用 EAM (New England Biolab)酶切的 方式，在質體3’端產生未配對的胸線嘧啶核苷酸(Thymidine)，稱為 T vector。接續 利用實驗室設計之引子，利用Taq 聚合酶 (Protech)的特性，使得在聚合酶連鎖反應 之基因片段尾端產生一個未配對的腺嘌呤 (Adenine)核苷酸。最後以 T4 DNA 連接 酶 (Roche)連接 T vector 與預表現之基因，產生一個可表現目標蛋白質的質體(詳見 圖 8)。實驗上，Histone 4j、PP2A、CDC20、CDC14a、RPS10a 與 BCL2A1 皆是以 此方式接到表現的質體上。
*Taq Polymerase Buffer 10X 2 l
Taq (5 U/l) 0.5 l
*內容含100 mM Tris-HCl，pH 9.0，500 mM KCl，0.1% gelatin，15 mM MgCl2，1% Triton X-100 Note：所使用的溫度中，Histone 4j：51°C；PP2AB55：50°C；CDC20：50°C；CDC14a：52 C；RPS10a：
15 圖 8 TA cloning 流程圖
限制酶切 cloning (Enzyme Digestion)
在我們欲建構的基因中，BCL2A1 是請廠商以基因合成技術為我們合成。其中 在BCL2A1 5’端加上限制酶 EcoRI，3’端加上 XhoI 切位。廠商將基因序列接於 pUC57 廠商質體中，此質體在大腸桿菌中並無可表現的啟動子，故需做進一步的sub-cloning 動作。我們利用5’端與 3’端有的限制酶切位，以特定的限制酶切下所需的基因，並 連接在以同樣限制酶切下的表現質體pET30a 內，轉殖入大腸桿菌 BL21 (DE3)中培 養並表現。
反轉錄 cloning
除了上述的clone 方式外，CDC14a 與 RPS10 是利用實驗室自行設計的引子，於 反轉錄過後的人類cDNA 上所建構的基因。引子資訊見 3-1.2。
實驗上的流程，我們以Trizol 試劑 (Invitrogen)破碎細胞抽取 Total RNA，以 UV 定量計算260/280 吸光值確認 RNA 純度後，以 MMuLV 反轉錄酵素將 RNA 反轉錄 為cDNA。MMuLV 是取自反轉錄病毒 (reverse-transcribing viruses)的酵素，會與 RNA 鍵結，將RNA 序列反轉錄為 DNA 的序列[104]。實驗上所加的成分與量值如下表：
16 RNAse free water To final volume 25 L 表 3 RT-PCR 用量表 硫代酥糖醇 (Dithiothreitol, DTT)以及 pH 值。尿素破壞蛋白質結構的原理目前尚未 得知，僅推測可能是破壞了蛋白質胺基酸間的分子間的疏水性作用力與離子性作用
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最低態，避開相轉變的區間，使蛋白質順利摺回自然態[106, 111]。
IPTG 誘導目標蛋白質大量表現
解凍含有目標基因之pET30a 質體的 BL21(DE3)菌種，取出適當體積加入 3 ml 的LB (含有 20 ng/mL Kanamycin)，於 37°C/200 r.p.m.震盪培養至隔天以活化菌種。
取活化過後的菌種250 ml 加入 250 ml LB (含 20 ng/ml Kanamycin)，37°C 震盪培養 四小時後，加入1 mM 的 IPTG 持續震盪 16 小時以誘導蛋白質表現。將培養完成的 菌液以12000g/3 分鐘離心以得到沉澱的菌體，以 1 ml 二次水回溶 (含有 0.1 mM Pefabloc)，放入高壓破菌機 (constant cell disruption system，)，以 30 kpsi 高壓破碎 菌體。將破碎菌液以13000g/15 分鐘離心，得到的沉澱物即為內涵體 (Inclusion body)，
持續以含有1 mM Pefabloc 的二次水回溶、離心至上清液完全澄清，使內涵體純度
Imidazole 將目標蛋白質清洗下來。此種純化方法優於 GST-tag 的一點是在變性狀態 下 (高尿素的環境下)的蛋白質，也具有吸附在 His-tag 樹脂的能力，可以節省許多 於二級抗體含有呈色酵素 (Horseradish peroxide，HRP)，能夠催化發光氨與 H2O2產 生冷光，使之能夠在底片上呈色。在蛋白質交互作用中，蛋白質的結構占了非常重
18 用。首先利用SDS-PAGE 分離目標蛋白質，接續以半乾式轉漬槽 (Semi-dry transfer system)將蛋白質轉漬到 PVDF 膜上。我們為了使蛋白質摺回自然態，會將轉漬完成 Mouse Anti-securin 一級抗體 (Santa Cruz Biotechnology)，於 4°C 下反應 16 小時，再 以TBST 緩衝液清洗五次(每次五分鐘)，最後加入稀釋 1/20000 倍的 Goat Anti-Mouse IgG-HRP 二級抗體(以 1% TBST 泡製的脫脂奶稀釋)，反應五十分鐘。反應完成後，
以TBST 緩衝液清洗五次 (每次五分鐘)後，添加 HRP 受質 (Millipore Corporation) 於轉漬膜上，以底片呈色。
3-4 Securin 磷酸化
我們利用Erk2 kinase (New England Biolab)對 securin 蛋白質做磷酸化。磷酸化 使用的條件如表 4。
Erk2 Kinase (10000 U/ml) 0.5 l
*10X Erk2 Kinase Buffer 5 l
10X Erk2 Kinase Buffer：500 mM Tris-HCl，100 mM MgCl2，20 mM DTT，1 mM EDTA，0.1 % Brij 35，
pH 7.5 (25 °C)
3-5 圓二色旋光光譜儀 (Circular Dichroism, CD)
本實驗室使用同步輻射的圓二色旋光光譜儀(Aviv 410)。影響圓二色光譜儀偵測 的因素包含溫度、樣品濃度與CD cell 寬度等條件。本實驗試樣品的偵測條件如下 表 5
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CD cell path length 1 mm
Wavelength 260 – 190 nm Temperature setpoint 25°C
Averaging Time 10 s Wavelength Step 0.5 nm Band Width 1 nm ellipticity []MRE(單位：deg．cm2．dmole-1/residues)，並使用 SELCON3 程式分析蛋 白質二級結構的比例。 的RPMI-1640 (Invitrogen)培養液的 10 公分培養皿培養至全滿後，分盤於六孔式細 胞培養皿內，待細胞長至八分滿，將細胞換至含0.1 % 胎牛血清培養液，使細胞處 於飢餓狀態24 小時，照射 4 kJ/m2的UVC 紫外光，再以含 10 % FBS 的 RPMI 細胞 培養液各別培養2、4、6 個小時。收取細胞於 Lysis buffer 中，以超音波震盪器裂解 細胞。接續以13000 g 離心 15 分鐘，收取上清液以 Bradford 定量，以西方墨點法辨 識Erk2、磷酸化 Erk2、p53、磷酸化的 p53、與 securin 蛋白質。
3-7 鎳離子導電 DNA 製備：
自1962 年華生 (James D. Watson)與克立克 (Francis Crick)解開DNA 雙股螺旋 結構[114]，數十年來許多科學家持續探討一個問題：DNA 是否能夠做為一個良好 的導電生物材料?截至目前，科學家提出的答案分歧，並沒有一個統合的理論說明
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DNA 是否為一個導電良材。有學者認為 DNA 分子間π-π鍵結足夠提供電子一個傳 導路徑[115]。1996 年，Barton 等人認為 DNA 螢光淬息效應 (Quenching effect)來自 於DNA 分子間電子傳遞所導致，因而推測 DNA 為導電分子[116]。然而實際上測量 的結果卻與這些理論互相違背[117, 118]，甚者，有人認為 DNA 是一個半導體[119]。
由於理論與實驗結果並不一致，因而有人嘗試在DNA 核苷酸配對間接上二價金屬
Bax Promoter Gene A: 5’-TCA CAA GTT AGA GAC AAG CCT G-3’
Bax Promoter Gene B: 5’-CAG GCT TGT CTC TAA CTT GTG A-3’
在Gene A 5’端特別接上了硫氫鍵 (-SH)，如此可與金電極表面硫氫鍵形成雙硫鍵。
21 圖 9 循環伏安法所施加的電位與時間變化示意圖[126]
我們對金電極施加一個隨時間改變的三角偏壓。圖中一次forward scan 加上 reverse scan 即代表一個 週期。
圖 10 循環伏安法氧化峰與還原峰示意圖
循環伏安法圖中，氧化與還原的峰值示意圖。圖中 Epc與 ipc表示陰極 (cathode)的峰電位與電流值；
反之，Epa與 ia則表示陽極 (anode)的峰電位與電流值。
電化學阻抗分析頻譜 (Electrochemical Impedance Spectroscopy, EIS)
電化學阻抗分析是個常用來分析電極表面的修飾方法，長期來其應用方面有腐 蝕效應 (corrosion)、電解沉積效應 (electro-deposition)、電池 (batteries)與燃料電池 (fuel cell)等[127-129]。而在生物感測方面，過去學者常利用此法研究反應電極表面 生物分子所覆蓋之厚度與緊密度[130]。此法原理是在電極上面施加一小正弦波電流，
由電極所在的溶液特性與電極表面修飾情況，會產生不同振幅與相位的電流。藉由
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分析電流上的變化，可以了解溶液氧化還原程度，以及電極上物質覆蓋程度。
關於導體在溶液介面上的電阻特性，則可以由Randles 等效電路 (Randles’
Equivalent Circuit)來擬合[131]。如圖 11 的電路圖，Rs表示溶液中的阻抗值，Qdl為 電雙層電容的電阻阻抗值，Rct則為溶液中離子轉移電子到電極表面上的等效電阻，
W0則為Warburg 等效電阻，代表意義為溶液中離子擴散至電極表面的等效阻抗。頻 譜分析上，通常會將阻抗的實部值做為X 軸，虛部值為 Y 軸。首先，施加一頻率的 交流電阻抗可由下列式子表示：
其中V0為電壓最大值，I0則為電流最大值，Z0為阻抗最大值，為角頻率(2πf)，ψ 則為相位差。而電路上的Qdl與W0與頻率的關係式可如下表示：
1 1
√2 1
此處n 為一介於 0~1 的常數。當 n=1 時，表示電雙層電容為一理想電容。n=0 時，
表示其為一個理想的電阻。若將這些阻抗表示式運算過後，取其實部與虛部做圖，
即為一般阻抗頻譜分析常用的Nyquist 分析圖。理想的分析圖形如圖 12。藉由此頻 譜我們可以了解電極上物質吸覆的厚度[132-134]。
而在分析DNA 電雙層電容的實驗上，我們加入一項參數為 Rs。此項參數所代表的
意義為：未接上DNA 的裸露金電極所給予溶液離子流通的阻抗值。一般說來，若
是在接DNA 的步驟反應完全，理論上 Rs值為遠大於Rct的電阻大小。如此，我們 可以利用Rs的大小判斷是否DNA 反應完全與否[125]。
圖 11 Bare gold 與 DNA Randles 等校電阻示意圖
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左圖為Randles 模擬裸金電極的等效電路圖，右圖則為加上 DNA 分子後的等效電路圖。此圖中， Rsol
為溶液中的電阻圖，Rs為離子經非DNA 而傳導至電極的阻抗值，Qdl則為電雙層電容，W0為Warburg 常數[125]。
圖 12 Nyquist 圖譜與其代表之物理量
由Nyquist 圖譜之 x 軸截距可得知溶液之阻抗 (Rsol)，半圓形的頂點對照頻率值可求得電容值(Cdl)，
而半圓型的直徑可求得R 值(Rct + Rsol)，而在低頻區可以求得 Warburg 係數。為角頻率。
我們利用實驗室所研發的金電極感測器，測量p53 與 Bax 啟動子作用力的關係。
製備的過程如下：
金電極製備：
實驗室所用來測量的金電極為直徑為 0.25 mm，長為 3.2 mm 的圓柱體。我們將 金電極以高溫1070 °C 烘烤 40 小時，之後緩慢降至室溫以讓金格排列整齊。接著 以1000、2000、3000、與 5000 的砂紙進行物理性的拋光，直到解剖顯微鏡下看不
見任何刮痕為止。接續將金電極放入二次水中超音波震盪15 分鐘，再以二次水潤洗
數次後，放入含有0.5 M 硫酸溶液中，以循環伏安法 (Cyclic Voltammetry, CV)進行
數次後，放入含有0.5 M 硫酸溶液中，以循環伏安法 (Cyclic Voltammetry, CV)進行