實驗結果

4-1 表現基因之建構及蛋白質表現

本實驗總共建構了六種蛋白質，各別為Histone 4j，PP2AB55b，CDC20，CDC14a，

RPS10a 與 BCL2A1。實驗室所使用的 clone 技術，包含了兩種：TA cloning 與酵素

酶切。我們首先將含有我們目標基因的載體質體，轉殖入DH5菌體內部，依照各

個基因的標記基因做篩選，並利用自行設計的引子做聚合酶反應進行確認。確認完 畢的菌株會以液態氮凍入-80°C 做保存。為了能夠在大腸桿菌裡面大量表現我們所 需的蛋白質，我們需將目標基因sub-clone 到 pET30a 質體內來達到表現目標蛋白的 目的。為此，我們利用TA cloning 與酵素酶切方式，將各個基因接入 pET30a 的質 體，並轉殖(transformation)入 BL21(DE3)品系的大腸桿菌。由於 TA cloning 是在基 因3'端處加上 A 核苷酸，也就是說無論在模股版 (Template strand)或是在非模股版 (non-template strand)上皆會有 A 核苷酸接位。然而模股版上的序列與基因序列是互 補性質，意即若是此股黏接在pET30a 質體的非模股板上，基因就會為反向序列(如 圖 14)。

圖 14 TA cloning 可能造成反序的示意圖

為了解決此問題，我們在篩選菌落上，以pET30a 質體上所具有的 T7 引子與自 行設計的引子來做確認是否有轉殖成功。如表 6 所列，我們成功地在各個菌落篩選 時得到我們所要的片段大小，而表現的質體pET30t 表示以 pET30a 為原始 clone 質 體，經由TA cloning 或是酵素酶切過後，黏合所需表現之基因而建構出的新表現質

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體。而在定序方面，如附錄所示，六株蛋白質當中，有三株有突變現象產生，各別 是Histone 4j、CDC14a、與 CDC20。其中 Histone 4j 的突變為基因第 47 的位置，由 GTTGCT，對應的胺基酸突變為 AV。CDC14a 則為第 215 序列上 GAA 突變為 GAG，但胺基酸序列並未改變，判定為 silent mutation。而 CDC20 有兩個突變點，

各別為序列第861 與 1423，為 TC 與 AT 突變，胺基酸則由 QL，與 LM。

BCL2A1 Gene synthesis + Enzyme digestion

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TA Cloning 結果：

Histone 4j:

本實驗將306 bp 長的 Histone 4j 基因，以 TA cloning 的方式，建構一個以 pET30a 為表現中心的質體，pET30t-Histone 4j(圖 15)。為避免反序，篩選時以 T7 forward 引子與Histone 4j reverse 引子確認 TA cloning 的正確性。見夠成功的基因片段大小 為456 bp(圖 16)。而在蛋白質表現方面，我們可以在內涵體中看到一條 17 kDa 的 預期表現片段(圖 17)。

圖 15 Histone 4j clone 表現質體

以TA cloning 的方式將 Histone 4j 連結到 pET30a 質體後的質體圖。圖中 H4j 即為表現的基因片段位 置，pET30t 表示 pET30a 質體經由酶切處理後的質體。

圖 16 Histone 4j TA cloning 結果。

成功黏合後的pET30t-H4j 質體轉殖到大腸桿菌後，挑選菌落後，以聚合酶反應做篩選。反應中，5’

端以T7 引子，3’端以 Histone 4j 引子做 PCR 篩選。M: Marker; N:不含質體的 PCR 樣品；H4j：挑選 的菌落，共兩株。預期的Histone 4j 片段為 500 bp (圖箭頭所示)。

29 圖 17 pET30t-H4j 蛋白質表現膠體圖。

以1 mM IPTG 培養 16 小時候，破菌取上清液 (supernatant)與內涵體 (pellet)跑蛋白質電泳後的結果 圖。圖中箭頭所指約18 kDa 的位置即為 Hitone 4j 表現後的大小位置。M: Marker，pET30a 為控制組 (control)。可以看到 pET30t-H4j 菌株在加入 IPTG 培養後，會清楚的有表現的片段跑出。

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PP2AB55:

本實驗將1236 bp 長的 PP2AB55基因，以 TA cloning 的方式，建構一個以 pET30a 為表現中心的質體，pET30t-PP2AB55(圖 18)。為避免反序，篩選時以 T7 forward 引子與Histone 4j reverse 引子確認 TA cloning 的正確性。見夠成功的基因片段大小 為1500 bp(圖 19)。而在蛋白質表現方面，我們在內涵體中看到一條 57 kDa 的預期 表現片段(圖 20)。

圖 18 pET30t-PP2AB55質體

以TA cloning 的方式將 PP2AB55連結到 pET30a 質體後的質體圖。圖中 PP2AB55即為表現的基因 片段位置，pET30t 表示 pET30a 質體經由酶切處理後的質體。

圖 19 PP2AB55 TA cloning 結果

成功黏合後的pET30t-PP2AB55質體轉殖到大腸桿菌後，挑選菌落後，以聚合酶反應做篩選。反應

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中，5’端以 T7 引子，3’端以 PP2A 引子做 PCR 篩選。M：Marker；N: Negative control，不含質體的 PCR 樣品；1-11:篩選的菌落編號。可以在 1、2、8、9、10 號菌落明顯看到預期的 PP2AB55片段：

1500 bp (圖箭頭所示)。

圖 20 PP2AB55蛋白質表現－上清液與內涵體

以 1 mM IPTG 表現 pET30t-PP2AB55菌株後，離心取上清液 (Supernatant)與內涵體 (Pellet)個別 觀察蛋白質表現的蛋白質膠圖。M: Marker。可以明顯看到在內涵體菌株看到 60 kDa 附近 (箭頭所示) 看到PP2A 蛋白質的表現。

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CDC20:

本實驗將1494 bp 長的 CDC20 基因，以 TA cloning 的方式，建構一個以 pET30a 為表現中心的質體，pET30t- CDC20 (圖 21)。為避免反序，篩選時以 T7 forward 引 子與Histone 4j reverse 引子確認 TA cloning 的正確性。見夠成功的基因片段大小為 16740 bp(圖 22)。而在蛋白質表現方面，我們在內涵體中看到一條 60 kDa 的預期表 現片段(圖 23)。

圖 21 pET30t-CDC20 質體

以TA cloning 的方式將 CDC20 連結到 pET30a 質體後的質體圖。圖中 CDC20 即為表現的基因片段 位置，pET30t 表示 pET30a 質體經由酶切處理後的質體。

33 圖 22 CDC20 TA cloning 結果。

成功黏合後的pET30t-CDC20 質體轉殖到大腸桿菌後，挑選菌落後，以聚合酶反應做篩選。反應中，

我們採用不同的primer 配對來確認質體的正確性。圖中 M：Marker；1：5’端為 T7，3’端為 CDC20；

2：5’端為 CDC20，3’端為 T7；3：兩端皆為 CDC20 引子。由於 5’端 T7 引子易與 CDC20 3’端引子

黏合，因此未在圖中看到PCR 片段。然而在其它配對上，都可以清楚看到正確的片段大小。預期片

段大小：CDC20 fp and T7 rp：1.6 kbp；CDC20 fp and CDC20 rp：1.5 kbp。圖中 P 為以 CDC20 fp 與 rp 對含有 CDC20 基因的 pOTB7 質體做聚合酶反應的結果，做為 Positive control (預期片段 1.5 kbp，

箭頭所示)。

圖 23 CDC20 蛋白質表現－上清液與內涵體

以 1 mM IPTG 表現 pET30t-CDC20 菌株後，離心取上清液 (Supernatant)與內涵體 (Pellet)個別觀察 蛋白質表現的蛋白質膠圖。M：Marker；Control 組為含有 pET30a 質體的菌。可以明顯在加入 IPTG 表現後的內涵體60 kDa 附近看到 CDC20 蛋白質的表現。

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RT Cloning 結果:

CDC14a 與 RPS10a 兩個基因片段是以 MMuLV 反轉錄酶反轉錄乳癌細胞 MCF7 RNA 而得到的基因片段。我們將反轉錄所得到的基因，以 PCR 方式放大，再以 TA cloning 的方式接到 pET30a 表現質體內。

CDC14a:

在反轉錄的實驗中，我們會各別確認Total RNA 量、與細胞內部 positive 基因，

GAPDH RNA 的表現，以確保 RNA 的品質。圖 24 中，RNA 會出現兩個片段，分 別位於3000 bp 與 1500 bp，各別為 28S RNA 與 18S RNA。而我們也明顯看到 positive 基因GAPDH 反轉錄成功 (500 bp 片段)。同時也在圖中看到 CDC14a 預期的片段，

594 bp。我們接續以 TA cloning 的方式建構 pET30t-CDC14a 的質體(圖 25)，也在 TA cloning 結果上，可看到篩選的片段 (744 bp，圖 26)。蛋白質表現上，也在內涵體 中看到36 kDa 的表現(圖 27)。

圖 24 CDC14a RT-PCR 結果：

以Trizol 試劑破碎 MCF7 細胞後，抽取 RNA，再反轉錄為 cDNA 後，以 CDC14a 引子做聚合酶反應 的結果。圖表中M: Marker; RNA：Total RNA 2 g，上方約 3000 bp 的 band 為 28S RNA，下方 1500 bp 片段則為 18 S RNA；N：聚合酶反應控制組，未加入 cDNA；CDC14a：以 CDC14a 引子做聚合 酶反應結果。預期的片段為700 bp，如圖中箭頭所示；GAPDH：RT-PCR 的 positive control。

28S RNA 18S RNA CDC14a GAPDH

35 圖 25 pET30t-CDC14a 質體

以TA cloning 的方式將 RT-PCR 夾出的 CDC14a 片段連結到 pET30a 質體後的質體圖。圖中 CDC14A 即為表現的基因片段位置，pET30t 表示 pET30a 質體經由酶切處理後的質體。

圖 26 CDC14a TA cloning 結果。

成功黏合後的pET30t-CDC14a 質體轉殖到大腸桿菌後，挑選菌落後，以聚合酶反應做篩選。反應中，

5’端以 T7 引子，3’端以 CDC14a 引子做 PCR 篩選。M：Marker；2-47：篩選的菌株編號。可以在 31、

47 號菌落明顯看到預期的 CDC14a 片段：950 bp (圖箭頭所示)。

36 圖 27 CDC14a 蛋白質表現－上清液與內涵體

以 1 mM IPTG 表現 pET30t-CDC14a 菌株後，離心取上清液 (Supernatant，左圖)與內涵體 (Pellet，

右圖)個別觀察蛋白質表現的蛋白質膠圖。M：Marker；CDC14a 31：篩選到含有 pET30t-CDC14a 的 菌株。可以明顯在加入IPTG 表現後的內涵體 36 kDa 附近看到 CDC14a 蛋白質的表現。

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RPS10A:

我們同樣在RPS10 的反轉錄過程上，看到 positive 基因 GAPDH (500 bp)，以及 目標基因大小片段出現(498 bp，圖 28)。TA cloning 上，也成功地篩選到預期片段 (750 bp)，並建構了 pET30t-RPS10a 的表現質體(圖 29、圖 30)。蛋白質表現上也看 到了預期的片段大小 (26 kDa，圖 31)。

圖 28 RPS10A RT-PCR 結果

以Trizol 試劑破碎 MCF7 細胞後，抽取 RNA，再反轉錄為 cDNA 後，以各個不同基因引子做聚合酶 反應的結果。圖表中M：Marker；N：聚合酶反應控制組，未加入 cDNA；PBF：以 PBF 引子做聚合 酶反應結果；Ku70：以 Ku70 引子做聚合酶反應結果。TBX3：以 TBX3 引子做聚合酶反應結果。RPS10：

以RPS10A 引子做聚合酶反應結果。PCAF：以 PCAF 引子做聚合酶反應結果。BCL2：以 BCL2 引 子做聚合酶反應結果。GAPDH：以 GAPDH 引子做聚合酶反應結果，此為 Positive control。紅色框 框為RPS10A 引子成功夾出的預期片段，500 bp。

圖 29 pET30t-RPS10A 質體

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以TA cloning 的方式將 RT-PCR 夾出的 RPS10A 片段連結到 pET30a 質體後的質體圖。圖中 RPS10A 即為表現的基因片段位置，pET30t 表示 pET30a 質體經由酶切處理後的質體。

圖 30 RPS10A TA cloning 結果。

成功黏合後的pET30t-PP2A 質體轉殖到大腸桿菌，以聚合酶反應做篩選所挑的菌落。反應中，我們

採用不同的primer 配對來確認質體的正確性。圖中 M：Marker；1 號：兩端皆為 T7 引子；2 號：5’

端為T7，3’端為 RPS10A；3 號：5’端為 RPS10A 引子，3’端為 T7；4 號：兩端皆為 RPS10A 引子。

A16 與 B11 表示挑選到的菌株編號。預期位置：1 號：900 bp；2 號：750 bp；3 號：700 bp；4 號：

500 bp。

圖 31 RPS10A 蛋白質表現－上清液與內涵體

以 1 mM IPTG 表現 pET30t-RPS10A-A16 菌株 16 小時後，破菌離心取上清液 (Supernatant)與內涵 體 (Pellet)個別觀察蛋白質表現的蛋白質膠圖。M：Marker；左圖為上清液，右圖為內涵體。加入 IPTG 後，培養16 小時。可以明顯在加入 IPTG 表現後的上清液與內涵體 26 kDa 附近 (紅色框框)看到 RPS10A 蛋白質的表現，然而內涵體表現量遠勝過上清液。

Supernatant Pellet

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酵素酶切 cloning 結果：

BCL2A1 是請廠商為我合成的序列片段。我們請廠商在序列 5’端與 3’端各別加 上EcoRI 與 XhoI 的切位，以便利用酵素酶切方式，將 BCL2A1 切下，黏合到表現 質體pET30a 中。我們成功地建立了 pET30t-BCL2A1 的表現質體，酵素酶切結果中 也看到BCL2A1 與切除成功的 pET30a 質體，各別為 500 bp 與 5400 bp (圖 32、圖 33)。

TA cloning 也成功篩選到我們要的片段大小 (650 bp，圖 34)。蛋白質表現也看到預 期片段(26 kDa，圖 35)。

BCL2A1:

圖 32 pET30t-BCL2A1 質體

以酵素酶切的方式將BCL2A1 片段連結到 pET30a 質體後的質體圖。圖中 BCL2A1 即為表現的基因 片段位置，pET30t 表示 pET30a 質體經由酶切處理後的質體。

40 圖 33 EcoR I 與 Xho I 酵素酶切結果

以EcoR I 與 Xho I 切除 pET30a 質體與位接於 pUC57 上的 BCL2A1 基因。M：Marker；N：pET30a 質體；EcoR I：以 EcoR I 切除 pET30a；EcoR I + Xho I：以 EcoR I 與 Xho I 切除 pET30a 質體。BCL2A1：

以EcoR I + Xho I 切除位於 pUC57 上的 BCL2A1 片段。紅色箭頭個別表示 pET30a (5400 bp)切除成 功與BCL2A1 (500 bp)切除後的片段大小位置。

以EcoR I + Xho I 切除位於 pUC57 上的 BCL2A1 片段。紅色箭頭個別表示 pET30a (5400 bp)切除成 功與BCL2A1 (500 bp)切除後的片段大小位置。