5-1 各基因與蛋白質純度、序列之分析
我們所建構的蛋白質中，以TA cloning 方式建構的有六株：各別為 CDC14a、
CDC20、PP2A、Histone 4j 與 RPS10；以酵素酶切建構的則為 BCL2A1。TA cloning 技術的優點在於速度，只需設計好引子，確認讀框是否正確，即可再做完聚合酶連
在基因定序方面，TA cloning 中，有發現序列突變的有三株：各別為 CDC14a、
Histone 4j 與 CDC20。CDC14a 為第 215 序列上，GAA 突變為 GAG。Histone 4j 是 基因序列第47 位置，GTT 突變為 GCT，後續胺基酸序列則是 A 突變為 V。CDC20 擁有兩個突變點：序列第861 與 1423，各別為 TC 突變與 AT 突變。這兩個突 變造成後續胺基酸的轉繹上，308 後上的 QL，525 LM。CDC14a 雖有突變，然 而在後續轉繹的蛋白質序列中，並未引響其胺基酸序列C 的轉變，判定為 silent mutationt。Histone 4j 與 CDC20 共同有的 TC 突變，是 Taq DNA 合成酶發生突變 頻率最高的[136]。我們在線上資料庫上查詢結果，Histone 4j 在此處未有任何突變 Western 的結果(圖 41)中，我們依舊可以看到 securin 與 CDC20 的交互作用，且在 其並不與磷酸化過後的securin 蛋白質反應，可以推測這兩個突變點不影響其對 securin 的功能。
TA cloning 外，另一株 BCL2A1 是以酵素酶切的方式建構。由於我們是利用雙 酵素酶切的方式：5’端以 EcoR I 做酶切，3’端以 Xho I 做酶切。因此，在做黏接的
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過程中，是不會如TA cloning 一般出現反序的情形。後續的定序上，我們也確認序 列正確，蛋白質表現也在預期的位置。
5-2 Secuirn 磷酸化的結構變化
蛋白質的後修飾對蛋白質的交互作用具有一定程度上的影響力。過去的文獻紀 載，securin 含有兩種後修飾作用，分別為磷酸化 (phosphorylation)與泛素化作用 (ubiquitination)[58]。目前已知對 securin 作用的磷酸化酵素有 Erk2、CDK1 (or CDC2) 與DNA-PK[18, 64, 67]。前人研究上，Erk2 能夠磷酸化 securin 第 165 號胺基酸 serine，
促使securin 由細胞質移動到細胞核中。CDK1 則是在細胞分裂期，將 securin 第 3、
16、66 號 threonine，與 165 號胺基酸 serine 磷酸化後，使得 securin 抑制 separase 的活性，預防細胞提早進入細胞後期。DNA-PK 目前僅知具有磷酸化 securin 的能力，
其位置目前並不清楚，而功能性可能與DNA 的修復有所相關性。泛素化作用則與
securin 蛋白質降解有關係。在細胞中，扮演 securin 泛素化的角色為細胞核分裂後 期促進複合體(anaphase promoting complex, APC)[30]。
我們向廠商購置了Erk2 酵素，在試管實驗中個別對 securin 做磷酸化。圖 38 Erk2 磷酸化securin 的結果顯示，Erk2 不僅磷酸化 securin，也可能影響了 securin 的結構 或是帶電性，造成磷酸化後的securin 有 band shift 的現象產生。而在 Mass 的鑑定上，
我們發現除了已知的第3、16、66、165、183 與 187 號胺基酸受到磷酸化外，還有
額外的11 個位置也被偵測到有磷酸化的現象。這幾號磷酸化的胺基酸序列整理如
下：
P P P P P
MATLIYVDKE NGEPGTRVVA KDGLKLGSGP SIKALDGRSQ VSTPRFGKTF DAPPALPKAT 60 P P P P P
RKALGTVNRA TEKSVKTKGP LKQKQPSFSA KKMTEKTVKA KSSVPASDDA YPEIEKFFPF 120 P P P
NPLDFESFDL PEEHQIAHLP LSGVPLMILD EERELEKLFQ LGPPSPVKMP SPPWESNLLQ 180 PP PP
SPSSILSTLD VELPPVCCDI DI 202
序列上的方框依序為KEN box (9-11)、D box (61-68)與 proline-rich(160-190)區間。
由前面的文獻我們知道，Erk2 磷酸酶辨識的序列分別為 S/TP、PXS/TP、KIM (Kinase Interacting Mortif，或 D domain，主要是由一群受到疏水性胺基酸所圍繞的鹼性胺基 酸序列)、FXF、與 FXFP。在 KEN box 附近，除 3、16 號兩個位置為已知的磷酸化 位置外，我們發現6 號也會受到 Erk2 的磷酸化。在 D box 附近，除了 D box 上 (66 號)外，71 與 74 也是可能影響其功能的胺基酸。而在 Erk2 磷酸化的序列中，有極 多數位於60 – 120 胺基酸中。securin 在此處的序列有個重要性，他擁有極多的鹼性 胺基酸，占了整個序列約32%。這段序列週遭亦符合 KIM 序列，而此段序列的重
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要性在於與DNA 的交互作用。最後，在 proline-rich 的區間，除了含有大量的 proline 胺基酸外，也有六個serine 與一個 threonine 胺基酸。其中 165、183 與 187 為已知 波長訊號減弱。根據前人所述，200 nm 訊號所代表的意義為 securin PPII (poly-proline helical like structure II)結構的穩定度[44]。securin 的結構上含有兩個 PPII 的結構，各 別位於胺基酸163 – 166，170 – 173 的位置。而 163-166 剛好位於 Erk2 磷酸化的位 質濃度，KM為所謂的Michaelis-Menten 常數 (Michaelis-Menten constant)，為二分之 一受質濃度時的反應速率值，數值越大，酵素反應效率越差，反之則越佳。在本實 驗蛋白質與蛋白質交互作用中，酵素為securin 蛋白質，而受質則為序列稀釋的蛋白 質，KM表示兩個蛋白質之間作用力強度，單位通常為M-1，但在此實驗中，我們只 能知道膜上蛋白質的總量 (莫耳數)，因此單位應為 pmole-1。n 值的意思則為協同作 用 (cooperative effect)，當 n=1 時，表示蛋白質間的作用為一對一；若是 n＞1，表 示有一個securin 分子會與多個目標蛋白鍵結。
我們以Hill plot 擬合的結果，未磷酸化的 securin 與 BCL2A1、以及磷酸化過後 的securin 與 CDC14a 兩者位有協同作用的結果外，其餘蛋白質與 securin 的交互作
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步討論。
Securin 與 RPS10a
Securin 磷酸化後，失去與 Histone 4j 的交互作用力。我們就 Histon 4j 與 securin 的功能性來做推測其意義為何。如1-5 所述，Histone 4j 主要扮演著核小體的形成與 DNA 修復的功能。核小體的形成與細胞染色體形成有所關聯，若是此功能喪失，細 胞將無法存活[84]。同時，Histone 核小體的合成是從 DNA 的複製期開始 (S 期)[137]，
這段期間securin 是維持非磷酸化的狀態，即有機會與 Histone 4j 進行交互作用，可 以推測securin 的表現或許與 Histone 4j 的合成有關。除此之外，在此次實驗上也偵 測到securin 與 RPS10a 有相似的交互作用力。前文 1-5 所述，RPS10a 為核醣體組成 次單元之一，功能為細胞蛋白質的核成。如此，細胞內Histone 4j 的生合成或許與 securin、RPS10a 有相關連。此點如同 securin 穩定 cyclin B 蛋白質，促使細胞進入 M 期[55]的功能，securin 與 RPS10a 的鍵結同時穩定合成後的 Histone 4j，直到 Histone 4j 形成整個核小體(圖 57)。而在另一種可能性上，文獻上得知 Histone 4j arginine 20 的甲基化與會促成細胞停滯在G2期，使得細胞進行DNA 修復的工作[138]。而在 1-3.4.2 所述，securin 與 Ku70 的鍵結會抑制細胞 DNA 修復的工作，再綜合 securin 是進入M 期的推手[55]，可以推測 securin 與 Histone 4j 的結合可能抑制了 Histone 4j 的修飾作用，阻止了DNA 的自我修復功能(圖 58)。
圖 57 Histone 4j 與 securin 交互作用影響細胞週期前進的假設圖
Histone 4j 與 securin、RPS10a 的共同作用，可能使染色體順利生成，促成細胞週期的前進。
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圖 58 Histone 4j 與 securin 鍵結影響 DNA 修復的可能機制圖
Securin 與 Histone 4j 鍵結，阻止了 N 端的修飾作用，如乙醯化 (Ac)、磷酸化 (P)與甲基化 (Me)，使 DNA 修補機制受到抑制。可能與前人所發表，securin 與 Ku70/Ku80 的作用，抑制 DNA 的修復機制 相輔相成[18]。
CDC20
如前文1-5 所述，CDC20 主要是負責 securin 於中期進入後期的降解反應。此時 的securin 蛋白質是經過 CDC14a 去磷酸化作用，KEN box 裸露而出，因而與 APC/CDC20 複合體相鍵結，導致 securin 的降解。而若是 securin 在 KEN box 受到 磷酸化，APC/CDC20 則失去了辨識功能，使得降解作用受阻。此點與本實驗結果 中，磷酸化的securin 喪失與 CDC20 的鍵結力一致(圖 41)。未來期許能夠進一步嘗 試將APC/CDC20 複合體也加入測量與 securin 的交互作用力。
BCL2A1
BCL2A1 與細胞的自我凋零機制有關。前文論述到，他的表現會避免細胞自我 凋零。在我們的結果中，securin 無論是有無磷酸化，與 BCL2A1 都有一定的鍵結力。
其中未磷酸化的securin 蛋白質鍵結力較高。由第一章的論述，可以將 securin 的作 用分為兩種：穩定蛋白質促使細胞週期向前 (與 cyclin B、Sp1、RPS10a)；抑制蛋 白質的作用，避免細胞自我凋零或是DNA 修復作用產生 (與 p53、ku70)。綜合所 述，securin 的表現方向可說是具有促使細胞增生的目的性存在。我們可以因此推測，
securin 與 BCL2A1 的交互作用也具有穩定其功能的存在，促使細胞週期向前。而磷 酸化則可能降低BCL2A1 的作用力，促使細胞開啟自我凋零或是 DNA 修復的功能。
PP2AB55與 CDC14a
PP2A 與 CDC14a 兩者都是去磷酸酶，然而兩者對 securin 的作用截然不同。在 我們的數據上，未磷酸化的securin 與 PP2A 的作用力 KM值為1.71×10-10pmole-1， 與CDC14a 的作用力為 4.97×10-11 pmole-1；而磷酸化後的作用力各別為5.56×10-11 pmole-1與5.39×10-11 pmole-1。當securin 磷酸化後，與 PP2A 的交互作用力上升，甚
64 們嘗試在細胞上觀察是否securin 的磷酸化會影響細胞自我凋零機制 (apoptosis)的 轉變。 DNA 交互作用[140-142]的偵測上。我們在此實驗則是利用此技術偵測 DNA 與蛋白 質的交互作用。本實驗我們以p53 與 Bax 啟動子做實驗設計。圖 59 為 p53 結構特
65 力，而securin 的磷酸化則促使 secruin 失去抑制能力，由此結果得知，securin 會抑 制p53 專一性鍵結 DNA 的功能區的功能。未來我們期望能夠探討 p53 乙醯化，是 否對DNA 鍵結與 securin 的抑制能力有所影響，並提高在此技術的應用性。
圖 59 p53 結構特性與功能[143]
圖為p53 結構功能示意圖。圖上 1 – 355 序列為 p53 專一性鍵結的位置，在 340 – 355 的序列為 p53 形成四聚體 (tetramer)的功能區，而在 355 到 393 則為 p53 非專一性 DNA 鍵結功能區。Acidic：含 大量酸性胺基酸的序列片段；core：DNA 專一性鍵結功能區；tetra：p53 形成四具體的功能區；basic：
含大量鹼性胺基酸的序列片段，DNA 非專一性鍵結功能區。
5-6 總結
總結以上，我們探討securin 與六種蛋白值得鍵結能力，可以得知 Erk2 磷酸化 securin，可能調控了各個蛋白質間機制的轉換。我們將這些結果與其功能性探討總 結為圖 60，securin 受到 Erk2 磷酸化，抑制了與 RPS10a、CDC20 與 Histone 4j 各自 的反應。而受磷酸化修飾的securin 蛋白質，皆可經由 CDC14a 或是 PP2A 兩種酵素，
回歸到未受修飾的securin 狀態。Securin 的磷酸化能夠抑制細胞 M 期姊妹染色體的 分離，而CDC14a 的去磷酸化可以使得細胞週期向前。若細胞處於間期，因 CDC14a 活性受到抑制，去磷酸化的功能轉由PP2A 執行。而在此期，securin 必須保持在未 磷酸化的狀態方能穩定參與Histone 4j、RPS10a、p53、與 BCL2A1 的反應，使細胞 週期持續向前。
EIS 的結果上，我們可以了解到 securin 與 p53 的鍵結會抑制 p53 的活性。而在
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UV 的刺激下，Erk2 會被活化，促使 securin 磷酸化而降低抑制 p53 活性的能力，促 使p53 進一步受到 Erk2 的活化，啟動下游細胞自我凋零路徑，促使細胞走向自我凋 零(圖 61)。我們在此次實驗上，僅測試了 p53 下游基因其中一段路徑。而在前人研 究上，p53 與 securin 的鍵結也會抑制 p21 與 SFN 兩種蛋白質的表現。我們未來期望 也能利用EIS 的方式，偵測類似的蛋白質與 DNA 交互作用，並且能夠將這些反應 量化，繪出另外的基因調控機制，進一步探討核酸與蛋白質之間的調控。
UV 的刺激下，Erk2 會被活化，促使 securin 磷酸化而降低抑制 p53 活性的能力，促 使p53 進一步受到 Erk2 的活化，啟動下游細胞自我凋零路徑，促使細胞走向自我凋 零(圖 61)。我們在此次實驗上，僅測試了 p53 下游基因其中一段路徑。而在前人研 究上，p53 與 securin 的鍵結也會抑制 p21 與 SFN 兩種蛋白質的表現。我們未來期望 也能利用EIS 的方式，偵測類似的蛋白質與 DNA 交互作用，並且能夠將這些反應 量化，繪出另外的基因調控機制，進一步探討核酸與蛋白質之間的調控。