細胞週期主要可分為兩部分：細胞間期 (interphase)與細胞分裂期 (M phase)，
而間期占了整個細胞期百分之九十的時間[24]。而在細胞接受生長因子調控前，大 個含有二倍體DNA 的子細胞。M 期又可細分為前期 (prophase)、中期 (metaphase)、
後期 (anaphase)與末期 (telophase)。在分裂前期，細胞的 DNA 逐步地聚集成染色體 (chromosome)，受到 cohesin 蛋白質的連接而彼此成對地配對成姐妹染色體。而此時 在接近細胞核附近，中心粒漸漸地形成中心體，並緩慢地移動到細胞核兩端。而在 細胞中期，染色體會整齊排在細胞中心，同時兩端中心體的紡錘絲會緩慢地向染色 體中心點centromere 移動。當紡錘絲觸碰到 centromere 的瞬間，即進入了分裂後期。
姐妹染色體連接蛋白質cohesin 受到 separase 的分解，同時紡錘絲逐步地將姐妹染色 體分開到細胞兩端。當姊妹染色體移動到細胞兩端，即進入了末期。此時期細胞中 隔開始形成，核膜逐步生成，染色體逐漸轉變為較低密度的染色質 (chromatid)，降 解細胞分裂時所需的蛋白質等，最後分裂為兩個子細胞。整個細胞週期的時間大約 為18-24 個小時，其中 G1期約占了6-12 小時的時間，S 期約 6-8 小時，G2期的停留
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時間則相當短，M 期通常小於 1 小時 (圖 1)[25]。
圖 1 細胞週期示意圖 [11]
細胞期可分為休息期G0，間期G1、S、G2，與M 期。調控細胞週期的行進則由不同的 Cyclin 蛋白 與CDK 蛋白所調控。
在許多細胞週期的調控蛋白質上，有兩類蛋白質在調控細胞週期行進扮演重要 角色，即為cyclin dependent kinase (CDK)與 Cyclin 蛋白質[26]。CDK 是
serine/threonine 蛋白質磷酸化酵素，其中有五種作用於細胞週期：G1 (CDK4，CDK6 與CDK2)，S (CDK2)，G2與M (CDK1)。這類蛋白質穩定存在於細胞週期中，與不 同的cyclin 蛋白質配對而受到活化[27]。在 G1 期，Cycln D 與 CDK4、CDK6 刺激 細胞合成蛋白質，當Cyclin E 與 CDK2 結合後，細胞即進入了 S 期。而在進入 S 期，
Cylin E 的角色會被 Cyclin A 取代。而在細胞 G2 後期，Cyclin A 與 CDK1 鍵結促使 細胞進入M 期。而在 M 期的各階段則是由 Cylcin B 與 CDK1 所調控(圖 1)[27]。
細胞週期中，有兩個重要的蛋白質複合體掌管著細胞週期蛋白質的調控－SCF (Skp1/Cul1/F-box complex)與 APC (Anaphase promoting complex)[28, 29]。在各個週 期的轉換，兩複合體存在著「一關一開」的關係。當M 期進入 G1期時，抑制APC 的Emi1 蛋白質受到 SCF 的降解，活化 APC 與 CDC20、Cdh1 鍵結，降解 securin、
cyclin B 等蛋白，使細胞由 M 期走向 G1期。而APC 的活化卻使得 SCF 受到抑制。
而在G1進入S 期時，APC 再度下降，SCF 活性上升降解 Cyclin E 與其他調控蛋白 p21Sik1、 p27Kip1、 p57Kip2，原先與Cyclin E 鍵結的 Cdk2 轉而與 Cyclin A 鍵結，使 細胞進入S 期。在細胞要進入 M 期， APC 活性再次升高，Cyclin A、Cyclin B 逐 步接上Cdk1，使細胞進入 M 期[29]。
而在整個細胞週期中，securin 的降解我們也可以歸納如圖 2：securin 的磷酸化
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與非磷酸化都有可能遭受到降解作用，其中降解磷酸化的securin 蛋白質為 SCF 複 合體；而降解未受磷酸化的securin 則為 APC/CDC20 與 APC/Cdh1 兩複合蛋白質[30, 31]。由前人的研究我們得知，SCF 複合體活躍時機在細胞的週期 G1、S 與 G2期；
而APC/CDC20 與 APC/Cdh1 的活性則各別在細胞分裂期的前、中期與後期、末期[29]。
Securin 在進入細胞分裂期前是未受到磷酸化的，也因此部會受到 SCF 複合體的降 解。而在其進入細胞分裂期則有部分受到了磷酸化反應。此部分受到磷酸化反應的 蛋白質參與了細胞週期行進的任務，而也因為這樣的磷酸化，使securin 不受 APC/CDC20 的降解。然而在中期要進入後期時，磷酸化後的 securin 受到 CDC14a 的作用而回復成未受磷酸化的狀態，因而遭受到APC/CDC20 與後期 APC/Cdh1 的 降解反應，使細胞週期向前。
圖 2 不同週期 SCF、APC/CDC20、APC/Cdh1 活性表與 securin 磷酸化、降解示意圖
調控細胞週期行進的兩大複合體－APC 與 SCF。兩者的活性會決定細胞週期的轉換。圖中 securin 的磷酸化修飾與未修飾會決定securin 的蛋白質是否受 APC 或 SCF 的降解。而 securin 的磷酸化會受
此基因因此被命名為Pituitary Tumor Transforming Gene 1(PTTG1)[32]。
1999 年，Zou 以人類 Esp1 蛋白質 (hEsp1 即為 separase，調控姐妹染色體)做 免疫沉澱實驗，發現兩株未知蛋白質EAP1 與 EAP2，其分子量個別為 28 kDa 與 42 kDa。前者蛋白與先前 Lin Pei 所發現的 PTTG1 序列相同，證實了 PTTG1 會與 hEsp1 結合。後續，Zou 等人在序列分析上驗證了 PTTG1 即為人類 securin[12]。
繼Lin Pei、Shlomo Melmed 與 Zou 等人之後，陸續有許多學者研究 securin 蛋白 質。2000 年，Chen 等人利用人類 PTTG cDNA 做為 probe，以 Northern blot 的技術
4 胞被發現含有大量表現的securin 蛋白質，諸如：前骨髓白血病細胞 (promyelocytic leukemia HL-60)、子宮頸癌細胞 (HeLa cell)、肺癌細胞 (A549)、肝癌細胞 (Hepatoma HepG2)、乳癌細胞 (MCF7)等[14, 33, 34]。
在securin 的調控因子方面，雌性激素 (Estrogen)是目前最著名的調控激素。
若是以雌性激素處理NIH3T3 細胞，會促使 securin 蛋白質大量表現，並使得細胞分 泌促乳激素 (prolactin)[35-37]。人體胰島素 (Insulin)是另外一個著名的調控因子[38, 39]。前人研究發現在乳癌細胞 (MCF7)加入胰島素，將使得 securin 蛋白質大量表現。
其它如鈣離子濃度[40]、表皮細胞生長因子 (Epidermal Growth receptor, EGR)[41]、
外來抗原[42]、Sp1 或 NF-Y[43]等，都有學者發現會促使 securin 蛋白質表現。這些 研究顯示，securin 的表現會促使細胞走向細胞增生與分化。
1-3. 3 人類 securin 蛋白質的結構
人類securin 蛋白質目前確認為一個無特定構型的蛋白質[44]。其含有 202 個胺 基酸，N 端與 C 端各別扮演不同角色。如圖 3 所示，securin 在 N 端含有兩個重要 的摧毀訊息：一者為D-box (序列為 RxxLxxxxN)；一者為 KEN-box (序列為
K-E-N-x-x-x-D/N)。前人研究指出，這兩個位置是「細胞核分裂後期促進複合體」
(Anaphase promoting complex, APC)辨認的位置。在細胞分裂中期，APC 會與 Cdc20 蛋白質鍵結而活化功能，辨識任何含有D-box 的蛋白質，並將之降解。而到了細胞 分裂後期，Cdc20 蛋白會被 Cdh1 蛋白取代，此時 APC 會轉而辨識任何含有 D-box (Destruction box，序列為 RXXLXXXXN，為蛋白質降解訊號)或是 KEN-box (K-E-N 三個胺基酸序列，為另一個蛋白質降解訊號)的蛋白質[30, 45]。此項機制與細胞內 separase 活性有關。separase 在細胞中扮演分離姊妹染色體的重要角色，然其活性受 到securin 的抑制。因此，當細胞要由中期進入後期時，APC 會被活化並降解 Securin 蛋白，促使細胞週期向前運行[16, 46, 47]。在 securin 蛋白質的 N 端還有一段 DNA 結合區段 (DNA binding domain)，與 C 端的轉錄因子區段 (Transactivating domain)
擁有相同功能，能夠作用於DNA 基因的啟動子，用以誘導下游基因的表現，諸如
p53、c-myc、Sp1 等[48, 49]。在 C 端方面，人類 securin 蛋白質含有兩個重要的 Proline-rich 片段，分別位於序列 163-166 (P-P-S-P)，以及 170-173 (P-S-P-P)。學者研 究發現此處序列是SH3 (Src homology binding domain 3)的結合位置。此段序列常出 現在許多與訊息傳遞相關的磷酸酶中，如Src3[50]、PI3 磷酸酶[51]或是 Ras GTPase
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除了前面所述，securin 調控姐妹染色體分離外[16, 46, 47]，也有學者們發現 到securin 在其它週期也有調控的作用。2007 年由 Melmed 率領的團隊利用 DNA 微 Francisco Romero 等人以酵母菌雙雜交 (Yeast Two-Hybrid)的技術，證明 securin 參 與了DNA 修補機制的調節作用。當細胞內 DNA 雙股螺旋產生斷裂。securin 與 Ku70 蛋白的結合力下降，因而開啟了Ku70/Ku80 DNA 雙股螺旋修補機制[18]。此表示 securin 的存在會抑制細胞 DNA 修復機制的啟動，讓細胞週期持續前進。
1-3.4.3 Securin 與細胞自我凋零
2000 年 Run 等人在人類胎盤細胞 JEG-3 大量表現 securin，發現到有 67%的 細胞會自我凋零而死亡，推測securin 與細胞自我凋零機制息息相關[56]。2002 年，
Bernal 等人以免疫沉澱法 (Immunoprecipitation, IP)篩選與 securin 共同作用的蛋白質。
他們發現到securin 會與 p53 鍵結，抑制 p53 啟動下游一連串參與自我凋零基因的轉 錄作用 (Transcription)[57]。然而也有人發現到，securin 會與 p53 基因上游的啟動子 結合，使得p53 蛋白質表現出來，造成細胞自我凋零[15, 56]。兩者調控的衝突與矛 盾或許來自於表現量的差異，Bernal 所表現的 securin 蛋白質量少於後來學者的表現 量，這也指出securin 表現量多寡與細胞機制的調控相關[58]。
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1-3.4.4 Securin 其它功能
近年的研究顯示，securin 也與血管新生 (Angiogenesis)以及腫瘤轉移 (Metastasis) 有關[59, 60]。血管新生可說是現今研究腫瘤生長相當關切的議題。腫瘤生長達到一 1)。在人類 securin 中，CDK1(或 Cdc2)會磷酸化 securin 第 165 的胺基酸 serine，激 活securin 與 separase 的鍵結，避免細胞太早進入細胞後期[64]。而在青蛙 securin 上，
第3、16、66 號的磷酸化位置，會抑制 securin 受到 APC/C 的降解作用[65]。另外，
第165、183、187 也有人指出會受到 Cdc2 的磷酸化，增加 securin 蛋白質的穩定性 [66]。
Securin 的磷酸化除了細胞週期調控外，也有研究發現 Erk2 與 DNA-PK 也都能 磷酸化securin 蛋白質[18, 67]。Erk2 磷酸化 securin 第 165 的胺基酸，促使 securin 由細胞質進入細胞核，並與下游基因的啟動子鍵結，促使細胞增生。DNA-PK 也會 磷酸化securin 蛋白質，然而目前僅推測此磷酸化的舉動與 DNA 的修復有關聯性，
實際的磷酸化位置與功能性仍待研究。
磷酸化位置 磷酸化酵素 重要性
3 (Threnine) Cdc2 穩定securin 16 (Threonine) Cdc2 穩定securin 66 (Threonine) Cdc2 穩定securin 165 (Serine) Cdc2/Erk2 姊妹染色體分離 183 (Serine) GSK-3 穩定securin 187 (Serine) CKII 穩定securin
表 1 Securin 磷酸化位置與其對應之磷酸化酵素、功能性整理表
綜合上面所述，我們可以統整securin 會與以下蛋白質有所交互作用：Cyclin B、
CDC20、CDC14a、PP2A、p53、DnaJ、RPS10a 與 separase 蛋白質。以下，我們就 本實驗所建構的蛋白質做進一步的介紹。
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1-5 與 Securin 交互作用的蛋白質介紹 RPS10a
RPS10a，全名為 Ribosomal S10，為核醣體 40S 蛋白質組成單位之一[68]。過去 的研究中指出，RPS10 參與了細胞增生[69-72]、分化[73]、與自我凋零機制[74]。而 RPS10a 被認為是啟動核醣體合成蛋白質的重要次單元[75]。RPS10a 於 1999 年發現 會與securin 有所交互作用[63]。目前僅推測 RPS10a 與 securin 作用功能為促進人體 精細胞的發育，然至現今並未有其他學者證明這件事。現階段不清楚securin 與 RPS10a 交互作用所影響的機制為何。
PP2A 與 CDC14a
PP2A 與 CDC14a 是兩種不同的去磷酸酶。PP2A 是 serine/threonine 去磷酸酶，
主要由三個次單元構成，分別為scaffolding protein (65 kDa)，catalytic subunit (36 kDa) 與數種不同的substrate subunit[76]。Scaffolding prtoein 如同支架一般，支撐整個 PP2A 酵素的蛋白質。Catalytic subuint 則是酵素催化中心。而 substrate subunit 則使得 PP2A 具有辨識不同受質的能力(圖 4)，而其中 B55、B55為文獻記載上，與 securin 有 所交互作用的次單元[31]。PP2A 在細胞週期調控，細胞增生與訊息傳遞上扮演著相 當重要的角色[77-79]。CDC14a 是一個 tyrosine 去磷酸酶，結構上分為兩塊區塊：A 區塊位於N 端，目的為與受值做專一性的鍵結；B 區塊位於 C 端，是主要的酵素催 化中心[80]。在 C 端含有一段出核訊息 (Nuclear export signal, NES)，使得 CDC14a 能夠進出核孔(圖 5)。CDC14a 蛋白質功能主要是調控細胞週期。CDC14a 在細胞進
主要由三個次單元構成，分別為scaffolding protein (65 kDa)，catalytic subunit (36 kDa) 與數種不同的substrate subunit[76]。Scaffolding prtoein 如同支架一般，支撐整個 PP2A 酵素的蛋白質。Catalytic subuint 則是酵素催化中心。而 substrate subunit 則使得 PP2A 具有辨識不同受質的能力(圖 4)，而其中 B55、B55為文獻記載上，與 securin 有 所交互作用的次單元[31]。PP2A 在細胞週期調控，細胞增生與訊息傳遞上扮演著相 當重要的角色[77-79]。CDC14a 是一個 tyrosine 去磷酸酶，結構上分為兩塊區塊：A 區塊位於N 端，目的為與受值做專一性的鍵結；B 區塊位於 C 端，是主要的酵素催 化中心[80]。在 C 端含有一段出核訊息 (Nuclear export signal, NES)，使得 CDC14a 能夠進出核孔(圖 5)。CDC14a 蛋白質功能主要是調控細胞週期。CDC14a 在細胞進