本論文所使用之菌株及質體請見表一、四，實驗所設計之引子序列請見附錄一、
二，實驗材料部分(培養基、實驗試劑及溶液、藥品之成分配方)見附錄。本研究所 使用的青枯病菌皆為從-80℃冰箱劃菌到 TTC 培養基上(如果為本實驗所構築之菌 株，則需添加抗生素，詳見表一、四)，在 28℃的培養箱培養兩天之菌株。本研究 所使用的植物為青枯病感病品系番茄 (Solanum esculentum) L390，菸草 Nicotiana tabacum Wisconsin 38 (W38) 和 Nicotiana benthamiana。
在第一部分 RSc0411 研究中所用的野生型菌株為存在於台灣本土番茄中所分 離 出 的 Pss190 菌 種 ， RSc0411 突 變 株 為 其 利 用 EZ::TN™ ＜ KAN-2 ＞ Tnp Transposome™ kit (Epicentre)所製作產生的。而第二部分 murI 研究中所用的野生型 菌株為存在於台灣本土番茄中所分離出的 Pss4 菌種。murI 突變株為其利用 Transposome TM kit (Epicentre)在 Pss190 背景下所製作產生，之後再利用 DNA 自 然轉型法所構築的Pss4 isogenic 突變株。
入150 µL sulutionⅢ，輕輕混合均勻後，以 13000 rpm 離心 10 分鐘後，取上清液至 新的微量離心管，加入4℃等體積的 phenol/chioroform/isoamylalcohol (25:24:1)，PCI 分兩層，上為水層，下為有機層，取下層的PCI 混合均勻，以 13000 rpm 離心 10 3-1 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR)
PCR 試劑是利用 Taq polymerase 配合 10X Taq polymerase buffer 進行實驗。依 下表分別加入反應物，先以 94 denature ℃ 5 分鐘後，再以 94 denature 30℃ 秒；55 ℃ annealing 30 秒 (此步驟依照每對 primer 之 melting temperature 不同而加以增減)，
72 elongation (1 kb℃ 大小的目標基因約1 分鐘，此步驟時間依照 PCR product 的大
Total 20 µL 3-2 DNA 純化
將 PCR product 利用 Gel/PCR DNA fragments extraction kits (gene maker) 做 純化。在PCR product 中加入等體積之 binding buffer 和 10 µL Silica Matrix，混合 均勻後，以13000 rpm 離心 1 分鐘，將上清液去之 (只留下約 20 µL 之上清液)，將 下層的Silica Matrix 放入 spin column 中，再以 13000 rpm 離心 1 分鐘，加入 wash buffer (含 ethanol)，以 13000 rpm 離心 5 分鐘，徹底清除 column 中的 wash buffer，
加入無菌的無菌去離子水回溶column 上的 DNA，再以 13000 rpm 離心 3 分鐘後，
即可得到純化之DNA 產物。
3-3 限制酶 (restriction enzyme) 的消化水解 (digestion)
各取約 5 µg 載體 (vector) 與純化過後的目標基因 PCR 產物，加入 0.5 µL 的限
利用low copy 的載體 pUFR047 (抗 Amp、Gen) 來為本實驗中跳躍子插壞的 突變株構築互補株，murI 突變株的互補構築是在 Pss4 background，RSc0411 突變 株的互補構築是在Pss190 background，此外，RSc0411 突變株也進行其他細菌的同 源基因 (ortholog) 互補，包括 Cupriavidus taiwanensis (Ct)、Ralstonia metallidurans (Rme)、 Ralstonia eutropha H16 (Reu)、Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv)、Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc)、Escherichia coli (E coli)，所有進 行互補實驗的引子都列在附錄一、二。
4-2 構築 lacZ transcriptional fusions
利用medium copy 的載體 pCZ962 (含有一個 promoterless lacZ reporter gene，
抗 Tet)，將目標基因 start codon 往前推 500 bp，來構築 lacZ transcriptional fusions 以進行promoter activity 實驗分析，本實驗都是利用青枯病菌 Pss190 的 genomic DNA 構築。此實驗所使用的引子都列在附錄一、二。
取2 µL 質體 DNA 和 150 µL 青枯病菌勝任細胞置於 1.5 mL 微量離心管中， 菌液至微量離心管，加入5% 的 STOP solution (95% ethanol、5% phenol)，在 4℃
下以6000 rpm 離心 10 分鐘，去上清液，加入 200 µL TE buffer 和 2 µL的lysozyme (0.1 mg/µL)，充分混合均勻後，靜置 5 分鐘，加入 700 µL RLT buffer (含 7 µL β-mercaptoethanol)，充分混合均勻後，以 13000 rpm 離心 5 分鐘，將上清液小心移 至新的微量離心管，再加入 500 µL 的 100% ethanol，輕搖混合後，將其移至 QIAshredder spin column，以 13000 rpm 離心 1 分鐘，加入 350 µL RW1 buffer 到 column，再以 13000 rpm 離心 1 分鐘，然後小心的在 column 上加入 70 µL的RDD buffer 和 10 µL 的 DNAse，靜置 1hr 後，加入 350 µL 的 RW1 buffer 清洗 RNeasy spin column，以 13000 rpm 離心 1 分鐘後，加入 500 µL RPE buffer 清洗兩次，離心後 去除RPE buffer，再以 13000 rpm 離心 2 分鐘去除 column 中殘餘的酒精，將清洗
後的RNeasy spin column 置入新的微量離心管，加入 20 µL DEPC 水，以 13000 rpm 10x reverse transcription buffer、4 µL 的 MgCl2 (25 mM)、0.4 µL 的 AMV reverse transcriptase (15U/µL)及 0.4 µL recombinant RNasin ribonuclease inhibitor，最後補水 至總體積20 µL 後，置於 42 /1.5℃ 小時，再將整個反應95℃，加熱 5 分鐘，之後 置於冰上5 分鐘，停止反應，補 DEPC 水至總體積 100 µL，將 cDNA 冰-20℃備用。
7-4 即時定量 RT-RCR
使用Bio-Rad Real-Time PCR Detection Systems，cDNA 取 5 µL (約 500
ng/µL )，9 µL SYBR Green Supermix，0.5 µL 的 forward primer (10 µM) ，0.5 µL 的 reverse primer (10 µM)，補無菌去離子水至總體積為 18 µL，混合均勻後放入 Real-Time PCR Detection 反應器中進行反應，再經 iQ5 軟體分析。
8. 生理特性分析 8-1 生長曲線
挑單一菌落到523 液體培養基 200 rpm 震盪培養 16 小時，利用分光光度計
(HITACHIU-3200) 測量其吸光值 OD600，取100 µL 的 OD600＝0.3 (菌量大約為 3×108 CFU/mL 的菌液點在 CPG、CPG+0.01％SDS、M9、SM1 固體培養基上，放在 28℃
的培養箱養兩天，拍照觀察其生長是否有異。
8-3 青枯病菌在植物體內增生能力分析
挑單一菌落至523 液體培養基，於 28℃以 200 rpm 震盪培養 16 小時，利用分 光光度計 (HITACHIU-3200) 測量其吸光值 OD600，將菌液調到OD600＝0.3，以針 筒打入菸草 Nicotiana benthamiana (Nb) 的葉肉組織中，在菌液進入植物組織後的 0hr 和 24hr 分別以打洞器取含菌液植物組織，將待測植株組織放入封口袋中秤重， 分光光度計(HITACHIU-3200)測量其吸光值 OD600，將菌液調到濃度OD600＝0.3。
將待測的逆境化學物(如：過氧化氫、抗生素 polymycin B)加入 523 營養豐富或 MP 營養貧瘠液體培養基中，再做一系列的兩倍系列稀釋，各取含有不同濃度化學物 的523 或 MP 液體培養基 2 mL 放入試管中，並保留一管未加任何化學物之純液體 培養基當做對照組，將50 µL OD600＝0.3 之菌液加入各試管中，於 28℃轉速 200 rpm 的培養箱中震盪培養，523 培養基於 16 小時後取出，MP 培養基於 30 小時後取出，
菌液利用分光光度計(HITACHIU-3200)測量其吸光值 OD600，並紀錄比較之。
8-5 細菌碳源、氮源 (BiologTM) 和API-Zym酵素的分析
挑單一菌落培養在TTC固體培養基上，放在28℃的培養箱培養一天，用 BiologTM 商業套組中所附的培養液GN Inoculating Fluid (Biolog catalog # 72101)
將次培養之菌洗下，並分別取150 µL OD600＝0.3的含菌培養液加入GN2 MicroPlate (Biolog catalog # 1101)的每一個孔洞中，放在28℃的培養箱養一天，利用ELISA reader (Beckman Culter AD340)測量其吸光值OD570，紀錄其菌液濃度，以分析此菌 的碳源利用。APIZym酵素測試是使用商業套組(bioMerieux Vitek, St Louis, MO, USA)來進行實驗，首先取OD600＝1的菌液加入APIZym kit的待測酵素孔洞中，靜 置培養於28 4hr℃ 後，再待測孔洞中滴一滴A試劑，再滴一滴B試劑，靜置30分鐘，
以無菌濾紙吸去phosphotungstenic acid，靜置一段時間待 carbon-coated copper grid 乾燥後，即可用穿透式電子顯微鏡(Hitachi H-7650)觀察青枯病菌的細胞型態。
9. 青枯病菌致病力相關能力之分析
9-1 游動能力的測試【Swimming motility (Liu et al., 2005) and Twitching motility】
挑單一菌落培養在TTC 固體培養基上 16 小時，用無菌去離子水將培養基上的 菌洗下來，利用分光光度計(HITACHIU-3200)測量其吸光值 OD600，取1 µL OD600 ＝ 1 的菌液滴在 0.3％的洋菜膠培養基上(含 1% 的 tryptone)，放於 28℃的培養箱中培 養48 小時，拍照並記錄其 swimming motility 游動半徑。挑單一菌落培養在 CP 固 體培養基(1% peptone,0.1% casein hydrolysate,0.5% glucose)上，在培養 18、24、28 小時時利用解剖顯微鏡觀察其單一菌落的twitching motility 型態。
9-2 番茄根部的附著力測試 (Jofre et al., 2004)
將感病品種L390 的番茄種子放入無菌水中，以轉速 80 rpm 震盪兩天，再將 發根的番茄種子移到鋪有一層3M 濾紙的 15 公分培養盤上，加少許無菌去離子水 保持種子濕潤，並且外套一層鋁箔紙，置於暗室培養兩天。取於28 200 rpm℃ 震 盪培養16 小時的菌液，利用分光光度計 (HITACHIU-3200) 測量其吸光值 OD600，
取400 µL OD600＝0.3 的菌液稀釋一百倍，將稀釋後 40 mL 的菌液倒入直徑 16 公分 中的菌液混和均勻，利用ELISA reader (Beckman Culter AD340) 測量其吸光值 OD570，紀錄其菌液濃度。再將孔內的菌液吸出，加入200 µL 的無菌水將孔壁洗過，
再加入200 µL 1％的結晶紫染色十分鐘，吸出結晶紫後，用 200 µL 的無菌水將孔 壁洗過，再加入200 µL 1％ SDS 充分混和均勻，將管壁上結晶紫染的生物膜洗下，
利用ELISA reader (Beckman Culter AD340)測量其吸光值 OD570，紀錄其生物膜形 成能力。
9-4 胞外酵素 (Exoenzyme activity) 的分析 (Liu et al., 2005; Valls et al., 2006) 挑單一菌落至523液體培養基，於28℃以200 rpm震盪培養16小時，利用分光光 度計(HITACHIU-3200)測量其吸光值OD600，取1 µL OD600＝1 的菌液分別點在含有 不同胞外酵素的固體培養基上，放在28℃的培養箱養兩天。兩天後將培養基取出 作染色分析，加入2 N HCl 去分析分別含有胞外酵素pectin methylesterase (Pme)和 polygalactouronase (Peh)的培養基，計算酵素分解暈環的半徑大小。至於分析含有
光光度計(HITACHIU-3200)測量其吸光值值 OD600，將菌液調到濃度OD600＝0.3。
將菌液以針筒打入菸草Wisconsin 38 (W38)的葉肉組織中，24 小時後，觀察其反應 並照相紀錄之。本實驗也將菌液以針筒打入菸草 N. benthamiana 的葉肉組織中，並 於24、72 小時觀察其反應並照相紀錄之。
2-Mercaptoethanol，10％ glycerol，1 M Tris PH=6.8），充分混合均勻後，放入 100℃ acid 及 40% ethanol 及 5% acetic acid)，氧化作用五分鐘，倒出過碘酸氧化溶液後，
以50 mL 二次水清洗膠體三次，每次以 80 rpm 震盪清洗 15 分鐘，清洗完後，加
11. β-galactosidase activity assay (Miller,1972)
挑單一菌落至523 液體培養基，於 28℃以 200 rpm 震盪培養 16 小時，利用分 光光度計(HITACHIU-3200)測量其吸光值 OD600，將菌液調到濃度OD600＝0.1。取 2 mL OD600＝0.1 的菌換到 MP 液體培養基中，於 28℃以 200 rpm 震盪培養 5 小時 後，取1.5 mL 的菌以 13000 rpm 離心後，去除上清液，加入 1500 µL Z buffer，充 分混合均勻，取750 µL 利用分光光度計(HITACHIU-3200)測量其吸光值 OD600，紀 錄菌液生長濃度。將剩下的750 µL Z buffer 移到新的微量離心管中，加入 100 µL 的chloroform 和 50 µL 0.1% SDS，充分震盪均勻 10 秒後，放入 28℃乾浴槽作用 5
分鐘，加入150 µL 的 ONPG 開始進行反應，紀錄其開始時間 t0，等其變成黃色後，
加入375 µL 的 1 M Na2CO3並置於冰上停止其反應，紀錄其結束時間tf。將微量離 心管以13000 rpm 離心 10 分鐘後，取其上清液，利用分光光度計(HITACHIU-3200) 測量其吸光值OD550和OD420，並利用下列公式計算其β-galactosidase activity。