第三章 結果
Ⅰ. RSc0411 基因之功能分析
為了解 RSc0411 基因之功能，本論文利用 NCBI 資料庫做此蛋白質胺基酸序列 比對，發現RSc0411 屬於未知功能的 DUF1239 蛋白群，DUF1239 蛋白大都分佈在 微生物，尤其廣泛分佈在細菌中(附錄三)。目前屬於此蛋白群的 E. coli LptC 已知 為膜蛋白，且參與 LPS 的生合成與運送。將 RSc0411 胺基酸序列利用電腦軟體 TMHMM-2.0 比對，可預測其蛋白 N 端有一 transmembrane domain，表示其為一個 膜蛋白(附錄四)。 RSc0411 突變株和野生型菌株以針筒直接注入於菸草 N. benthamiana 葉肉組織中，
於0 與 24 小時取菸草組織測植物體內青枯病菌菌量。如圖三所示，RSc0411 突變 株和野生型菌株在菸草 N. benthamiana 內增生能力無明顯差異。由此可以確認 RSc0411 突變株並非是因為生長能力有問題，而造成其致病力降低。 檢測LPS 及膜完整性）及 tyrophricin（可用來檢測膜完整性）之抗性，發現野生型
菌株在tyrothricin 逆境下最小抑制濃度為 1.25 ppm，但 RSc0411 突變株最小抑制濃 動能力分為swimming 和 twitching，其中 swimming 為測試細菌在水中的游動力，
因此利用0.3% agar 培養基來模擬在水中的環境，twitching 則是測試細菌在固體上 的泳動能力，所以利用1.5% agar 模擬細菌在固體上的泳動力。青枯病菌野生型菌 株Pss190 和其 RSc0411 突變株在 0.3% agar 上皆沒有 swimming 能力(圖五)，但兩 者皆有twitching 能力(圖六)。
3-2. 番茄根部的附著力測試
本實驗將測試青枯病菌 RSc0411 突變株附著於番茄根部的能力是否降低而影
本論文利用菸草Wisconsin 38 (W38)和 N. benthamiana 來測試 RSc0411 突變株 的第三型分泌系統是否有所缺失，由實驗結果(圖九)可知，W38 在注入青枯病菌野 生型菌株 24 小時後即有過敏性反應的產生，但是 RSc0411 突變株喪失誘導菸草 W38 產生過敏性反應。N. benthamiana 在注入野生型菌株 24 小時後並無任何反應，
但在72 小時後發現葉片有組織壞死(necrosis)產生，但是 RSc0411 突變株只有黃化 現象(chlorosis)。
莖部)的菌量皆到達 108CFU/g 以上。但 RSc0411 突變株卻只有在根的上、下部測 們利用自然轉型(natural transformation)的方法(Bertolla et al., 1997)將跳躍子置換到 另一台灣本土野生型青枯病菌Pss4 (phylotype I strain)，分析是否有如同 Pss190 背 景下的 RSc0411 突變株所發現的 phenotype。由實驗結果(圖二)可知 Pss4 背景下的 RSc0411 突變株在含多種抗生素的 SM1 培養基與外加 SDS 的 CPG 培養基上有明 Pss4 的 RSc0411 互補到 Pss190 背景下 RSc0411 突變株中，發現在此突變株中表達 單獨野生型 RSc0411 即可回復在幾種與細胞結構相關的逆境固體培養基之正常生 長(圖二)和生物膜形成的能力及番茄的根部附著能力(圖七、八)，並且完全恢復在 番茄上之致病力、誘導菸草W38 產生 HR 反應之能力(圖九)和誘導 N. benthamiana 72 小時後產生組織壞死(necrosis)。
5、判定青枯病菌 RSc0409~RSc0413 之操縱子 (operon) 結構
依照基因組已經定序完全的 GMI1000 基因組資訊，在 RSc0411 之前後有數個 轉錄相同方向的未知功能基因群，然而，這些基因是組成單獨或數個操縱子 (operon) 則尚未知。為了解 RSc0411 基因與附近之基因的組成結構與調控，本論文 將利用promoter assay 研究策略，在野生青枯病菌菌株中判定 RSc0409~RSc0413 之
操縱子結構。由實驗結果(圖十一)可知在對數生長期時 RSc0411 和 RSc0413 基因前 端有強烈的啟動子，RSc0409~RSc0411 為一操縱子，而 RSc0412~RSc0413 為另一 個操縱子。
6、青枯病菌脂多醣的測定
青枯病菌的 RSc0411 與參與大腸桿菌 LPS biogenesis 的 LptC 同屬於 DUF1239 家族，但胺基酸序列的相似度卻不高（identity 18%，similarity 35%）(圖十二)。因 此，進一步測試青枯病菌之 RSc0411 基因是否參與調控 LPS biogenesis。由實驗結 果(圖十三)可知與野生型菌株相比，RSc0411 突變株的粗型脂多醣(R-LPS)明顯降 comparative functional study。由於青枯病菌 RSc0411 基因產物隸屬於功能未知的 DUF1239 蛋白家族，且獨特並廣泛分布於細菌中，為分析 DUF1239 蛋白家族之可 能功能，我們比較在各種細菌中與DUF1239 homologues 相關之操縱子結構(operon organization)及基因成員之異同。由圖十四可知除了 RSc0412 (kdsC 或 ybrI) 在 Ralstonia metallidurans CH34 (Rme)、Ralstonia eutropha H16 (Reu)及 Cupriavidus taiwanensis (Ct)中找不到對應的同源基因外，RSc0411 附近之基因的組成與其他細 菌皆相似，其中 RSc0413、RSc0412 對應大腸桿菌的 LPS 生合成基因 kdsD、kdsC (Meredith and Woodard 2003; Wu and Woodard 2003)，而 RSc0410、RSc0409 對應大 腸桿菌的 LPS 運送基因 lptA、lptB。在青枯病菌中 RSc0408、RSc0409、RSc0412 和 RSc0413 的序列與其他細菌所對應的同源基因相似度高(similarity 至少達 60%)，
而 RSc0410 和 RSc0411 的序列只與 R. metallidurans CH34 (Rme)、R. eutropha H16
(Reu)及 C. taiwanensis (Ct)有高度相似性(similarity 達 70%)，和其他細菌所對應的 同源基因相似性低(similarity 低於 50%)。
此外，由表三可知，青枯病菌 lipid A 生合成蛋白群的序列與其他細菌所對應 的同源基因相似度極高(similarity 至少達 50%)，但其核心多醣(core)生合成蛋白群 的序列只有RfaF 和 WaaG 與親緣相近之細菌(Rme、Reu、Ct)相似度較高，其他蛋 白與其所對應的同源基因相似度都極低。青枯病菌協助運送LPS 的蛋白群中，除 了LptB 和 MsbA (ABC tranaporter)蛋白在所有細菌中序列相似度高達 60%外，其 他蛋白與其親緣相近之細菌(Rme、Reu、Ct)相似度達 60%以上，但與其他親緣關 係較遠的細菌(Xcv、Ecc、E. coli)相似度則幾乎低於 50%。青枯病菌 O-antigen 連接 蛋白與其他細菌所對應的同源基因相似度都極低。
8、同源基因互補株的構築與分析
由於 RSc0411 屬於未知功能蛋白 DUF1239 家族，本研究分析源自其他生物 DUF1239 之功能是否與青枯病菌 RSc0411 具相同功能。根據資料庫序列資料，設 計適合之引子(附錄一)，以 PCR 擴增出各種生物中之 DUF1239 基因全長序列，利 用低拷貝數之泛寄主質體pUFR047 當作載體，將之送入青枯病菌 RSc0411 突變株，
構築互補株。所得之互補株將依據上述之各種青枯病菌特性測試，以判斷源自不 同生物之DUF1239 基因之功能及特性是否與青枯病 RSc0411 類似，藉以初步推斷 這些基因之可能功能。本實驗用來進行互補試驗的DUF1239 基因序列將分別分離 自 E. coli、Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria (Xcv)、Erwinia carotovora subsp.
Carotovora (Ecc)、Ralstonia metallidurans CH34 (Rme)、Ralstonia eutropha H16 (Reu) 及 Cupriavidus taiwanensis (Ct)。將上述菌種的同源基因與青枯病菌的 RSc0411 做 胺基酸序列比對，明顯的分為兩群，一群是和RSc0411 有高度的相似性(Rme、Reu、
Ct)，另一群則與 RSc0411 相似度低 (Xcv、Ecc、E. coli)。由實驗結果(圖二)可知，
互補胺基酸相似度高的菌種 Rme、Reu、Ct 可以回復 RSc0411 突變株在 SM1 培養 基上之正常生長、誘導菸草W38 產生 HR 反應之能力及誘導 N. benthamiana 72 小
時後產生組織壞死 (necrosis)，但互補胺基酸相似度低的菌種 Xcv、Ecc、E. coli 則 重要調控基因 hrpG 突變株當作對照組，以定量 RT-PCR 比較野生株 Pss190、RSc0411 突變株的第三型分泌系統相關基因之（hrpB、hrpY、 popA 與 popC）RNA 表現量 是否有降低。由實驗結果(圖十五)可知 RSc0411 突變株 hrpB、hrpY、popA、popC 基 因的RNA 表現量明顯比野生型菌株降低許多，而對照組 hrpG 突變株的這些基因 RNA 表現量亦明顯下降，由此推測 RSc0411 可能參與青枯病菌的第三型分泌系 統，調控第三型分泌系統基因 hrpB、hrpY、popA、popC，其中 hrpB 為目前研究 青枯病菌第三型分泌系統主要調控者 hrpG 的下游基因。我們推測 RSc0411 可能位 於三種位置，其一位於調控者 hrpG 的上方，可以調控 hrpG，其二位於 hrpG 和 hrpB 之間，其三可能是藉由其他非 hrpG 的調控路徑直接或間接調控 hrpB，進而影響第 三型分泌系統。
為了進一步的確認 RSc0411 在第三型分泌系統途徑的正確位置，本研究使用 promoter assay 的方式分析，由實驗結果(圖十六)可知利用質體 pCZ962 當作載體將 RSc0411 的啟動子放入野生型菌株 Pss190 中可以強烈的啟動 LacZ 活性，但是將 RSc0411 的啟動子放入 hrpG 突變株中，LacZ 活性明顯下降，因此推測 RSc0411 受到HrpG 的調控，直接或間接調控 hrpB 而影響青枯病菌致病力，至於詳細的調 控機制及蛋白間的交互作用，目前仍未知。另外，本研究使用promoter assay 的方 式探討 RSc0411 與青枯病菌致病網中調控因子 phcA 間的關係，由實驗結果(圖十 六)可知利用質體 pCZ962 當作載體將 RSc0411 的啟動子放入野生型菌株 Pss190 中 可以強烈的啟動LacZ 活性，但是將 RSc0411 的啟動子放入 phcA 突變株中，LacZ
活性明顯下降，因此推測 RSc0411 受到 PhcA 的調控。
10、青枯病菌其他突變株的型態與致病能力分析
為了確認是否因為 RSc0411 的 LPS 生合成降低而造成對番茄的致病力下降及 喪失誘導菸草產生HR 反應之能力，本研究分析青枯病菌 LPS 生合成基因 rfaF 突 變株的各種致病能力及產生 HR 反應之能力。rfaF 突變株在含多種抗生素的 SM1 培養基與外加SDS 的 CPG 培養基上皆有明顯的生長抑制，進一步利用 MIC 檢測 SM1 所含的抗生素 polymyxin B 及 tyrophricin，發現在營養豐富液體培養基中，野 生型菌株與 rfaF 突變株在 tyrothricin 逆境下最小抑制濃度皆為 1.25 ppm。在 polymyxin B 逆境下，野生型菌株最小抑制濃度為 800 ppm，但 rfaF 突變株最小抑 制濃度只有12.5 ppm (表二)。由實驗結果(圖七、八)可知在生物膜形成及番茄根部 的附著能力沒有顯著的差異，並且沒有喪失誘導菸草W38 產生 HR 反應之能力，
但在感染 N. benthamiana 72 小時後只呈現黃化病徵(圖九)。可見 RSc0411 並非因為 LPS 生合成降低而造成對番茄的致病力嚴重下降及喪失誘導菸草產生 HR 反應之 能力。
此外，本研究為了測試 RSc0411 突變株是否因為細胞膜完整性有所缺陷而造 成喪失誘導菸草產生HR 反應之能力，首先將幾個可能膜完整性有所缺失的青枯病 菌突變株 RSc0411、RSc1206、rfaF，利用其在營養貧濟液體培養基中的MIC 檢測 tyrothricin 之抗性，確定這些突變株的 MIC 皆小於野生型菌株為膜完整性有所缺失 的菌株(圖十七)。再利用這些突變株測試菸草 HR 反應(圖十七)，發現除了 RSc0411 突變株外，其他突變株皆有HR 反應，可知並非因為細胞膜完整性有所缺陷而造成 喪失誘導菸草HR 反應。