murI 基因的相關研究

MurI 蛋白為 glutamate racemase，可以將 L-glutamate 催化轉變成 D-glutamate，

而D-glutamate 是組成細菌細胞壁肽聚醣的重要成分，可以保護細菌的細胞壁免受 細胞的蛋白質酶攻擊，尤其革蘭氏陽性菌細胞壁有一層較厚的肽聚醣層，因此需 要更多的D-glutamate。但若細菌形成過量的 D-glutamate 則會造成自身毒害，所以 維持細菌中glutamate 的代謝與平衡是非常重要的(Ho et al., 1995)。MurI 蛋白質的 結構在細菌中可以dimer 形式存在(如: Helicobacter pylori)，或是以 monomer 形式 存在(如:E. coli)。目前 glutamate racemase 酵素相關的研究大多專注於測定酵素的 活性與其蛋白質結構分析，及其DNA gyrase inhibitor 的活性研究。目前已知 murI 基因被跳躍子插壞後，會影響青枯病菌對番茄和阿拉伯芥的致病力(Lin et al., 2008)，但是 murI 基因在致病力所扮演的角色仍然未知，這也是本篇論文欲探討的 重要主題。

許多的革蘭氏陽性菌(尤其是 Bacillus 屬)和一種古生菌 Natrialba 及一種真核微 生物 Cnidaria 可以形成 Poly-γ-glutamate (PGA)，由 D-glutamate 和 L-glutamate 組 成的 PGA 可以幫助細菌在高鹽環境中生存，也影響細菌毒力因子(Candela and Fouet, 2006)。若 glutamate 量減少，則細菌的 PGA 較少，會造成其生物膜的形成 下降，但不會影響其生長能力及游動力(swimming motility) (Chagneau and Saier 2004)。D-glutamate 和 L-glutamate 是細菌生存的必需胺基酸，它們參與細菌正常 生理代謝、細胞分裂和細胞壁的組成。D-glutamate 的生合成可由兩種路徑產生，

其一是由D-amino acid transaminase 催化 D-alanine 和 α-ketoglutarate 轉氨基後產生 D-glutamate，其二是由 glutamate racemase 直接催化 L-glutamate 形成 D-glutamate (Pucci et al., 1995; Fotheringham et al., 1998)。由目前的研究顯示有些細菌只找到一 種可以形成D-glutamate 的酵素，如在 E. coli、Lactobacillus 和 Pediococcus 屬中只 有glutamate racemase 酵素，但有些細菌如 Staphylococcus spp. 和 Bacillus sphaericus 同時有此兩種酵素在催化形成D-glutamate (Pucci et al., 1995; Fotheringham et al., 1998) 。 在 E. coli 中 ， glutamate racemase 的 活 性 是 由 肽 聚 醣 前 趨 物 UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanine (UDP-MurNAc-L-Ala) 所 調 控 ， MurI 需 要 UDP-MurNAc-L-Ala 活化才可以將 L-glutamate 催化成 D-glutamate (Doublet et al., 1994)，UDP-MurNAc-L-Ala 可以辨認 E. coli 中 N 端的 21 個胺基酸(其他革蘭氏陽 性菌中無此21 個胺基酸)並活化其酵素(Ho et al., 1995)。由研究顯示細菌的 MurI 若為 dimer 結構，則不須 UDP-MurNAc-L-Ala 活化即可有活性(Lundqvist etal., 2007)。細菌細胞壁肽聚醣的生合成需經過許多步驟。在大腸桿菌中 D-glutamate 是肽聚醣結構中一個特別的成分，其添加到 UDP-MurNAc-L-Ala 中後，經由酵素 MurD 催化形成 UDP-MurNAc-L-Ala-D-Glu，再經由酵素 MurE 和 MurF 催化形成 UDP-MurNAc-pentapeptide，最後形成肽聚醣(附錄十) (Doublet et al., 1994)。在大腸 桿菌中若 murI 條件突變，可發現其細胞分裂受到影響，而有細胞成絲狀延長的現 象。若過量表現 MurI 則會造成核酸分離異常和細胞的增生被抑制(Baliko and Venetianer , 1993)。

目前研究顯示glutamate racemase 不只參與 glutamate 的代謝，也同時為 DNA gyrase inhibitor，參與細胞分裂時 DNA processing。DNA gyrase (DNA topoisomerase II)為 DNA processing 中最重要酵素之一，利用消耗 ATP 催化 negative supercoiling DNA 和催化 DNAs decatenation。目前已知的 DNA processing 蛋白(如: GyrI)幾乎皆 有序列保守的DNA-binding motifs，但 MurI 卻沒有 DNA-binding motifs (Ashiuchi et al., 2002)。原核生物的 DNA gyrase 可以被許多的抗生素辨認結合，這些抗生素抑

制子主要可以分為三群，第一群抑制子(如:coumarins 和 cyclothialidines)主要干擾 ATP 的水解而抑制 supercoiling 的活性，第二群抑制子(如:合成的 quinolones)可以 干擾酵素和 DNA 的共價中間產物形成，最近發現第三群抑制子(如: E. coli 的 GyrI、Mycobacterium sp.的 MfpA 及 M. tuberculosis 的 MurI)是利用干擾 DNA gyrase 和DNA 結合而成功抑制 DNA gyrase (Ashiuchi et al., 2002; Sengupta et al., 2006)，

其中 M. tuberculosis 的 MurI 可以結合到 DNA gyrase (有兩個 GyrA 和兩個 GyrB) 的 GyrA 構造中，使其無法再和 DNA 結合，而成功抑制其活性(Sengupta et al., 2006)，維持細菌體內的平衡。在大腸桿菌中的 glutamate racemase 需要肽聚醣前趨 物UDP-MurNAc-L-Ala 調控才有 DNA gyrase 抑制子的活性(Ashiuchi et al., 2002)。

Glutamate racemase 與其他的胺基酸 racemase 不同，此酵素不需任何的輔酶(如:

pyridoxal-phosphate; PLP)，並且與其他的胺基酸 racemase 沒有序列相似的區段，

比起其他需要輔酶PLP 的胺基酸 racemase 此酵素的催化能力較低(Yoshimura et al., 1993)。比較不同生物中 glutamate racemase 的序列同源基因，發現除了在微生物 外，在其他不需要合成肽聚醣的生物如:植物、人類也都有此基因，但此基因產物 失去glutamate racemase 的功能(Ashiuchi et al., 2002)。但在最近的研究報導中指 出，人類癌症中有glutamate racemase 同源基因大量表現，造成細胞分裂時有不正 常的DNA 複製產生(Ashiuchi et al., 2002)，相信未來有許多研究將找尋 glutamate racemase 的相似物，以調控 DNA topoisomerases，以期可以做為癌症藥物。

Ⅶ、研究目標 用跳躍子(Tn5)策略篩選致病力降低的青枯病菌突變株(Lin et al., 2008)，其中兩株

突變株在番茄和阿拉伯芥的致病力都大大降低，而在其基因體中因Tn5 插入而被 影響的基因，便可能是參與青枯病菌致病力之關鍵基因。經序列比對分析發現，

被Tn5 插入者為未知功能之基因 RSc0411（其基因產物被分類於 DUF1239 基因家 族中）與 RSc1956 (murI)，本研究目的為探討這兩個青枯病菌新穎致病關鍵基因在 致病力及其他功能上扮演之具體角色及其參與的致病途徑。本研究先由目前已知 的青枯病菌所需的致病能力 (如：游動能力，生物膜的形成能力，EPS 的產生，分 泌破壞植物細胞壁的酵素系統type II secretion system，Hrp 製造的第三型分泌系統 等)先作分析，再依每個基因可能參與的致病機制更深一步去研究其扮演的角色及 功能。